石小峰沈福良張 強(qiáng)于園園張作法呂國(guó)英*

（1. 嘉興市潛福食品有限公司，浙江 嘉興314050；2. 嘉興市潛鑫食品有限公司，浙江 嘉興314050；3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，杭州 310021）

蛹蟲草原生質(zhì)體60CO輻射誘變選育高產(chǎn)多糖菌株的實(shí)驗(yàn)

石小峰1沈福良1張 強(qiáng)2于園園2張作法3呂國(guó)英3*

（1. 嘉興市潛福食品有限公司，浙江 嘉興314050；2. 嘉興市潛鑫食品有限公司，浙江 嘉興314050；3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，杭州 310021）

蛹蟲草；原生質(zhì)體；輻射誘變；多糖

蛹蟲草Codyceps militaris （L.） Link，又稱北冬蟲夏草，是蟲草的模式菌種。蛹蟲草的功效成分和藥效，與野生冬蟲夏草相似［1，2］，可以作為野生冬蟲夏草的有效替代品。蛹蟲草含有多種活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗感染等多種藥理活性。蟲草多糖是一類高分子復(fù)合物，為蟲草的主要活性成分之一，是蟲草中含量最高的藥理活性物質(zhì)［3］。蟲草多糖主要存在于菌絲體中，研究提高菌絲體中多糖含量具有重要意義。

原生質(zhì)體技術(shù)是通過(guò)制備具有生物全能性的原生質(zhì)體，并結(jié)合誘變、雜交、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)培育變異新類型的生物技術(shù)［4］。輻射育種有著常規(guī)育種和雜交育種不可替代的特殊效應(yīng)，通過(guò)輻射誘發(fā)突變不僅可以改良品種，而且可以創(chuàng)造新的種質(zhì)資源。原生質(zhì)體60Co輻射誘變技術(shù)以其周期短、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)被廣泛采用。

我們通過(guò)對(duì)蛹蟲草的原生質(zhì)的60Co輻射誘變，選育出多糖含量高的優(yōu)質(zhì)菌株。進(jìn)一步開發(fā)利用蛹蟲草創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為蛹蟲草M，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所食用菌實(shí)驗(yàn)室保存。溶壁酶，購(gòu)自廣東省微生物研究所。蝸牛消化腺干粉，由嘉興市潛福食品有限公司提供。葡萄糖、苯酚、硫酸、硫酸鎂等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%；液體培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯20%，葡萄糖2%；再生培養(yǎng)基（g/L）：在PDA培養(yǎng)基中添加蝸牛消化腺干粉20 g，MgSO4·7H2O 147.9 g。

1.3 方法

（1）菌絲培養(yǎng)。菌株的活化及擴(kuò)大培養(yǎng)，將冷藏的PDA斜面菌種轉(zhuǎn)接到平板中，放置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8天，然后轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5～6天，再連同培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)移至勻漿器中，并加入一定量的液體培養(yǎng)基，勻漿后分裝至預(yù)先裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，25 ℃靜置培養(yǎng)3 d備用。

（2）原生質(zhì)體制備與再生。0.2 g 溶壁酶溶于10 mL 0.6 mol/L的硫酸鎂溶液中，經(jīng)0.2 μm細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，制成酶液。過(guò)濾并收集液體培養(yǎng)的菌絲，用無(wú)菌水沖洗后再用無(wú)菌吸水紙吸干菌絲水分，將菌絲轉(zhuǎn)移到酶液中，輕微振蕩使其均勻分散，置于30 ℃、60 r/min 搖床中酶解3 h。用G-2 砂芯漏斗過(guò)濾除去酶解液中的殘留菌絲，將收集的濾液在4 ℃、3 000 r/min 條件下離心10 min，棄上清，沉淀，用0.6 mol/L 的硫酸鎂洗滌2～3次即得到純化的原生質(zhì)體。

（3）60Co輻射誘變處理。將原生質(zhì)體稀釋至適當(dāng)濃度用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，吸取200 μL經(jīng)稀釋的原生質(zhì)體懸液用不同60Co輻射劑量（30 Gy，50 Gy，100 Gy，150 Gy）分別處理30 min。

（4）變異菌株篩選。吸取100 μL誘變后的原生質(zhì)體懸液于再生培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻，25 ℃倒置培養(yǎng)7～10天可見再生菌落。挑選出一部分單菌落和部分雜交菌落，接種至PDA固體斜面培養(yǎng)基上。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7天。觀察菌絲體生長(zhǎng)狀況，并與未誘變的對(duì)照組進(jìn)行比較。挑選出一部分與對(duì)照組有差異的菌株，接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液的多糖含量。

（5）多糖測(cè)定。發(fā)酵液多糖含量的測(cè)定采用以下公式：發(fā)酵液總多糖含量—發(fā)酵液還原糖含量=胞外多糖含量。多糖測(cè)量方法采用苯酚-硫酸法，還原糖的測(cè)定采用DNS法。

2　結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體形態(tài)

取適量原生質(zhì)體置于40倍光鏡下進(jìn)行鏡檢，觀察形態(tài)。圖1中呈現(xiàn)黑點(diǎn)且四周透明的即為蛹蟲草原生質(zhì)體。還有一部分呈現(xiàn)條狀的為未酶解的菌絲體。

圖1 蛹蟲草原生質(zhì)體形態(tài)

2.2 誘變后再生菌株的生長(zhǎng)情況

從再生培養(yǎng)基上挑選出一部分單菌落接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后觀察菌株的生長(zhǎng)情況和菌絲形態(tài)。結(jié)果（圖2）為：部分單菌落生長(zhǎng)明顯快于其他菌株，且有部分菌株的菌絲體外形與其他組有顯著的不同。

圖260Co輻照誘變1周后各菌落生長(zhǎng)情況

表1 篩選的菌株胞外多糖含量

2.3 胞外多糖含量

將菌絲體形態(tài)和長(zhǎng)勢(shì)與對(duì)照組明顯不同的菌株接種于50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25 ℃恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)5～7天，隨后過(guò)濾菌絲體，測(cè)定干重，清液用于測(cè)量胞外多糖。結(jié)果（表1）可以看出，挑選的20株菌株中，多糖含量提高的有8株，其正突變率達(dá)40%；其中，13號(hào)菌株胞外多糖含量最高，為195.48 mg/g菌絲，比對(duì)照提高了46.2%。

3 討 論

微生物菌種選育是建立在遺傳和變異基礎(chǔ)上的，一個(gè)菌種的生物合成物的產(chǎn)量和質(zhì)量取決于該菌種內(nèi)部遺傳基因的結(jié)構(gòu)和功能。通過(guò)改變微生物遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)就能影響其生物合成產(chǎn)物，包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、合成能力，以及產(chǎn)物的活性等［5］。而后通過(guò)一定的手段，從眾多的變異菌株中篩選出產(chǎn)量高，性狀優(yōu)良的突變株，進(jìn)一步研究測(cè)試其最佳生長(zhǎng)溫度和培養(yǎng)基成分等。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)60Co輻照誘變，成功獲得了幾株蛹蟲草誘變新菌株，與出發(fā)菌株相比，其胞外多糖產(chǎn)量提高很多。原因可能為經(jīng)過(guò)電離輻射后，出發(fā)菌株內(nèi)部遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，如DNA序列的改變，或者DNA上堿基對(duì)的變化等，其生物合成能力提高所致，這其中可能是編碼某個(gè)酶的序列的改變，或是合成多糖的編碼單位增加而使其活性增加。

本實(shí)驗(yàn)所獲得的研究成果為以后的蛹蟲草新品種培育提供了有益的參考，也為蛹蟲草在食品藥品方面的應(yīng)用提供了可以借鑒的觀點(diǎn)，有益于改善蛹蟲草的產(chǎn)業(yè)前景。

［1］ Li SP，Yang FQ，Tsim KW. Quality control of Cordyceps sinensis， a valued traditional Chinese medicine［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2006， 41: 1571- 1584.

［2］ 王建芳， 楊春清. 蛹蟲草有效成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中藥研究進(jìn)展， 2005， 22（ 5） : 30-32.

［3］ Jong SL， Jeong SK， Dong PW， et a1. Study on macrophage activation and structural characteristics of purified polysaccharide from the liquid culture broth of Cordyceps millitaris［J］. Carbohydrate Polymers， 2010， 82: 982-988.

［4］ 田豐偉， 程傳榮， 袁維涵， 等. 原生質(zhì)體誘變選育ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌株［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2010， 37（10）: 1457-1461.

［5］ 施巧琴， 吳松剛. 工業(yè)微生物育種學(xué)［M］. 北京：科學(xué)出版社， 2009.

S646

A

2095-0934（2015）06-371-03

嘉興市南湖區(qū)項(xiàng)目（2014QN06）；浙江省食用菌育種專項(xiàng)（2012C12911）

呂國(guó)英，博士，浙江省農(nóng)科院副研究員，主要從事食藥用菌研究工作，E-mail：bdzlgy@sohu.com