亢春雨，于宏偉，郭潤芳，賈英民，姚振宇

（1.河北農業(yè)大學食品科技學院河北保定071001；2.河北科技大學生物科學與工程學院河北石家莊050018）

食源性單增李斯特氏菌Lm319的毒力基因在四種肉湯培養(yǎng)基中表達分析

亢春雨1，于宏偉1，郭潤芳1，賈英民2，*，姚振宇1

（1.河北農業(yè)大學食品科技學院河北保定071001；2.河北科技大學生物科學與工程學院河北石家莊050018）

為了探明食源性單增李斯特菌的毒力基因在四種不同天然肉湯中的表達情況，了解食源性單增李斯特菌在不同肉類食品中的毒力水平。對單增李斯特菌Lm319中27個毒力基因進行PCR檢測，并對Lm319在豬、雞、牛和羊四種肉湯培養(yǎng)條件下27個毒力基因的表達情況進行RT-PCR檢測。結果顯示：單增李斯特菌Lm319中含有23個毒力基因；豬肉湯培養(yǎng)基中能表達的毒力基因種類以及基因表達量都是最高的，其次是羊肉肉湯培養(yǎng)基和牛肉肉湯培養(yǎng)基，而雞肉肉湯培養(yǎng)基中表達的基因最少；同時發(fā)現(xiàn)iap、fbp、hpt和bsh這4個毒力基因的表達與prfA基因存在相關性。本研究表明，單增李斯特菌在不同生長環(huán)境下其毒力基因表達存在較大差異。

食源性單核增生性李斯特氏菌，毒力基因，肉湯培養(yǎng)基，基因表達

單核細胞增生性李斯特氏菌（Listeria moncytogenes，Lm）是一種重要的食源性病原菌，主要會引起成人敗血癥和新生兒腦膜炎等疾病，死亡率可達20%～30%［1-2］。該菌分布范圍極廣，環(huán)境耐受性較強［3］。國外因食源性單增李斯特菌造成的疾病和死亡人數(shù)在食源性疾病中占有非常突出的地位［4-5］。

國內有關單增李斯特菌對食品污染調查的報道較多，彭俊（2014）發(fā)現(xiàn)昆明市西山區(qū)生肉中單增李斯特菌的檢出率均為5.00%，居各類食品之首［6］；劉翔［7］、烏日娜［8］、靳曉燕等［9］也有類似報道，表明生肉對單增李斯特菌是易感的優(yōu)良宿主。而隨著我國居民物資生活水平的提高，肉類食品占日常食品的比重日益加大，因此對人們身體健康的潛在危險性也越來越大。

Lm是典型的胞內寄生菌，其對寄主感染過程的每個階段都需特定的毒力因子參與［10］。白帆通過對單增李斯特菌弱毒株和強毒株主要毒力因子的表達水平檢測，發(fā)現(xiàn)弱毒株可能與LLO、PC-PLC等膜裂解因子的高表達從而導致毒力下降［11］。魏麗通過構建單增李斯特菌inlB基因缺失株，發(fā)現(xiàn)inlB基因的表達對單增李斯特菌的毒力具有一定的調控作用［12］。但是關于單增李斯特菌的毒力基因在不同宿主中的表達情況的研究尚不多見。

本研究以食源性單核增生李斯特氏菌野生菌株（Lm319）為材料。采用PCR方法對四大類27個毒力基因進行檢測，采用RT-PCR方法對27個毒力基因在豬、雞、牛、羊四種肉湯中的表達情況進行研究，旨在掌握該菌在不同肉湯培養(yǎng)基中的毒力基因表達情況，為該病原菌的食品安全監(jiān)控提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

單核細胞增生性李斯特氏菌標準菌株EGD和ScottA由美國康奈爾大學Martin教授惠贈；單核細胞增生性李斯特氏菌標準菌株10403s 由浙江大學方維煥教授惠贈；以上標準菌株用于實驗菌株的鑒定以及毒力基因PCR檢測引物的設計參考；食源性單核增生李斯特氏菌野生菌株（Lm319） 本實驗室鑒定、保存；TSA-YE及TSB-YE培養(yǎng)基北京陸橋技術有限責任公司；溶菌酶（50000U/mg）和蛋白酶K（大于30U/mg，20mg/mL）德國Sigma公司；SYBR qPCR Mix日本TOYOBO公司；2×Es Taq Master Mix、Super RT cDNA Kit、Ultrapure RNA Kit和DNA Marker DL2000康為世紀有限公司；PCR引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；生豬肉、生雞肉、生牛肉、生羊肉購自保定市惠友超市。

T-Gradient Thermocycler 96型PCR儀德國Biometra公司；CFX96型熒光定量PCR儀美國BIORAD公司；BINTA 2020D型凝膠成像系統(tǒng)英國UVIT EC公司。

1.2實驗方法

1.2.1單增李斯特菌的活化挑取單增李斯特菌菌株（Lm319）一環(huán)接種于TSB-YE液體培養(yǎng)基，200r/min，37℃培養(yǎng)12h。

1.2.2四種肉湯培養(yǎng)基制作分別取四種生鮮肉，盡量剔除其中的脂肪和結締組織，按固液比4∶10的比例與蒸餾水混合，經高速組織搗碎機（4000r/min，5min）勻漿處理，用紗布過濾，濾液100mL裝入三角瓶，121℃15min滅菌。

1.2.3四種肉湯培養(yǎng)基中單增李斯特菌的培養(yǎng)無菌操作下取活化的單增李斯特菌（Lm319）接種于各肉湯培養(yǎng)基中，接種量為0.2%，200r/min，37℃培養(yǎng)12h。以備DNA、RAN提取操作。

1.2.4單增李斯特菌基因組DNA的提取取1mL菌懸液于1.5mL離心管中，10000r/min離心2min；收集菌體沉淀用1000μL水洗兩次，吹打混勻，8000r/min離心5min；再加入250μL溶菌酶（20mg/mL），37℃水浴2h，然后加入2μL蛋白酶K，50℃水浴1h；加入200μL Tris-EDTA和20μL 10%的SDS，37℃放置10min，再加入66μL 5mol/L的NaCl溶液，12000r/min離心10min，取上清加入等體積V（酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）=25∶24∶1的混合液抽提，12000r/min離心10min；重復苯酚/氯仿/異戊醇抽提1次；取上清，加入1∶10體積NaAc和2倍體積冰無水乙醇，12000r/min離心5min，風干，適量TE溶解備用。

1.2.5單增李斯特菌基因組RNA的提取參照RNA提取試劑盒（康為世紀有限公司）說明書進行。

1.2.6毒力基因的引物設計與合成根據(jù)GenBank上已公布的27個毒力基因序列，利用DNAMAN和Primer Premier 5.0軟件，設計出各自的引物序列，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。所有引物都在標準菌株中進行PCR驗證，具體引物見表1。

1.2.7cDNA第一條鏈合成反應體系（總體積20μL）：dNTP Mix 4μL，Primer Mix 2μL，RNA Template 3μL；5×RT Buffer 4μL，Super RT 1μL，Rnase free water 6μL；振蕩混勻，42℃孵育40min，85℃孵育5min，反應結束，短暫離心，置于-20℃冰箱備用。

1.2.8PCR反應條件PCR反應體系（總體積20μL）：滅菌水7μL，2×Es Taq Master Mix 10μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，模板DNA 1μL。

擴增各基因片段的PCR反應程序分別為：預變性94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃30s（30個循環(huán)）；72℃5min。每組實驗設3個重復。

1.2.9RT-qPCR反應反應體系（總體積20μL）：SYBR qPCR Mix（2×）10μL，正、反向引物（10μmol·L-1）各1μL，cDNA模板2μL，RNase free water 6μL。

反應程序：95℃，3min；95℃，15s；50℃，20s；72℃，30s；共40個循環(huán)；72℃實時檢測熒光信號；55～95℃每隔0.05s升溫0.5℃并實時檢測融解曲線，50℃，20s；72℃，30s；50℃，30s反應結束。每組實驗內參基因和目的基因均設3個重復。

1.2.10數(shù)據(jù)處理對單增李斯特菌Lm319在TSBYE培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后取菌液提取總RNA并反轉錄合成cDNA，并對主要毒力基因進行RT-qPCR檢測。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進行相對定量分析，以羊肉湯培養(yǎng)基處理樣品為對照，以gyrB基因為內參基因。計算公式如下：

△Ct（第1批處理樣品）=目的基因Ct均值-內參基因Ct均值；

△△Ct=△Ct（第n批處理樣品）-△Ct（羊肉湯培養(yǎng)基處理樣品）；

2-△△Ct代表第n批樣品中毒力基因的對羊肉湯培養(yǎng)基處理樣品相應毒力基因的表達量的倍數(shù)。

2　結果與分析

2.1單增李斯特菌Lm319毒力基因的PCR檢測

提取單增李斯特菌Lm319的總基因組并采用特異引物對其27個毒力基因進行PCR檢測，27個毒力基因的PCR產物電泳圖見圖1。

圖1顯示，單增李斯特菌Lm319中除了inlD、inlE、inlF和plcA這4個毒力基因沒有顯示出明顯的目的條帶外，其余的23個毒力基因都有明顯的電泳條帶，表明單增李斯特菌Lm319中明確含有iap、inlB、inlA、inlC、inlG、prfA、plcB、mpl、actA、ami、fbp、hpt、bsh、gadA、hfq、inlC2、virR、mprF、dltA、dltB、dltC、dltD和hlyA這23個毒力基因。

表1　毒力基因的引物序列與目的擴增產物大小Table 1　Oligonucleotide primer sequences for amplification of virulence-associated genes of L.monocytogenes isolates

圖1　菌株Lm319中27個毒力基因PCR檢測電泳圖Fig.1　Agarose（1.0%）gel electrophoresis of PCR products of twenty-seven virulence genes of Lm 319

Lm的致病性與其毒力基因密切相關，其感染過程包括內化、逃避液泡、吞噬、肌動纖維聚集和細胞傳播等階段，且每個階段都需特定的毒力因子參與［10］。內化素基因（inl）為最早鑒定毒力基因，與單增李斯特菌對宿主細胞的侵襲力和致病性相關，為Lm穿越動物腸道上皮和胎盤屏障所必需［13］。fbp編碼的纖連蛋白結合蛋白A（FbpA）以及actA編碼的肌動蛋白聚集因子（ActA）也協(xié)同參與了細菌的侵襲［14-15］；hlyA基因編碼的溶血素（LLO）［16-17］以及plcA和plcB基因編碼的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶（PI-PLC）和卵磷脂酶（PC-PLC）具有細胞裂解作用，有助于Lm逃離吞噬小體［18-19］；hpt編碼的己糖磷酸鹽轉運蛋白（Hpt）有助于菌體利用細胞質中的營養(yǎng)成分進行增殖［20］。iap基因編碼細胞壁水解酶（p60）是介導Lm侵襲入宿主細胞時，為該菌進行細胞分裂所必需，有助于Lm黏附于宿主細胞表面［21］。ami基因編碼的酰胺酶（Ami）除裂解Lm細胞壁外，還可以通過其細胞壁錨定區(qū)使細菌黏附至靶細胞表面［22］。此外，prfA、virR、hfq這三個基因是Lm中重要的調控基因，參與體內毒力基因的表達和調控［23-26］。

通過對單增李斯特菌Lm319基因組中常見的27個毒力基因的PCR檢測結果表明，該菌株中含有23個毒力基因，說明該菌株中毒力基因種類較豐富，是進行單增李斯特菌毒理機制研究較為理想的菌株。

2.2四種肉湯培養(yǎng)基中單增李斯特菌Lm319毒力基因RT-PCR檢測

對接種單增李斯特菌Lm319的豬肉湯在200r/min，37℃下培養(yǎng)12h，提取李斯特菌總RNA，然后采用RTPCR方法對其中的27個毒力基因進行檢測，結果見圖2。

圖2　豬肉湯培養(yǎng)基中Lm319中27個毒力基因的RT-PCR檢測結果Fig.2　Agarose（1.0%）gel electrophoresis of RT-PCR products of twenty-seven virulence genes of Lm 319 from the pork broth

圖2顯示豬肉湯中檢測到iap、inlB、prfA、fbp、hpt、bsh、hfq、mprF、dltB、dltC 10個毒力基因的電泳條帶，表明這10個毒力基因在豬肉湯培養(yǎng)條件下得到了表達，而其余的13個基因從電泳圖譜中未發(fā)現(xiàn)明顯條帶，表明未表達或表達的量極少，未檢測到。其中iap、inlB、fbp、hfq和dltC這5個基因電泳條帶清晰、明亮。

對雞肉湯中Lm319的RT-PCR檢測結果見圖3。

圖3　雞肉湯培養(yǎng)基中Lm319中27個毒力基因的RT-PCR檢測結果Fig.3　Agarose（1.0%）gel electrophoresis of RT-PCR products of twenty-seven virulence genes of Lm 319 from the chicken broth

圖3顯示在雞肉湯中只獲得了inlA、inlB和mpl共3個毒力基因的電泳條帶，表明在雞肉湯中這3個基因獲得了明顯的表達。

對牛肉湯中Lm319的RT-PCR檢測結果見圖4。

圖4顯示在牛肉湯中獲得了mpl、hfq、mprF、dltB、 dltC和dltD共6個毒力基因的電泳條帶，表明在牛肉湯中這6個基因獲得了明顯的表達。其中mpl基因條帶清晰、亮度高，表明該基因在牛肉湯中獲得了高表達。

對牛肉湯中Lm319的RT-PCR檢測結果見圖4。

圖4　牛肉湯培養(yǎng)基中Lm319中27個毒力基因的RT-PCR檢測結果Fig.4　Agarose（1.0%）gel electrophoresis of RT-PCR products of twenty-seven virulence genes of Lm 319 from the beef broth

圖5　羊肉湯培養(yǎng)基中Lm319中27個毒力基因的RT-PCR檢測結果Fig.5　Agarose（1.0%）gel electrophoresis of RT-PCR products of twenty-seven virulence genes of Lm 319 from the mutton broth

圖5顯示在羊肉湯中獲得了inlB、mpl、hfq、dltB、dltC和dltD共6個毒力基因的電泳條帶，表明在羊肉湯中這6個基因獲得了明顯的表達。其中hfq基因條帶較寬且非常明亮，甚至超過了DNA Marker條帶的亮度和寬度，表明該基因在羊肉湯中表達的量很大。

為了直觀的比較單增李斯特菌Lm319的27個毒力基因在四種肉湯中的表達情況，對其進行了列表統(tǒng)計，見表2。

表2顯示，豬肉湯中毒力基因表達的數(shù)目最多，共有10個毒力基因有明顯表達，并且發(fā)現(xiàn)電泳條帶相對較明顯，條帶明亮，表明相應的毒力基因的表達量較多；雞肉湯中表達的毒力基因數(shù)目最少，只檢測到3個表達的毒力基因且條帶不夠清晰，表明相應的毒力基因表達量較少；牛肉湯和羊肉湯中表達的毒力基因情況最為接近，都檢測到了6個毒力基因，并且表達的毒力基因種類基本相同。

比較發(fā)現(xiàn)hfq、dltB和dltC三個基因在豬肉湯、牛肉湯和羊肉湯種都表達了，但在雞肉湯中沒有檢測到；而mpl基因在雞肉湯、牛肉湯和羊肉湯中都有表達，但在豬肉湯中未檢測到；對于內化素基因inlB在豬肉湯、雞肉湯和羊肉湯中有較明顯的條帶；而dltB和dltC在豬肉湯、牛肉湯和羊肉湯中都有表達，但在雞肉湯中沒有發(fā)現(xiàn)dlt基因。本研究顯示在豬肉湯中有prfA基因表達，也檢測到iap、fbp、hpt和bsh四個基因的表達，而在其他三種肉湯中，沒有檢測到prfA基因表達，同樣也沒有檢測到iap、fbp、hpt和bsh這四個基因的表達。表明iap、fbp、hpt和bsh這4個基因的表達與prfA基因存在相關性。已有研究表明prfA基因是重要的毒力調控因子，Lm中的大多數(shù)重要毒力基因都受其調控［23-24］。而本研究中iap、fbp、hpt和bsh 4個毒力基因是否受prfA基因調控，尚需進一步研究證實。

2.3四種肉湯培養(yǎng)基中單增李斯特菌Lm319毒力基因定量測定

為了更客觀地反映單增李斯特菌在四種肉湯培養(yǎng)基中毒力基因的表達量的差別，對定性檢測實驗中在四種肉湯培養(yǎng)基中檢出頻率較高的inlB、hfq和 dltC 3個毒力基因采用實時熒光定量PCR檢測。這4個毒力基因的表達情況見圖6。

表2　毒力基因在四種肉湯中的表達情況比較Table 2　The comparison of virulence gene expression in four kinds of broth

圖6　Lm319中3個毒力基因在四種肉湯培養(yǎng)基中的定量表達Fig.6　The quantitative expression of three virulence genes in four kind of broth medium

圖6顯示，對于inlB基因，在雞肉湯培養(yǎng)基中表達量最大，豬肉湯中次之，但兩者相差不大，分別為羊肉湯中表達量的2.93倍和2.70倍，inlB基因在牛肉湯培養(yǎng)基中沒有檢測到明顯的熒光信號；對于hfq和dltC基因，圖6可明顯看出豬肉湯中表達量最大，羊肉湯中表達量次之，在牛肉湯中表達量更小，而在雞肉湯中未檢測到。

通過對單增李斯特菌毒力基因在四種肉湯培養(yǎng)基中的表達情況的研究顯示：無論是毒力基因的種類、數(shù)目，還是毒力基因的表達量都有明顯差異，表明生長的環(huán)境條件對于單增李斯特菌毒力基因表達有較大影響。

以豬、雞、牛和羊這四種日常生活中最常見的動物性材料制作的肉湯為培養(yǎng)基，其中沒有加其他任何成分，目的就是模擬真實的肉制品中單增李斯特菌的污染情況，更能客觀的反映肉類食品中單增李斯特菌污染所產生的致病效果，對于肉制品中單增李斯特菌的的安全監(jiān)測具有實際指導意義。

3　結論

通過對單增李斯特菌Lm319中的27個毒力基因在豬、雞、牛、羊四種肉湯培養(yǎng)基中表達情況研究發(fā)現(xiàn)：豬肉湯培養(yǎng)基中無論是毒力基因表達的種類還是基因表達量都是最高的，其次是羊肉湯中和牛肉湯中，而雞肉湯中能表達的毒力基因最少，表明生長環(huán)境條件對單增李斯特菌毒力基因表達有較大影響；同時發(fā)現(xiàn)iap、fbp、hpt和bsh這4個毒力基因的表達水平與prfA基因存在相關性。

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Study on the virulence gene expression of foodborne Listeria monocytogenes（Lm319）in four kinds of broth

KANG Chun-yu1，YU Hong-wei1，GUO Run-fang1，JIA Ying-min2，*，YAO Zhen-yu1
（1.College of Food Science and Technology，Agriculture University of Hebei，Baoding 071001，China；2.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

In order to know the virulence gene expression of foodborne Listeria monocytogenes in four kinds of broth，to reveal the toxicity levels of Listeria monocytogenes in different kinds of meat products.The PCR was employed to investigate 27 virulence genes in the Listeria monocytogenes strain Lm319.The expression level of 27 virulence genes in four kinds of broth was carried out by using RT-PCR.The results showed that a total of 23 virulence genes were detected in Listeria monocytogenes strain Lm319.As for the expression of virulence gene，both the number of virulence gene and the magnitude of gene expression were the highest in pork broth，followed by mutton broth，then beef broth.The number of virulence genes which could express was the least in chicken broth.It also found that the expression level of iap，fbp，hpt and bsh related to prfA.This study indicated there was a big difference in the expression level of virulence gene when the Listeria monocytogenes grew in different environment.

Listeria monocytogenes；virulence genes；broth；gene expression

TS201.3

A

1002-0306（2015）14-0229-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.039

2014－11－18

亢春雨（1972-），男，博士研究生，講師，研究方向：食品微生物與食品安全。

賈英民（1961-），男，博士，教授，研究方向：食品微生物。

河北省自然科學基金（C2006000514）。