張信聰 魏淑珍

皮毛企業(yè)重金屬污染調(diào)查及Cr還原菌還原能力的測(cè)定

張信聰 魏淑珍

本文通過(guò)對(duì)棗強(qiáng)、辛集皮毛企業(yè)周圍土壤重金屬污染狀況調(diào)查，了解了皮毛企業(yè)重金屬污染的現(xiàn)狀及原因。通過(guò)對(duì)篩選到的Cr還原菌YGD8還原能力的測(cè)定，以期為重金屬Cr污染土壤及其他環(huán)境重金屬污染生物修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)豐富了微生物細(xì)胞表面展示技術(shù)基因工程菌菌種資源。

皮毛加工過(guò)程中要排放含Cr的廢水，重金屬Cr在環(huán)境中不容易還原。重金屬污染很難自然清除，常采用的物理、生物、化學(xué)等手段進(jìn)行修復(fù)。生物修復(fù)包括微生物修復(fù)、動(dòng)物修復(fù)、植物修復(fù)。微生物修復(fù)是利用微生物對(duì)重金屬的沉淀、吸收、氧化還原等作用來(lái)降低其毒性。微生物活動(dòng)通過(guò)影響植物根系分泌吸收進(jìn)而影響土壤對(duì)重金屬的價(jià)態(tài)和吸附，以降低重金屬的生物有效性。微生物修復(fù)處理效果好，費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)單，可以就地進(jìn)行處理，對(duì)環(huán)境影響低。因此，通過(guò)生物技術(shù)培育修復(fù)效率高、適應(yīng)能力強(qiáng)的微生物，對(duì)污染的治理有重要意義。隨著世界經(jīng)濟(jì)逐步發(fā)展，人類活動(dòng)也逐步增強(qiáng)，采礦、印染、化工等工業(yè)帶來(lái)的三廢排放超標(biāo)，農(nóng)用化學(xué)品使用過(guò)量也造成環(huán)境的嚴(yán)重污染，特別是重金屬的污染愈發(fā)嚴(yán)重。目前最引人關(guān)注、污染最廣、毒性最大的有汞、鎘、Cr、鉛、砷等。農(nóng)業(yè)部調(diào)查顯示，在約140萬(wàn) hm2的污水灌區(qū)域中，受重金屬污染的土地面積占污水灌面積的64.8％，對(duì)人類健康造成極大危害。因此，對(duì)重金屬污染的調(diào)查及脫污修復(fù)，對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境、呵護(hù)人類健康意義重大。

試驗(yàn)與方法

采樣點(diǎn)的選擇

選擇棗強(qiáng)、辛集代表性皮毛企業(yè)周圍為采樣點(diǎn)。每個(gè)地點(diǎn)以S形分別選擇三個(gè)樣點(diǎn)，在各樣點(diǎn)上用鐵鏟取5～15 cm深的土壤，約500 g。在塑料薄膜上將各樣點(diǎn)土壤均勻混合，最后將樣品裝入樣袋，貼好標(biāo)簽，帶回實(shí)驗(yàn)室。

土樣的預(yù)處理

將樣品在室內(nèi)自然晾干，并不斷翻拌、壓碎，揀出沙礫、植物殘?bào)w及碎石等雜質(zhì)。然后進(jìn)行樣品細(xì)磨，先過(guò)20 目尼龍篩，再進(jìn)一步研碎后通過(guò)100 目尼龍篩。將經(jīng)過(guò)細(xì)磨的樣品，分裝于樣品袋，貼好標(biāo)簽，備用。

重金屬含量測(cè)定

土壤消化方法如下：準(zhǔn)確稱取 0.1 g土壤放入聚四氟乙烯消解罐中，用1 mL蒸餾水濕潤(rùn)后，加入5 mL鹽酸，加熱至120℃使樣品初步分解，當(dāng)蒸發(fā)至2 mL時(shí)，冷卻至常溫，加入2 mL HF和5 mL HNO3，2 mL HClO4加熱至120℃保持1 h，直至樣品完全消解，加熱至150℃趕酸，直至剩余約為1 mL，冷卻，去離子水定容備測(cè)。

用火焰原子吸收光譜法進(jìn)行重金屬含量的檢測(cè)。每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)，取平均值，作為最終檢測(cè)結(jié)果。

土壤重金屬測(cè)定：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照《土壤環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》，使用GBW-07427標(biāo)準(zhǔn)土壤作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測(cè)定重金屬回收率，并將回收率控制在90％～105％之間。每批消化樣品均帶2個(gè)空白樣品及20％的平行樣，使批次內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于25％，批次間質(zhì)控樣品各元素相對(duì)偏差小于30％。

培養(yǎng)基的配置

根據(jù)重金屬污染調(diào)查結(jié)果，對(duì)重金屬超標(biāo)相對(duì)嚴(yán)重的作為目的物，配制相應(yīng)培養(yǎng)基。

還原Cr的培養(yǎng)基配制：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，NaCl 2.0 g，酵母浸膏5.0 g，葡萄糖4.0 g，H2O 1000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.6。分別加入不同量的10％重鉻酸鉀，使Cr濃度達(dá)到50～1000 mg/L，然后用水浴將其加熱到80℃左右，其間要不斷用玻璃棒攪拌，直至瓊脂全部溶解，再分裝于三角瓶和試管中，在121℃下滅菌30 min。

Cr還原菌的篩選

對(duì)采集到的樣本，每個(gè)樣本用電子天平稱取10.0 g，然后分別放入盛有90 mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上150 r/min， 30℃振蕩培養(yǎng)30 min，使細(xì)菌充分懸浮出來(lái)。在無(wú)菌條件下，將吸取1.0 mL土壤稀釋液注入盛有9.0 mL無(wú)菌水的試管中，反復(fù)三次，充分混勻。然后再?gòu)脑撛嚬苤形?.0 mL溶液，注入另一支盛有9.0 mL無(wú)菌水的試管中，并依次制成10-1，10-2，10-3，不同濃度的稀釋液。

無(wú)菌條件下，分別吸取10-2、10-3兩稀釋度的土壤懸液0.2 mL涂布于Cr（Ⅵ）濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，用涂布棒涂布均勻。每種濃度的平板分別做三個(gè)重復(fù)，并同時(shí)做空白對(duì)照，在30℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出菌落并對(duì)菌落生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察。

菌種純化及馴化篩選

將篩選出長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株經(jīng)Cr（Ⅵ）在液體培養(yǎng)基中梯度壓力式馴化法馴化，Cr（Ⅵ）濃度梯度依次為2～60 mmol/L，于30℃條件下培養(yǎng)，并對(duì)生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，將在含有高濃度重金屬離子的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的單菌落挑取出來(lái)，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，然后在固體培養(yǎng)基上劃線分離，重復(fù)2～3遍，直至獲得對(duì)Cr（Ⅵ）具有高抗性的目的菌株。

Cr還原菌分子生物學(xué)鑒定

選出對(duì)Cr抗性最強(qiáng)的菌株，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

依據(jù)細(xì)菌16S rDNA中最保守序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，引物序列分別為：正向引物（5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’）；反向引物（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）。其中100 μL的PCR反應(yīng)體系為：引物3 μL、dNTP 10 μL和Taq酶0.5 μL、10×PCR緩沖液5 μL、模板2 μL、ddH2O 80μL。所選擇的PCR程序?yàn)椋侯A(yù)變性：94℃，3 min；變性：94℃，30 s；退火：56℃，1 min；延伸：72℃，2 min。循環(huán)次數(shù)為35次，最后再進(jìn)行72℃延伸10 min。16S rDNA PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物首先要利用瓊脂糖凝膠進(jìn)行回收，然后將回收到的產(chǎn)物用T4連接酶連接到pMD18-T載體（由大連寶生物公司提供）上，并在適宜的條件下轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性的送樣到北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。最后將測(cè)定得到的相關(guān)序列提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較分析。

Cr還原菌生理生化特性研究

用生化試劑盒對(duì)Cr還原能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行相關(guān)生理生化試驗(yàn)。

Cr還原菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Cr還原菌的菌懸液按1％的接種量分別接種到不含Cr（Ⅵ）以及含有5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中中，30℃震蕩培養(yǎng)，分別在0、6、12、18、24、36、48 h后取樣，用分光光度計(jì)于600 nm處測(cè)定OD值。

Cr細(xì)菌對(duì)Cr（Ⅵ）還原能力的測(cè)定

將菌株接種到不含重金屬離子的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)48 h后（穩(wěn)定期），在YGD8的菌懸液中加入Cr（Ⅵ）使其終濃度為10 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)并在0、6、12、18、24 h后取樣，經(jīng)10000 r/min離心2 min后取上清液，并使用原子吸收光譜測(cè)定金屬離子含量。

試驗(yàn)結(jié)果與分析

土壤重金屬污染分析

土壤評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)家《土壤重金屬污染評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》（GB 15618-1995）中的標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖1～圖5為一年內(nèi)棗強(qiáng)和辛集不同企業(yè)Cr、Zn、Pb、Cu、Cd五種金屬隨時(shí)間變化的曲線，每個(gè)值為各縣三個(gè)企業(yè)的平均值。綜合以上數(shù)據(jù)可知，在12個(gè)月份中，各種重金屬含量變化并不大，但在雨季，如7～9月份，重金屬含量有下降趨勢(shì)，主要是夏季溫度適合Cr還原菌的生長(zhǎng)，少量Cr被還原，雨水的增多使含Cr區(qū)域面積不斷增大，土壤Cr含量相對(duì)降低。

圖1 各地區(qū)各月份Cr含量平均變化值

圖2 各地區(qū)各月份Zn含量平均變化值

圖3 各地區(qū)各月份Cd含量平均變化值

圖4 各地區(qū)各月份Cu含量平均變化值

圖5 各地區(qū)各月份Pb含量平均變化值

由圖1可知，棗強(qiáng)和辛集Cr含量嚴(yán)重超標(biāo)，其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)三級(jí)土壤的標(biāo)準(zhǔn)；由圖2知，辛集Zn含量已經(jīng)超標(biāo)。出現(xiàn)此種狀況的原因，是棗強(qiáng)和辛集制革企業(yè)較多，特別是棗強(qiáng)大營(yíng)為世界裘皮之都，裘皮生產(chǎn)量很高，含Cr廢水的排放造成了土壤中重金屬的污染，而對(duì)于辛集，隨著辛集市暖氣企業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，鍍Zn的大量使用，是造成土壤Zn污染的主要原因，另外，有機(jī)肥、化肥和Cr的大量使用也是土壤中Zn污染的重要途徑。

重金屬細(xì)菌篩選

經(jīng)過(guò)多次傳代馴化，反復(fù)平板涂布，分離純化到1株對(duì)重金屬Cr具較高還原能力的菌株，命名為YGD8，對(duì)Cr的耐受性為20 mmol/L。

YGD8菌株16S rDNA測(cè)序結(jié)果

通過(guò)對(duì)菌株YGD8的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序和同源性比較，發(fā)現(xiàn)它與熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescnes）的同源性達(dá)到99％，該菌株被鑒定為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescnes）。

YGD8生理生化特性

表1為該菌生理生化鑒定結(jié)果，生長(zhǎng)溫度范圍為4～37℃，最適生長(zhǎng)溫度為25～30℃，能夠利用L-阿拉伯糖、蔗糖、精氨酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽、山梨醇和阿東醇，而不可利用丙二醇和乙醇。

表1 YGD8菌株的生理生化特性

圖6 Cr（Ⅵ）生長(zhǎng)曲線

圖7 Cr（Ⅵ）還原曲線

YGD8生長(zhǎng)曲線測(cè)定

在30℃條件下，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的YGD8菌株分別接種到不含Cr（Ⅵ）以及含有5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中中，然后分別在0、6、12、18、24 h、36、48 h后取樣，用分光光度計(jì)于600 nm處測(cè)定OD值，繪制生長(zhǎng)曲線如圖6所示。發(fā)現(xiàn)低濃度的Cr（Ⅵ）對(duì)YGD8的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，而高濃度則抑制菌株的生長(zhǎng)，并且在添加Cr（Ⅵ）10 mmol/L，YGD8生長(zhǎng)效果最好，見圖6。

YGD8還原能力的測(cè)定

將YGD8菌株接種到不含重鉻酸鉀的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)48 h后（穩(wěn)定期），加入重鉻酸鉀使其終濃度為10 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)0、6、12、24、36、48 h后取樣，經(jīng)10000 r/min離心2 min后取上清液，原子吸收法測(cè)定培養(yǎng)液中Cr的含量，其還原率為86.2％，結(jié)果見圖7

結(jié)語(yǔ)

本文以河北省衡水市棗強(qiáng)及石家莊市辛集代表性皮毛企業(yè)周圍土壤為試驗(yàn)材料，利用2014年12個(gè)月的時(shí)間分別在棗強(qiáng)、辛集兩個(gè)地點(diǎn)典型工業(yè)區(qū)附近采集土壤樣本，每個(gè)地點(diǎn)選擇三個(gè)企業(yè)，每個(gè)企業(yè)選擇三個(gè)樣點(diǎn)進(jìn)行采集。利用火焰原子吸收光譜法測(cè)定土壤樣品中重金屬元素Pb、Cd、Cu、Cr、Zn的含量。從衡水棗強(qiáng)、石家莊辛集采集到的重金屬污染土壤中篩選重金屬Cr的還原菌，對(duì)抗性強(qiáng)的菌株，鑒定其在分類學(xué)上的地位，進(jìn)行還原能力的測(cè)定，分別繪制其生長(zhǎng)曲線和還原曲線。得出以下結(jié)論：（1）一年12個(gè)月內(nèi)，7～9月，棗強(qiáng)重金屬Cr含量有下降的趨勢(shì)，其他月份重金屬Cr含量變化幅度不是很大。（2）棗強(qiáng)地區(qū)Cr含量超標(biāo)相對(duì)嚴(yán)重，辛集Cr含量超標(biāo)，Zn含量略高，棗強(qiáng)、辛集其余重金屬不超標(biāo)。（3）分離純化到1株對(duì)重金屬Cr具較高抗性的菌株，經(jīng)鑒定為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescnes），命名為YGD8，實(shí)驗(yàn)室條件下YGD8對(duì)Cr的還原率為86.2％。該株菌是理想的重金屬修復(fù)的受體工程菌，可應(yīng)用于水體和土壤的重金屬Cr污染的修復(fù)。特別是作為土著菌株對(duì)河北皮毛等企業(yè)的重金屬Cr污染的治理更具有針對(duì)性。

隨著城市化進(jìn)程的加速，土壤重金屬污染在加劇，從廣大城鎮(zhèn)居民的生活飲食健康考慮，加強(qiáng)城市周邊土壤污染調(diào)查和從土壤污染的預(yù)防和治理的角度進(jìn)行土地規(guī)劃和利用勢(shì)在必行。各工業(yè)區(qū)應(yīng)繼續(xù)嚴(yán)格執(zhí)行國(guó)家頒布的工業(yè)“三廢”排放標(biāo)準(zhǔn)和推廣清潔生產(chǎn)，并盡可能采用生物還原的方法，使污染控制在國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)以內(nèi)。同時(shí)對(duì)已經(jīng)污染的土壤利用生物恢復(fù)技術(shù)及時(shí)治理，重金屬還原菌的篩選能為土壤生物恢復(fù)提供菌種資源，提高微生物對(duì)重金屬的吸附作用，是重金屬污染微生物修復(fù)的關(guān)鍵技術(shù)之一。

10.3969/j.issn.1001-8972.2015.23.003