鐘　丹　鄒亦平　延衛(wèi)東　黃宇清　陳小麗　王　娟

（1.井岡山大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江西吉安343009；2.井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西吉安343009）

·研究報告·

丹參對單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型大鼠腎臟TGF-β1及MCP－1表達(dá)的影響*

鐘丹1鄒亦平2延衛(wèi)東1黃宇清1陳小麗2王娟1

（1.井岡山大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江西吉安343009；2.井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西吉安343009）

目的觀察丹參對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型大鼠腎臟TGF-β1及MCP-1表達(dá)的影響，初步探討其抗腎間質(zhì)纖維的機理。方法應(yīng)用單側(cè)輸尿管結(jié)扎致腎間質(zhì)纖維化大鼠模型，SD雄性大鼠120只隨機分為空白組，模型組，丹參高、中、低劑量組，吡格列酮組，每組20只，從模型建立前48 h開始灌胃，于造模后第7天，留取梗阻側(cè)腎臟，采用免疫組化方法檢測腎組織TGF-β1及MCP-1的表達(dá)，RT-PCR方法檢測TGF-β1及MCP-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果與空白組相比較，UUO模型組中TGF-β1、MCP-1表達(dá)明顯增高，丹參高、中劑量組TGF-β1、MCP-1表達(dá)水平明顯低于UUO模型組（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論丹參可通過抑制UUO模型大鼠腎組織TGF-β1、MCP-1蛋白及其mRNA的表達(dá)，從而起到腎臟保護和抗腎間質(zhì)纖維化的作用。

丹參腎間質(zhì)纖維化TGF-β1MCP-1

腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病的最后階段，是腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎功能衰竭的共同通路，采用各種措施來阻止腎纖維化的發(fā)生發(fā)展是臨床防治腎小管間質(zhì)病變，延緩腎功能衰竭的重要手段。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“血瘀證”貫穿于腎纖維化的所有階段，在慢性腎病的防治中活血化瘀類中藥占有重要地位。有鑒于此，本研究擬觀察活血類中藥丹參對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠模型腎組織病變的影響，探討其抗腎間質(zhì)纖維化的機制?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1動物健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，清潔級，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：0003467。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行實驗。

1.2試劑與儀器1）實驗藥物。丹參水煎液：采用江西本地產(chǎn)丹參，自行制備成水煎液。吡格列酮購自杭州中美華東制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050500。2）試劑。TRIzol RNA提取試劑盒（Invitrogen公司）；Platinum Taq DNA Polymerase（Invitrogen公司）；ThermoScript RT-PCR System試劑盒（Invitrogen公司）；兔抗鼠TGF-β1、MCP-1（武漢博士德生物工程有限公司）；兩步法免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3分組與造模將實驗動物隨機分為：空白組、模型組、吡格列酮組、丹參低劑量組、丹參中劑量組、丹參高劑量組，每組20只，自由飲水、進(jìn)食。造模及給藥方法：采用UUO造模方法，戊巴比妥鈉皮下注射麻醉（5 mg/kg）大鼠，打開腹腔后結(jié)扎左側(cè)輸尿管，縫合腹腔。各組均于模型建立前48 h灌胃，丹參灌胃量分別按3、2、1 g/（kg·d）灌胃給藥，每日給藥1次。模型組以等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。吡格列酮組灌胃量為30 mg/（kg·d）。

1.4觀察指標(biāo)免疫組化檢測，以造模后第7天為觀察時點，游離梗阻側(cè)腎，扇形切取部分腎臟織，免疫組化染色采用SP法步驟：3 μm石蠟切片脫蠟，水化后以3%H2O2去離子水孵育，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，抗原熱修復(fù)，正常山羊血清封閉后，分別滴加一抗TGF-β、MCP-1孵育，再依次加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液孵育。應(yīng)用DAB溶液顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。每次染色均以PBS代替一抗做陰性對照。在每張切片不包含腎小球和血管的間質(zhì)區(qū)域隨機選取10個高倍鏡視野（×200），用彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)對所選取視野中免疫組化陽性信號進(jìn)行圖像分析，計算每個視野中TGF-β1、MCP-1各自陽性染色面積占總視野面積的百分比，并計算其均值。采用RT-PCR技術(shù)檢測TGF-β1mRNA、MCP-1 mRNA的表達(dá)，應(yīng)用Trizol試劑盒提取腎組織總RNA，運用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin為內(nèi)對照，進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。引物設(shè)計如下，TGF-β1：上游5'-AGCCTGCTTCTTGAGTC-3'下游引物下游5'-AGGAAAGGTAGGTGATA-3'，基因擴增片斷長度為241 bp。MCP-1：上游5'-CATCCACTCTCTT TCCACAAC-3'，下游5'-ACATTGAAAGTGTTGAAC CAGG-3'，基因擴增片斷長度為222bp。β-actin：上游引物5'-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC-3'，下游引物：5'-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG-3'，基因擴增片斷長度為216 bp。均經(jīng)測序鑒定證實。聚合酶鏈反應(yīng)條件根據(jù)RT-PCR試劑盒推薦條件優(yōu)化，每次PCR反應(yīng)至少重復(fù)3次。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物用含0.5 m/L溴化乙啶的1.5%瓊脂凝膠電泳分析。根據(jù)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以目的基因與β-actin基因mRNA水平比值作為目的基因mRNA的相對表達(dá)量，即目的基因Ct值與β-actin基因Ct值的比值，比值越大，說明目的基因的表達(dá)越少。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊者改用秩和檢驗的Kruskal-Wallish方法進(jìn)行多個樣本比較及兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠腎組織TGF-β1及MCP-1表達(dá)的比較見表1。與空白組比較，模型組腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞胞核TGF-β1強陽性表達(dá)，吡格列酮組及丹參各劑量組TGF-β1表達(dá)水平低于UUO模型組（P＜0.05）；與空白組比較，模型組及各治療組MCP-1表達(dá)明顯較低（P＜0.05），與模型組比較，丹參高、中劑量組MCP-1表達(dá)增高，其中丹參高劑量組表達(dá)增高有統(tǒng)計學(xué)（P＜0.05）。

表1　各組大鼠腎組織TGF-β1及MCP-1表達(dá)的比較（）

表1　各組大鼠腎組織TGF-β1及MCP-1表達(dá)的比較（）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別nTGF-β1MCP-1空白組60.48±0.230.32±0.10模型組62.68±0.23△△0.27±0.18△吡格列酮組60.97±0.21*0.28±0.11△丹參高劑量組60.68±0.26*0.30±0.01*丹參中劑量組60.81±0.56*0.28±0.01△丹參低劑量組60.89±0.33*0.27±0.01△

2.2各組大鼠腎組織TGF-β1mRNA及MCP-1 mRNA表達(dá)的比較見表2。與空白組比較，模型組TGF-β1mRNA表達(dá)明顯較強（P＜0.01）；各藥物治療組TGF-β1mRNA的表達(dá)均較模型組降低，其中丹參高劑量組降低尤為明顯。與空白組比較，模型組MCP-1 mRNA明顯較低（P＜0.05），各藥物治療組MCP-1 mRNA的表達(dá)均較模型組低（P＜0.05），與吡格列酮組比較，丹參高劑量組MCP-1 mRNA的降低明顯（P＜0.05）。

表2　各組大鼠TGF-β1mRNA、MCP-1 mRNA Ct值比較（）

表2　各組大鼠TGF-β1mRNA、MCP-1 mRNA Ct值比較（）

與吡格列酮組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別nTGF-β1MCP-1空白組60.31±0.100.29±0.12模型組61.13±0.08△△1.87±0.13△△吡格列酮組60.99±0.21*1.73±0.16*丹參高劑量組60.61±0.06**▲0.98±0.11*▲丹參中劑量組60.69±0.09*▲1.25±0.15*▲丹參低劑量組60.93±0.03*1.76±0.16*

3　討論

腎間質(zhì)纖維化是各種形式腎臟病發(fā)展的最終共同途徑，纖維化程度預(yù)示著腎功能受損的程度，決定著慢性腎臟病患者的預(yù)后。但其發(fā)病機制非常復(fù)雜，目前尚未完全闡明。研究揭示［1］，炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管、腎間質(zhì)細(xì)胞在致纖維化性生長因子、各種細(xì)胞因子等作用下?lián)p傷和活化、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過度積聚等原因是腎間質(zhì)纖維化形成的重要機制。

本實驗采用UUO模型，UUO是較為公認(rèn)的導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化病理學(xué)改變的模型，在輸尿管梗阻后會先后出現(xiàn)腎間質(zhì)炎性和纖維化等多樣性病理學(xué)改變，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。

巨噬細(xì)胞的侵潤作用在促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化中起著至關(guān)重要的作用。研究表明［2］，MCP-1在多種腎臟疾病中參與了小球和間質(zhì)的巨噬細(xì)胞積聚，而阻斷MCP-1可以減少巨噬細(xì)胞積聚并伴腎臟損傷的減輕。腎臟各種細(xì)胞在多種刺激下都可釋放MCP-1，促使腎組織單核巨噬細(xì)胞浸潤，從而分泌大量的細(xì)胞因子，如TGF-β1等，啟動或擴大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致ECM的積聚、腎臟纖維化的發(fā)生。TGF-β1是目前公認(rèn)的重要的致纖維化生長因子［3］，它通過多個環(huán)節(jié)導(dǎo)致ECM過度積聚，其中TGF-β1是一種目前研究最多且公認(rèn)的強致纖維化因子，受多種因子的調(diào)節(jié)，有研究［4-6］表明MCP-1能上調(diào)TGF-β1的表達(dá)。因此，抑制MCP-1從而減少TGF-β1的表達(dá)可能是治療腎間質(zhì)纖維化的有效途徑之一。

在腎纖維化過程中，由于血流動力學(xué)指標(biāo)的改變，凝血機制被激活，促成纖維素于腎組織中沉積，并刺激血小板凝集，形成血栓以及腎臟病理學(xué)的改變（如細(xì)胞外基質(zhì)的積聚、血管襻、細(xì)胞的增殖，纖維蛋白樣物的沉積、血栓形成、血管閉塞、局灶或節(jié)段性腎小球硬化與間質(zhì)纖維化等），與中醫(yī)學(xué)“血瘀”理論相符［7-8］。丹參是活血化瘀的代表藥物之一，對心腦血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)等疾病均有顯著作用［9-10］。對中藥抗腎纖維化用藥規(guī)律探析結(jié)果表明丹參在24味常用的活血化瘀藥物中使用頻次高居第一位［11］，進(jìn)一步說明丹參在抗纖維化方面療效肯定。

本研究結(jié)果表明，丹參在腎間質(zhì)纖維化早期可以通過抑制TGF-β1、MCP-1的表達(dá)，從而減輕腎小管間質(zhì)的微觀病理損害，起到抗腎小管—間質(zhì)纖維化的作用，而且這種作用具有劑量的依賴性，以丹參大劑量效果最為明顯。

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Effect of Salvia Miltiorrhiza on Renal Expression of TGF-β1 and MCP-1 in Rats with Unilateral Ureter-al Obstruction

ZHONG Dan，ZOU Yiping，YAN Weidong，et al.
Clinical Medical School of Jinggangshan University，Jiangxi，Ji′an 343000，China

【Abstracrt】Objective：To investigate the effect of Salvia miltiorrhiza on the expression of monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）and transforming growth factor-β1（TGF-β1）in the rats with unilateral ureterai obstruction（UUO）and evaluate the protective effect of Salvia miltiorrhiza against renal interstitial fibrosis.Methods：120 male Sprague-Dawley rats were divided into 6 groups：the normal control group，the model group，the Salvia miltiorrhiza group（low dose，middle dose，high dose）and Piloglitazone group，20 rats in each group.48 hours before the modeling，the rats received intragastric administration.On 7th day after modeling，side kidney was taken，and TGF-β1 and MCP-1 were detected with Immunohistochemical method and their mRNA expressions were detected with the method of RT-PCR.Results：The levels of TGF-β1and MCP-1 expression were obviously higher than those in the normal control group，and compared with the model group，it obviously reversed these changes in middle dose and high dose of Salvia miltiorrhiza.Conclusions：Salvia miltiorrhiza can decrease the expression of TGF-β1and MCP-1 in the UU0 rats，and reduce the extent of renal fibrosis.

Salvia miltiorrhiza；Renal fibrosis；Transforming growth factor-β1；Monocyte chemoattractant protein-1

R285.5

A

1004-745X（2015）12-2097-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.009

2015-08-13）

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（GJJ12479）