張捷 曹一鑫 秦婧 王建力 陳莉

胰蛋白酶對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞生長的影響

張捷 曹一鑫 秦婧 王建力 陳莉

目的 探討胰蛋白酶對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖、遷移和黏附能力等生物學行為的影響。方法 用不同濃度的胰蛋白酶處理A431細胞，通過CCK8法檢測細胞活性，篩選胰蛋白酶作用的最佳濃度；流式細胞儀檢測癌細胞增殖周期細胞百分率和增殖率；劃痕和Transwell小室實驗分別檢測癌細胞在二維和三維空間的遷移能力；纖連蛋白粘附試驗檢測癌細胞的黏附潛能。結(jié)果 用不同濃度胰蛋白酶處理A431細胞，通過檢測細胞生長活性發(fā)現(xiàn)，隨著胰蛋白酶濃度升高，A431細胞增殖活性增加；100 nmol/L胰蛋白酶處理A431細胞后，與對照組相比，G1期細胞比例減少，S期細胞比例增高，細胞增殖指數(shù)、細胞遷移能力和黏附潛能增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。結(jié)論 胰蛋白酶能促進A431細胞增殖、遷移和黏附。

癌，鱗狀細胞；胰蛋白酶；細胞生長過程；細胞周期；細胞運動；細胞系，腫瘤

許多惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有肥大細胞增生，但其意義尚不清楚。胰蛋白酶是肥大細胞的重要產(chǎn)物，我們用細胞生物學方法研究胰蛋白酶處理人皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）細胞系A(chǔ)431細胞后，對其增殖、遷移、黏附的影響，探討胰蛋白酶促進腫瘤生長的相關(guān)機制。

一、試劑和儀器

1.主要試劑：常規(guī)培養(yǎng)的A431細胞由第四軍醫(yī)大學西京皮膚醫(yī)院高天文教授惠贈，0.1、1、10、100 nmol/L胰蛋白酶由南通大學藥理教研室提供，0.1%DMEM培養(yǎng)基為美國Invitrogen 公司產(chǎn)品，Cell Counting Kit-8（CCK8）試劑盒為日本Dojindo公司產(chǎn)品，RNA酶A為美國Pharrnacai公司產(chǎn)品，Transwell小室為美國Coastar公司產(chǎn)品，胎牛血清為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，纖連蛋白為美國BD公司產(chǎn)品，0.02%結(jié)晶紫為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品。

2.主要儀器：酶標儀產(chǎn)自美國Biorad公司，流式細胞儀產(chǎn)自美國BD公司。

二、方法

1.CCK8法：常規(guī)培養(yǎng)A431細胞，0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期A431細胞，以3×104個/ml密度、每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h后，分別換含0.1、1、10、100 nmol/L胰蛋白酶的0.1%DMEM培養(yǎng)液。藥物作用 24、48、72 h 后，每孔加入CCK8 溶液 10 μl，37℃繼續(xù)孵育1.5 h，選擇450 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度A值，每組3個復孔，實驗重復3次，取均值。在各濃度組中選取胰蛋白酶與等體積DMEM培養(yǎng)液混合作為胰蛋白酶培養(yǎng)液處理實驗組用于后續(xù)實驗，用等體積DMEM完全培養(yǎng)基處理作為對照組。

2.流式細胞儀檢測：取對數(shù)生長期A431細胞，以105個/ml的密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，加入含100 nmol/L胰蛋白酶培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，消化離心細胞，以4℃預冷的75%乙醇固定過夜。細胞懸液560×g離心10 min，棄上清液，再用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗1次，重復離心1次后加RNA酶A 200 μl/管，混勻，4℃30 min；加碘化丙錠（PI）200 μl/管，混勻，放入 4 ℃冰箱保存 1 h，流式細胞儀檢測。細胞增殖指數(shù)（PI）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。

3.細胞劃痕法：取對數(shù)生長期A431細胞，以105個/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔150 μl?？装宓撞款A先畫好標記線，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞間形成較緊密連接的單層后，用無菌10 μl槍頭在培養(yǎng)孔底部中央垂直劃一道痕跡，且在顯微鏡下可同時看到創(chuàng)面兩側(cè)。然后各孔加入含100 nmol/L胰蛋白酶培養(yǎng)液。倒置顯微鏡（×100）下分別測量24、48、72 h的劃痕創(chuàng)面愈合情況。每組細胞不同時間點通過劃痕區(qū)的長度占劃痕區(qū)長度的百分比代表其相對遷移率。

4.Transwell小室試驗：取對數(shù)生長期A431細胞，以105個/ml的密度接種于24孔板中，次日給予含100 nmol/L胰蛋白酶培養(yǎng)液，48 h后制備細胞懸液。將含50 μl Matrigel膠包被Transwell小室置于24孔板中，在小室膜上加入A431細胞懸液 100 μl，細胞數(shù)約為 1 × 105個，小室膜下加入 600 μl完全培養(yǎng)液。37℃、5%CO2條件下孵育24 h后，用棉簽輕輕擦去膜上細胞，膜下細胞用結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下分別計數(shù)每孔5個視野（×200）中的細胞，取其均值。

5.細胞黏附試驗：取對數(shù)生長期A431細胞，以105個/ml的密度接種于24孔板中，次日實驗組給予胰蛋白酶培養(yǎng)液（對照組仍常規(guī)培養(yǎng)）。同時用滅菌雙蒸水分別配制10 g/L牛血清白蛋白（BSA）溶液，50 mg/L Matrigel膠1∶8稀釋液各50 μl/孔分別加入96孔培養(yǎng)4℃過夜，每孔加入10 g/L BSA無血清培養(yǎng)液50 μl，37℃，1 h。分別消化實驗組和對照組處理的A431細胞制備2×105/ml細胞懸液各100 μl分別將接種于包被胎牛血清，纖連蛋白的96孔培養(yǎng)板中，37℃，1 h。每組平行4個樣本。70%甲醇固定10 min，洗板晾干，0.02%結(jié)晶紫染色10min，PBS洗去多余染料，再以0.2%TritonX-100溶解細胞，在酶聯(lián)免疫儀上測定各孔570 nm處A值。粘附率（%）=［（實驗組A值/對照組A值）-1］×100%

6.統(tǒng)計分析：用SPSS14.0統(tǒng)計學軟件進行方差齊性檢驗與方差分析。配對計量資料采用配對t檢驗。率的比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

三、結(jié)果

1.不同濃度胰蛋白酶對A431細胞活力的影響：CCK8法檢測加藥各組A431細胞的增殖情況并繪制生長曲線（圖1）。胰蛋白酶處理細胞48 h時除最低濃度外，其余各濃度均能促進A431細胞增殖（與對照組比較，均P＜0.05），其中100 nmol/L濃度的效果最明顯，因此在后續(xù)試驗中選擇胰蛋白酶100 nmol/L濃度。

圖1 CCK8法檢測不同濃度胰蛋白酶作用于A431細胞的生長曲線

2.100 nmol/L胰蛋白酶對A431細胞周期的影響：流式細胞儀檢測，胰蛋白酶處理組A431細胞G1期在24、48、72 h均少于對照組，S期均多于對照組；胰蛋白酶處理后24、48 h，增殖指數(shù)與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.02和0.03）。見表1。

3.100 nmol/L胰蛋白酶對A431細胞遷移和黏附的影響：胰蛋白酶處理A431細胞24、48、72 h，細胞遷移和黏附能力較對照組顯著增加（均P＜0.05），見表2。

表1 胰蛋白酶作用下A431細胞各周期百分比及增殖指數(shù)

表2 胰蛋白酶對A431細胞遷移和黏附的影響（±s）

表2 胰蛋白酶對A431細胞遷移和黏附的影響（±s）

注：n=3

組別 細胞遷移率（%） 侵襲細胞數(shù)（個） 黏附細胞數(shù)（個）24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h胰蛋白酶組 0.40±0.10 0.87±0.01 0.98±0.01 232.25±2.99 367.40±8.44 335.20±3.11 63.95±0.22 77.17±0.76 92.78±0.33對照組 0.33±0.19 0.58±0.08 0.91±0.03 158.33±8.02 201.40±10.31 249.00±7.38 32.00±0.56 46.90±0.35 64.60±0.96 t值 0.56 6.23 3.83 14.96 21.58 18.64 91.98 62.66 48.08 P值 0.60 0.00 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

四、討論

胰蛋白酶是肥大細胞合成和分泌的特異性活性蛋白酶［1］，可活化一些與腫瘤侵襲相關(guān)的蛋白酶，如尿激酶前體、基質(zhì)金屬蛋白酶等，從而導致腫瘤的浸潤［2］。Yamamoto 等［3］用免疫組化方法檢測大腸癌標本的胰蛋白酶表達，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶表達與腫瘤侵襲深度、淋巴靜脈侵襲、淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移、PTNM分期及復發(fā)密切相關(guān)，胰蛋白酶陽性的患者較陰性的患者總生存期和無病生存期顯著縮短，同時表達基質(zhì)金屬蛋白酶和胰蛋白酶的患者預后極差，因此，在大腸癌中同時檢測基質(zhì)金屬蛋白酶和胰蛋白酶對提示大腸癌預后極有意義。Miyata等［4］報道，胰蛋白酶通過參與PAR2信號傳導，促進癌細胞增殖以及黏附到纖連蛋白，進而促進腫瘤細胞生長侵襲轉(zhuǎn)移。

本研究用4個不同濃度胰蛋白酶處理A431細胞，發(fā)現(xiàn)隨著胰蛋白酶濃度升高A431細胞增殖活性增加，說明胰蛋白酶對A431的生長促進作用呈劑量依賴性。流式細胞儀觀察到胰蛋白酶處理A431細胞24、48、72 h后，G1期細胞均少于對照組，S期細胞均多于對照組；胰蛋白酶處理后24、48 h細胞增殖指數(shù)與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義，表明胰蛋白酶顯著促進腫瘤細胞增殖。幾乎所有的腫瘤都有細胞周期調(diào)控機制破壞，導致細胞生長失控、分化受阻［5］。胰蛋白酶促進腫瘤細胞增殖的機制尚待進一步研究。

本文細胞劃痕法、Transwell小室試驗和細胞黏附試驗結(jié)果顯示，胰蛋白酶能夠促進A431細胞的遷移和黏附。這一結(jié)果與文獻報道的胰蛋白酶能促進癌細胞黏附到纖連蛋白的情況相似［3］，胰蛋白酶與其他蛋白水解酶一樣可通過對細胞外基質(zhì)、基底膜的降解，促進癌細胞遷移并黏附到間質(zhì)纖連蛋白上形成腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

［1］黃闐,李明才,吳名耀,等.tryptase和chymase表達與食管癌臨床病理因素的相關(guān)性［J］.腫瘤防治研究,2009,36（5）:412-414.

［2］肖淑華,劉陽陽,魏連海,等.肥大細胞研究進展［J］.生理科學進展,2011,42（2）:104-107.

［3］Yamamoto H,Iku S,Adachi Y,et al.Association of trypsin expression with tumour progression and matrilysin expression in human colorectal cancer［J］.J Pathol,2003,199（2）:176-184.

［4］Miyata S,Koshikawa N,Yasumitsu H,et al.Trypsin stimulates integrin alpha（5）beta（1）-dependent adhesion to fibronectin and proliferation of human gastric carcinoma cells through activation of proteinase-activated receptor-2 ［J］.J Biol Chem,2000,275（7）:4592-4598.

［5］鄒向陽,李連宏.細胞周期調(diào)控與腫瘤［J］.國際遺傳學雜志,2006,29（1）:70.

Effect of trypsin on the growth of a skin squamous cell carcinoma cell line A431

Zhang Jie*,Cao Yixin,Qin Jing,Wang Jianli,Chen Li.
*Department of Dermatovenereologoy,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001,Jiangsu,China

s:Wang Jianli,Email:bl1@ntu.edu.cn;Chen Li,Email:guilan@ntu.edu.cn

Objective To evaluate the effect of trypsin on the proliferation,migration and adhesion of a skin squamous cell carcinoma cell line A431.Methods Cultured A431 cells were divided into several experimental groups treated with trypsin at concentrations of 0.1,1,10 and 100 nmol/L for 24,48 and 72 hours respectively,and a control group treated with DMEM complete medium only.Cell counting kit-8 （CCK8）assay was conducted to evaluate cellular proliferative activity to select the optimal concentration of trypsin.Then,some A431 cells treated with trypsin at the selected concentration for 24,48 and 72 hours respectively （or 48 hours only）served as the experimental groups（or group）,and other A431 cells treated with DMEM complete medium served as the control group.Flow cytometry was performed to assess cell cycle distribution and proliferation index,fibronectin-based adhesion assay to estimate cell adhesive capacity,and wound healing assay and Transwell assay were conducted to evaluate the migratory capacity of cells in two-and three-dimensional space.Statistical analysis was carried out by using analysis of variance,paired samplesttest and chi-square test.Results The proliferative activity of A431 cells increased along with the increase of trypsin concentrations,with the strongest increasing effect observed at 100 nmol/L.After treatment with 100 nmol/L trypsin,the experimental group showed a decrease in the percentage of G1-phase cells,but an increase in the percentage of S-phase cells,proliferation index,migratory and adhesive capacity compared with the control group （allP＜0.05）.Conclusion Trypsin can promote the proliferation,migration and adhesion of A431 cells.

Carcinoma,squamous cell;Trypsin;Cell growth processes;Cell cycle;Cell movement;Cell line,tumor

作者單位：226001南通大學附屬醫(yī)院皮膚性病科［張捷、曹一鑫（現(xiàn)在江蘇大學附屬江濱醫(yī)院）、王建力］，病理科（秦婧、陳莉）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.07.013

南通市社會事業(yè)科技創(chuàng)新與示范項目（HS2014004）

王建力，Email：bl1@ntu.edu.cn；陳莉，Email：guilan@ntu.edu.cn

2014-07-13）

（本文編輯：吳曉初）