繆飛 王秀麗 呂婷 石磊 張玲琳 王宏偉

光動(dòng)力療法對(duì)表達(dá)人乳頭瘤病毒16 E7蛋白的HaCaT細(xì)胞株增殖和凋亡的影響

繆飛 王秀麗 呂婷 石磊 張玲琳 王宏偉

目的 探討氨基酮戊酸光動(dòng)力療法（ALA-PDT）對(duì)表達(dá)人乳頭瘤病毒16 E7蛋白的HaCaT細(xì)胞株（簡稱HaCaT/HPV16 E7）增殖和凋亡的影響。方法 HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞株分為4組，即空白組、單純光敏劑組、單純照射組（12 J/cm2）、不同光劑量（4、8、12 J/cm2）ALA-PDT組，細(xì)胞與氨基酮戊酸（ALA）共孵育5 h，采用波長630 nm、功率30 mW/cm2紅光照射，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞24 h后存活率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞3 h的凋亡率，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果 空白組、單純光敏劑組、單純照射組（12 J/cm2）、不同光劑量（4、8、12 J/cm2）ALA-PDT照射細(xì)胞24 h，細(xì)胞生長存活率分別為99.15%±0.64%、98.13%±0.83%、96.85%±1.37%、68.98%± 1.03%、46.03%±2.96%、23.57%±3.83%，后3組ALA-PDT組與其他3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。隨著光劑量升高，細(xì)胞凋亡逐漸增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞皺縮。結(jié)論 ALA光動(dòng)力抑制HPV感染細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，在一定光劑量范圍內(nèi)，呈劑量依賴性。

氨基酮戊酸；光化學(xué)療法；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；α乳頭狀瘤病毒屬；人乳頭瘤病毒16 E7蛋白

氨基酮戊酸光動(dòng)力療法（aminolaevulinic acidphotodynamic therapy，ALA-PDT）已成功治療尖銳濕疣和宮頸高危人乳頭瘤病毒（HPV）感染，并顯示出其特有的優(yōu)越性［1-2］。但其破壞HPV感染細(xì)胞的機(jī)制及細(xì)胞內(nèi)作用的靶點(diǎn)尚未完全闡明。由于HPV種屬的特異性，目前尚缺乏HPV動(dòng)物模型，體外亦無法培養(yǎng)。因此，有關(guān)HPV的研究就聚焦在HPV某一基因轉(zhuǎn)染到HaCaT細(xì)胞中［3-4］。我們前期已建立表達(dá)人乳頭瘤病毒16 E7蛋白的HaCaT細(xì)胞株（簡稱HaCaT/HPV16 E7）［5］，本實(shí)驗(yàn)以HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞株作為HPV感染細(xì)胞的模型，在細(xì)胞學(xué)水平分析ALA-PDT對(duì)HPV感染細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

材料和方法

一、材料與儀器

HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞株均為本院中心實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基、geneticin?（G418，美國Gibco公司），CCK8試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（美國Invitrogen公司），ALA粉劑（上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司）。LED實(shí)驗(yàn)光源由荷蘭Philips公司為本實(shí)驗(yàn)特別搭建，波長630 nm，輻射計(jì)測(cè)得實(shí)際輸出功率為30 mW/cm2；熒光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；流式細(xì)胞儀（型號(hào)FACSAria，美國BD公司）由上海復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)室提供。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞置于含10%胎牛血清、青霉素（100 U/ml）、鏈霉素（100 μg/ml）、G418（終濃度為0.5 g/L）的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞生長至90%融合時(shí)，用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化培養(yǎng)細(xì)胞，制備單一細(xì)胞懸液，采用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，每孔體積200 μl，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.分組處理：上述培養(yǎng)好的HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞分為4組，即空白組、單純光敏劑組、單純照射組（12 J/cm2）、不同光劑量（4、8、12 J/cm2）ALA-PDT組。①空白組：細(xì)胞未做任何處理；②單純光敏劑組：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸除原培養(yǎng)基，加入終濃度為1 mmol/L ALA的培養(yǎng)基后，用錫紙包裹96孔板繼續(xù)培養(yǎng)；③單純照射組：細(xì)胞照射前吸出培養(yǎng)液，用PBS液沖洗2遍；96孔板用自制遮光罩保護(hù)，在未接種細(xì)胞的孔內(nèi)加入微孔過濾后的墨汁以避免光衍射；揭開需要光處理的細(xì)胞孔，用30 mW/cm2功率密度的630 nm LED紅光照射，照射距離為1 cm，照射劑量12 J/cm2；④ALA-PDT組：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸除原培養(yǎng)基，加入終濃度為1 mmol/L ALA的培養(yǎng)基后，用錫紙包裹96孔板；避光培養(yǎng)5 h后，吸出培養(yǎng)液，用PBS液沖洗2遍；其他處理及照射方法同單純照射組；經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)并參考相關(guān)文獻(xiàn)［6］，設(shè)定照射能量分別為4、8、12 J/cm2。照射完畢后處理同單純照射組。

3.CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：上述細(xì)胞處理24 h后加入10 μl CCK8溶液，培養(yǎng)2 h后終止，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長450 nm處測(cè)定吸光度（A值）。細(xì)胞存活率（%）=（處理組A值/對(duì)照組A值）× 100%。

4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：采用Annexin V＋碘化丙錠（PI）雙染色法，收集上述處理3 h后的細(xì)胞約5萬～10萬個(gè)，加入195 μl結(jié)合緩沖液重懸，離心，棄上清液，加入5 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min，再次離心棄上清液，加入190 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μl PI染色液，混勻，冰浴避光放置5 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC時(shí)使用FL-4通道，用遠(yuǎn)紅外通道檢測(cè)PI熒光。早期凋亡細(xì)胞為Annexin V（＋）/PI（-），Annexin V-FITC和PI雙陽性的為晚期凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞，Annexin V-FITC（-）和PI（＋）為死亡細(xì)胞［7-8］。用CellQuest軟件分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5.觀察細(xì)胞密度與細(xì)胞形態(tài)：ALA-PDT處理細(xì)胞后3 h，立即在共聚焦顯微鏡下觀察各組細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)變化。ALA-PDT處理細(xì)胞后24 h，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長密度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、細(xì)胞增殖情況

空白組、單純光敏劑組、單純照射組（12 J/cm2）、不同光劑量（4、8、12 J/cm2）ALA-PDT組處理24 h后，細(xì)胞生長存活率分別為 99.15%±0.64%、98.13%±0.83%、96.85%±1.37%、68.98%±1.03%、46.03%±2.96%、23.57%±3.83%。單因素方差分析顯示，6組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=942.667，P＜0.001）。4、8、12 J/cm2ALT-PDT組分別與空白組、單純光敏劑組、單純照射組比較，ALT-PDT 3組的細(xì)胞存活率均明顯降低（均P＜0.001），且隨著ALA-PDT組照光劑量的增加，細(xì)胞存活率降低（單因素方差分析，均P＜0.001）。此外，空白組、單純光敏劑組、單純照射組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

二、細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞儀檢測(cè)ALA-PDT處理HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞3 h后的細(xì)胞凋亡及死亡百分比，結(jié)果顯示，單純ALA處理后，23.90%±1.85%的HaCaT/ HPV16 E7細(xì)胞死亡。隨著照射劑量（4、8、12 J/cm2）的增加，細(xì)胞凋亡和死亡的比例明顯增加（分別為36.77%±2.66%、86.13%±5.37%、86.87%±3.20%），4、8、12 J/cm2ALT-PDT組分別與單純光敏劑組相比，細(xì)胞死亡比例均明顯增高（P值分別 ＜0.01，＜0.001、＜0.001）；見圖1。此外，單純光敏劑組和單純照射組（22.9%±2.46%）分別與空白對(duì)照組（20.8%±1.19%）比較，細(xì)胞凋亡和死亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同照光劑量（4、8、12 J/cm2）光動(dòng)力對(duì)HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞照射后3 h凋亡和死亡情況 隨著照光劑量的增加，HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞凋亡和死亡的比例明顯增加

三、倒置相差顯微鏡檢測(cè)結(jié)果

成熟的HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞株貼壁良好，細(xì)胞飽滿，胞質(zhì)豐富、均勻。隨著光動(dòng)力劑量增加細(xì)胞生長密度逐漸降低，細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣改變，結(jié)構(gòu)模糊（圖2）。

圖2 倒置相差顯微鏡下觀察0、4、8、12 J/cm2光動(dòng)力處理HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞株24 h后細(xì)胞生長密度（×100） 隨著光動(dòng)力劑量增加，細(xì)胞生長密度逐漸降低，細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣改變，結(jié)構(gòu)模糊

四、聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果

隨著光動(dòng)力能量的增高，HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞皺縮，間隙增大，脫落細(xì)胞也逐漸增多（圖3）。

討論

近年來，ALA-PDT治療尋常疣、跖疣、尖銳濕疣等HPV相關(guān)疾病，療效好、復(fù)發(fā)率低，受到臨床醫(yī)生的青睞［7］。本研究結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道［8-9］，選用1 mmol/L的ALA濃度，孵育時(shí)間5 h。

磷脂酰絲氨酸正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，磷脂酰絲氨酸可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中，為吞噬細(xì)胞提供可識(shí)別的信號(hào)［10］。Annexin V是一種相對(duì)分子質(zhì)量為35 000～36 000的Ca2＋依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸高親和力特異性結(jié)合。PI是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對(duì)于凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能透過細(xì)胞膜使細(xì)胞核紅染。因此，Annexin V進(jìn)行熒光素標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針與PI匹配使用，就可以把凋亡早晚期的細(xì)胞以及死亡細(xì)胞區(qū)分開來。我們采用Annexin V/PI雙染法，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同劑量（0、4、8、12 J/cm2）ALA-PDT后3 h HaCaT/HPV16 E7細(xì)胞凋亡及死亡的比例，結(jié)果顯示，隨著光劑量的增加，細(xì)胞的凋亡和死亡明顯增加，呈一定的劑量依賴性。

本研究顯示，隨著光動(dòng)力劑量的增加，HaCaT/ HPV16 E7細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，亦呈劑量依賴性。在顯微鏡下，隨著PDT能量的增加，細(xì)胞密度逐漸降低，胞質(zhì)內(nèi)顆粒逐漸增多，顏色加深，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，細(xì)胞形態(tài)皺縮。研究結(jié)果提示，ALA-PDT可通過抑制HPV感染細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡，其具體凋亡途徑尚待進(jìn)一步研究。

［1］Wang HW,Zhang LL,Miao F,et al.Treatment of HPV infectionassociated cervical condylomata acuminata with 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy［J］.Photochem Photobiol, 2012,88（3）:565-569.

［2］Kostovic K,Pastar Z,Ceovic R,et al.Photodynamic therapy in dermatology:currenttreatmentsand implications［J］.Coll Antropol,2012,36（4）:1477-1481.

［3］Kabsch K,Alonso A.The human papillomavirus type 16 E5 protein impairs TRAIL-and FasL-mediated apoptosis in HaCaT cells by different mechanisms［J］.J Virol,2002,76（23）:12162-12172.

［4］Severino A,Abbruzzese C,Manente L,et al.Human papillomavirus-16 E7 interacts with Siva-1 and modulates apoptosis in HaCaT human immortalized keratinocytes［J］.J Cell Physiol,2007,212（1）:118-125.

［5］繆飛,王秀麗,王宏偉,等.穩(wěn)定表達(dá)人乳頭瘤病毒16E7蛋白HaCaT細(xì)胞株的建立［J］.中華皮膚科雜志,2011,44（5）:310-313.

［6］Kawczyk-Krupka A,Czuba Z,Szliszka E,et al.The role of photosensitized macrophages in photodynamic therapy［J］.Oncol Rep,2011,26（1）:275-280.

［7］Darlenski R,Fluhr JW.Photodynamic therapy in dermatology:past, present,and future［J］.J Biomed Opt,2013,18（6）:061208.

［8］Kuzelová K,Grebenová D,Pluskalová M,et al.Early apoptotic features of K562 cell death induced by 5-aminolaevulinic acidbased photodynamic therapy［J］.J Photochem Photobiol B,2004, 73（1-2）:67-78.

［9］Smetana K,Cajthamlová H,Grebenová D,et al.The 5-aminolaevulinic acid-based photodynamic effects on nuclei and nucleoli of HL-60 leukemic granulocytic precursors［J］.J Photochem Photobiol B,2000,59（1-3）:80-86.

［10］Fadok VA,Voelker DR,Campbell PA,et al.Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages［J］.J Immunol, 1992,148（7）:2207-2216.

Effects of photodynamic therapy on the proliferation and apoptosis of human papillomavirus type 16 E7 proteinexpressing HaCaT cells

Miao Fei*,Wang Xiuli,Lyu Ting,Shi Lei,Zhang Linglin,Wang Hongwei.*Huadong Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 200040,China
Corresponding author:Wang Hongwei,Email:hongweiwang2005@aliyun.com

ObjectiveTo explore the effects of aminolevulinic acid-based photodynamic therapy（ALA-PDT）on the proliferation and apoptosis of HaCaT cells stably expressing human papillomavirus type 16 E7 protein（HaCaT/ HPVl6 E7 cells）.MethodsCultured HaCaT/HPV16 E7 cells were divided into several groups:blank control group receiving no treatment,ALA group treated with ALA alone,irradiation group irradiated with 630-nm red laser（30 mW/cm2, 12 J/cm2）,ALA-PDT groups pretreated with ALA for 5 hours followed by 630-nm red laser radiation at 4,8,12 J/cm2respectively.CCK8 assay was performed to determine the survival rate of cells at 24 hours after PDT,and flow cytometry and confocal microscopy were conducted to detect cell apoptosis and observe cell morphology respectively at 3 hours.ResultsAt 24 hours,the survival rate of cells was 68.98%±1.03%,46.03%±2.96%and 23.57%±3.83%in the 4-, 8-and 12-J/cm2ALA-PDT groups respectively,significantly lower than that in the blank control group,ALA group and irradiation group（99.15%±0.64%,98.13% ±0.83%and 96.85%±1.37%respectively,allP＜0.05）.With the increase in radiation dose,cell apoptosis was accelerated with obvious morphological changes and shrinkage of cells in the ALA-PDT groups.ConclusionALA-PDT can inhibit the proliferation,and promote the apoptosis of HPV-infected HaCaT cells in a dose-dependent manner within a certain range of radiation dose.

Aminolevulinic acid;Photochemotherapy;Cell proliferation;Apoptosis;Alphapapillomavirus; HPV16 E7

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.005

國家自然科學(xué)基金（30972665）；上海市自然科學(xué)基金（08ZR1417400）；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)先進(jìn)適宜技術(shù)推廣項(xiàng)目（2013SY007）；上海市衛(wèi)生局科研課題計(jì)劃（20124034）；上海市級(jí)醫(yī)院臨床科研資源共享平臺(tái)項(xiàng)目（SHDC12007703）

200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院（繆飛、呂婷、王宏偉）；上海市皮膚病醫(yī)院（王秀麗、石磊、張玲琳）

王宏偉，Email：hongweiwang2005@aliyun.com

2015-01-06）

（本文編輯：周良佳 顏艷）