索桂英 付萍

尋常型天皰瘡患者血清骨橋蛋白的檢測

索桂英 付萍

目的 探討尋常型天皰瘡（PV）患者血清中骨橋蛋白在PV發(fā)病中的作用。方法 用酶聯(lián)免疫吸附試驗對31例尋常型天皰瘡患者和35例健康對照組血清骨橋蛋白的濃度進(jìn)行測定。用SPSS17.0及Excell統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果 PV患者血清骨橋蛋白的表達(dá)水平顯著高于健康對照組（P<0.01）。皮膚黏膜同時受累患者血清骨橋蛋白水平高于僅皮膚受累組（P<0.05）。合并感染組血清骨橋蛋白水平高于未合并感染組（P<0.01）；PV患者的血清骨橋蛋白水平與抗Dsg3抗體呈正相關(guān)（rs=0.489，P<0.01）。結(jié)論 骨橋蛋白在PV患者血清中高表達(dá)，特別是皮膚黏膜同時受累的患者，且與天皰瘡抗體滴度呈正相關(guān)。

天皰瘡；骨橋蛋白；酶聯(lián)免疫吸附測定

天皰瘡是一組累及皮膚黏膜的自身免疫性大皰病，尋常型天皰瘡（PV）約占天皰瘡患者的80%［1］。骨橋蛋白是一種帶負(fù)電荷的分泌型磷酸化糖蛋白，主要由活化的巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞和活化的T淋巴細(xì)胞分泌，廣泛分布于細(xì)胞外液、炎癥部位的細(xì)胞外基質(zhì)中。2012年，陳宏等［2］研究骨橋蛋白與大皰性類天皰瘡（bullous pemphigoid，BP）的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BP組的血清骨橋蛋白的表達(dá)水平高于健康對照組，并與BP病情活動呈正相關(guān)。Baroni等［3］報道，在天皰瘡患者血清中可以檢測到骨橋蛋白，且骨橋蛋白升高水平與天皰瘡循環(huán)抗Dsg3/1抗體水平一致，在同時有皮膚和黏膜損害的天皰瘡患者中升高更為明顯。我們用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定PV患者血清骨橋蛋白水平，探討骨橋蛋白與PV的關(guān)系。

一、對象與方法

1.對象：2011年7月至2013年1月，于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚風(fēng)濕免疫科住院部確診的初發(fā)或復(fù)發(fā)活動期PV患者31例（近1個月未規(guī)律使用糖皮質(zhì)激素與免疫抑制劑）。健康對照組35例為同期健康體檢者。與PV組患者年齡、性別相匹配。兩組對象均抽取清晨空腹外周靜脈血3 ml，靜置30 min后離心（1600×g，10 min），置于-80℃冰箱中凍存待檢。

2.方法：按照人骨橋蛋白ELISA試劑盒（美國RD公司）說明書操作。簡要描述如下：將血清樣本稀釋25倍（10 μl的血清樣本加入240 μl的樣本稀釋液）；向每孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測血清樣本各50 μl，蓋上封板膜，輕搖勻，室溫下放置2 h；甩去孔內(nèi)液體，向每孔中加入約400 μl洗滌液，反應(yīng)30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作步驟4次。向每孔中加入200 μl的鏈霉親和素-HPR，蓋上封板膜。向每孔中加入提前配好的顯色劑混合液（即顯色劑A∶顯色劑B=1∶1）200 μl，輕搖勻，室溫下避光顯色半小時；向每孔中加入終止液50 μl?？字幸后w顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，未變色的充分混勻；半小時內(nèi)在酶標(biāo)儀上450 nm處測定A值；以A值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用Excell表格繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。根據(jù)血清標(biāo)本A值，計算出樣本濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為血清樣本的實際濃度。

3.統(tǒng)計學(xué)處理：用SPSS17.0及Excell統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，經(jīng)過SPSS的描述性分析，各組血清骨橋蛋白水平近似正態(tài)分布，以±s表示，組間差別采用t檢驗。對于相關(guān)性分析，如果對應(yīng)兩組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布且方差齊，則用Pearson相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)為r。如果對應(yīng)兩組數(shù)據(jù)有一組不符合正態(tài)分布，則采用Spearman秩相關(guān)檢驗，相關(guān)系數(shù)為rs。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

PV組血清骨橋蛋白水平（49.03±13.43）μg/L高于健康對照組（18.94± 3.89）μg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。皮膚黏膜同時受累組血清骨橋蛋白（56.62±25.18）μg/L高于僅皮膚受累組（30.44±19.90）μg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。合并感染組血清骨橋蛋白（77.78±27.07）高于未合并感染組（25.34 ± 13.43）μg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

天皰瘡組患者的血清骨橋蛋白水平與抗Dsg3抗體呈顯著正相關(guān)（rs=0.489，P=0.005），與抗Dsg1抗體定量呈正相關(guān)（rs=0.383，P=0.033），與補體 C3呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.594，P=0.000），與免疫球蛋白 IgG、IgA、IgM，白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等無相關(guān)性（P>0.05）。

表1 天皰瘡各組與健康對照組血清骨橋蛋白水平的比較（x ± s） μg/L

三、討論

我們的研究發(fā)現(xiàn)，31例PV患者血清骨橋蛋白表達(dá)水平明顯高于健康對照組，皮膚黏膜同時受累的PV患者血清中骨橋蛋白表達(dá)水平高于僅皮膚受累的患者，且與抗Dsg1、抗Dsg3抗體滴度呈正相關(guān)性。推測可能的機制：骨橋蛋白可通過激活天皰瘡發(fā)病過程中，自身反應(yīng)性Th1細(xì)胞反應(yīng)系統(tǒng)，白細(xì)胞介素（IL）8能介導(dǎo)局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答和輔助抗體生成，從而促使天皰瘡發(fā)生；骨橋蛋白可能通過增強炎癥前期的Th1細(xì)胞反應(yīng)，抑制Th2細(xì)胞反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮對自身免疫性疾病的作用［4］；骨橋蛋白具有刺激T細(xì)胞增殖，促進(jìn)CD44配體的表達(dá)和巨噬細(xì)胞分泌干擾素γ，IL-12的作用，從而維持B細(xì)胞增殖和抗體的產(chǎn)生而發(fā)揮作用［5］。有文獻(xiàn)報道，天皰瘡患者血清前炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α明顯升高，腫瘤壞死因子α能協(xié)同天皰瘡lgG自身抗體引起表皮棘層松解［6］，而組織損傷和腫瘤壞死因子α均能誘導(dǎo)骨橋蛋白表達(dá)，因此，我們不能排除骨橋蛋白升高是繼發(fā)于表皮損傷或腫瘤壞死因子α升高。骨橋蛋白在天皰瘡發(fā)病過程中不論是始動因素還是繼發(fā)性增高，本文結(jié)果顯示，骨橋蛋白水平隨著自身抗體水平的升高而升高，特別是皮膚和黏膜同時受累的患者，提示骨橋蛋白參與了天皰瘡的發(fā)病過程。

［1］Dick Sarah,Werth Victoria P.Pemphigus:a treatment update［J］.Autoimmunity,2006,39（7）:591-599.

［2］陳宏,趙會娟,門劍龍,等.大皰性類天皰瘡患者骨橋蛋白和白介素 18 的檢測［J］.中華皮膚科雜志,2012,45（9）:659-661.

［3］Baroni A,De Filippis A,Buommino E,et al.Osteopontin,a protein with cytokine-like properties:a possible involvement in pemphigus vulgaris［J］.Arch Dermatol Res,2012,304（3）:237-240.

［4］O′Regan AW,Nau GJ,Chupp GL,et al.Osteopontin （Eta-1）in cell-mediated immunity:teaching an old dog new tricks［J］.Immunology Today,2000,21（10）:475-478.

［5］Iizuka J,Katagiri Y,Tada N,et al.Introduction of an osteopontin gene confers the increase in B1 cell population and the production of anti-DNA autoantibodies［J］.Lab Invest,1998,78（12）:1523-1533.

［6］Orlov MD,Chernyavsky AI,Arredondo J,et al.Synergistic actions of pemphigus vulgaris IgG,Fas-ligand and tumor necrosis factoralpha during induction of basal cell shrinkage and acantholysis［J］.Autoimmunity,2006,39（7）:557-562.

Detection of serum osteopontin in patients with pemphigus vulgaris

Suo Guiying,Fu Ping*.*Department of Dermatology/Rheumatology,Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650101,China

Fu Ping,Email:cinafuping@hotmail.com

Objective To investigate the role of serum osteopontin in the occurrence of pemphigus vulgaris（PV）.Methods Enzyme-linked immunosorbent assay was conducted to determine serum levels of osteopontin in 31 patients with PV and 35 healthy human controls.Statistical analysis was carried out byttest and Spearman rank correlation analysis with the SPSS 17.0 software and Excel.Results Serum levels of osteopontin were significantly higher in patients with PV than in healthy controls （P<0.01）,in patients with mucocutaneous involvement than in those with only cutaneous involvement（P<0.05）,and in patients with complicated infections than in those without（P<0.01）.There was a positive correlation between serum levels of osteopontin and anti-Dsg3 antibody in patients with PV （rs=0.489,P<0.01）.Conclusions Serum levels of osteopontin are increased in patients with PV,especially in those with mucocutaneous involvement,and positively correlated with PV-related antibody titers.

Pemphigus;Osteopontin;Enzyme-linked immunosorbent assay

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.018

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究（聯(lián)合專項2012FB059）

650101昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚/風(fēng)濕免疫科［索桂英（現(xiàn)在山東省淄博市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，255026）、付萍］

付萍，Email：cinafuping@hotmail.com

2014-04-09）

（本文編輯：吳曉初）