魏明 涂玲 梁穎紅 劉佳 龔艷杰 張俊華 張宜花

特應性皮炎患者外周血T細胞磷酸肌醇3激酶信號轉導通路的表達

魏明 涂玲 梁穎紅 劉佳 龔艷杰 張俊華 張宜花

目的 探討特應性皮炎（AD）患者外周血T細胞磷酸肌醇3激酶（PI3K）信號轉導通路活化情況及其臨床意義。方法 檢測38例AD患者的T細胞PI3K通路活性，健康對照組38例。外周血T淋巴細胞分離采用Rosettsep T細胞提取試劑盒提取，PI3K活性采用免疫沉淀和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），Akt及其磷酸化蛋白采用免疫印跡法，T細胞增殖采用噻唑藍（MTT），白細胞介素（IL）6和IL-10水平采用ELISA檢測。結果 新鮮分離的AD患者外周血T細胞PI3K和Akt活性均顯著高于健康對照組（P<0.05）。AD患者T細胞在體外培養(yǎng)24 h后PI3K和Akt活性與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），健康對照組T細胞用AD患者血清孵育24 h后PI3K和Akt活性顯著增高（P<0.05）。PI3K特異性抑制劑LY294002顯著抑制AD患者T細胞增殖［（123±25）%和（195±28）%，P<0.05］及分泌IL-6和IL-10分別為［（431±64）ng/L和（823 ± 128）ng/L，P<0.05］，［（120 ± 21）ng/L和（213 ± 35）ng/L，P<0.05］。新鮮分離的 AD 患者外周血T細胞PI3K和Akt活性與疾病嚴重程度指數(shù)（EASI）無相關。結論 AD患者外周血T細胞存在磷酸肌醇3激酶信號轉導通路活化異常，并與T細胞增殖和細胞因子分泌有關，提示AD患者外周血中可能存在激活該通路的血清因子。

皮炎，特應性；T淋巴細胞；信號傳導

特應性皮炎（AD）是一個慢性多因素的疾?。?］，病因尚不清楚，其發(fā)病機制至今尚未完全明確。在AD的發(fā)病機制中，T細胞可能起著關鍵作用［2-5］。磷酸肌醇3激酶（PI3K）是調控T細胞增殖、活化和遷移的關鍵信號蛋白，正常靜止的T細胞PI3K活性處于低水平狀態(tài)，只有在T細胞活化時PI3K活性才顯著升高。為此，我們通過檢測AD患者外周血T細胞PI3K信號通路活性情況，探討其在AD發(fā)病機制中的作用。

對象與方法

一、對象

2010年7月至2013年11月就診于我院門診的AD患者38例（兒童34例，成人4例自幼患?。糠蟇illiams特應性皮炎診斷標準［6］。其中男8例，女30例，年齡2～60歲，平均22.5歲，按照濕疹面積及嚴重程度指數(shù)（EASI）評分法［7］對AD患者病情嚴重程度進行評分，患者EASI評分為3.5～14.1分，平均（6.23±2.71）分。所有患者無其他明顯皮膚病變、自身免疫性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、肝病和腫瘤等病史。停用抗組胺藥2周以上，停用系統(tǒng)及局部糖皮質激素及其他免疫抑制劑1個月以上。健康對照組38例，來自我院健康體檢中心體檢健康者，其中男8例，女30例，年齡3～60歲，平均23.5歲。無家族過敏史，無明顯皮膚病變或內臟疾病史。兩組受試者性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義。本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

二、方法

1．外周血T細胞的分離和培養(yǎng)：抽取患者和對照組外周靜脈血6～8 ml，按Rosettsep T細胞提取試劑盒（加拿大StemCell Technologies公司）說明書分離T細胞。用抗CD3單抗（美國BD Pharmingen公司）在流式細胞儀上檢測T細胞純度，發(fā)現(xiàn)T細胞純度均在95%以上。把分離到的T細胞用RPMI 1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清（FBS，均購自美國Gibco公司）培養(yǎng)，并按實驗要求部分細胞用CD3單抗（5 ml/L，購自美國Biosciences公司）和 CD28單抗（5 mg/L）或 PI3K 抑制劑 LY294002（10 μmol/L，購自美國Chemicon公司）處理細胞。同時，用錐蟲藍拒染法檢測細胞活性，細胞活性均超過95%。

2．血清的制備和處理：常規(guī)收集血清后儲存于－80℃待用。為了解AD患者血清是否影響健康對照組，使用前把AD患者血清在56℃滅活30 min，然后離心除去沉淀物，備用。

3．提取細胞總蛋白：用冷1×PBS洗滌T細胞1次，加入50 μl SDS樣本裂解緩沖液A，勻漿后置冰上，超聲粉碎10～15 s，于95～100℃煮5 min，然后置冰上；850×g離心5 min，吸取上清，分裝儲存于－20℃。

4．PI3K活性檢測：2×106T細胞用無血清培養(yǎng)基洗滌后置于冰上，加2 ml冰緩沖液A（137 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L正釩酸鹽溶液），洗滌3次后加入0.5 ml裂解液，繼續(xù)置冰上20 min；裂解細胞后轉移至1 ml離心管離心10 min以沉淀未溶解物質，把離心后的上清轉至另一離心管；加入5 μl抗PI3K抗體，于4℃孵育1 h；然后加60 μl 50%蛋白A微珠（溶于PBS），混合后再于4℃孵育1 h；離心后所得沉淀物用50 mmol/L Tris-HC（lpH7.4）洗滌3次；然后按美國Echolon公司提供的試劑盒說明書操作，用ELISA法檢測PI3K活性。

5．免疫印跡法：把樣品蛋白于95～100℃煮5min，然后等量上樣于15%SDS-PAGE凝膠上進行電泳，用轉移緩沖液把凝膠上蛋白質轉移至醋酸纖維膜上，然后膜與不同濃度一抗于4℃孵育過夜，接著膜在室溫下與二抗孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液顯影，最后將結果進行圖像分析，計算吸光度（A）值，Akt活性以磷酸化AktA值/總AktA值之比表示。

6．噻唑藍（MTT）測定：為檢測T細胞增殖情況，將實驗分為3組，即單獨血清培養(yǎng)、CD3/CD28單抗刺激、CD3/CD28單抗刺激 +LY294002，每組均設3個復孔。把1×105T細胞在含100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液的96孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h。MTT比色法具體步驟見文獻［8］。

7．細胞因子水平檢測：按說明書步驟操作。

結 果

1．T細胞PBK信號通路活性情況：AD患者外周血T細胞PI3K活性（1.00%±0.81%）顯著高于健康對照組（0.50% ± 0.25%），t=2.417，P<0.05。AD患者外周血T細胞PI3K下游關鍵蛋白Akt活性（1.05%±0.78%）顯著高于健康對照組（0.49%±0.26%），t=2.435，P<0.05。

2．AD患者T細胞在含10%胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后PI3K通路活化情況：AD患者T細胞經(jīng)體外培養(yǎng)24 h后其PI3K和Akt活性為0.67%±0.36%和0.56%±0.32%，與健康對照組0.50%±0.25%和0.49%±0.26%比較，差異無統(tǒng)計學意義，t值分別為 1.028，1.061，均P＞ 0.05。

3．AD患者血清對健康對照組T細胞PI3K信號通路活性的影響：AD患者T細胞與其自身血清培養(yǎng)后，PI3K活性和Akt活性高于用健康對照組血清培養(yǎng)，均P＜0.05，見表1。健康對照組T細胞與AD血清培養(yǎng)后，PI3K活性和Akt活性亦明顯高于與其自身血清培養(yǎng)，均P＜0.05，見表1，提示AD患者血清中可能存在影響其T細胞PI3K通路異?；罨囊蛩?。

4．抑制PI3K通路活性對AD患者T細胞增殖的影響：PI3K特異性抑制劑LY294002+AD患者單獨血清培養(yǎng)T細胞增值率為63%±11%與單獨血清培養(yǎng)T細胞增值率123%±25%相比，t=2.687，P<0.05。PI3K特異性抑制劑LY294002+CD3/CD28單抗刺激的AD患者T細胞增殖率為125%±22%與CD3/CD28單抗刺激的AD患者T細胞增殖率195% ±28%，t=2.219，P<0.05。提示PI3K特異性抑制劑LY294002對單獨血清和CD3/CD28單抗刺激的AD患者T細胞增殖均有顯著地抑制作用。

5．抑制PI3K通路活性對AD患者T細胞分泌細胞因子的影響：PI3K特異性抑制劑LY294002+AD患者T細胞體外自發(fā)分泌IL-6和IL-10與無抑制劑體外培養(yǎng)相比，均P<0.05，見表2。PI3K特異性抑制劑LY294002+CD3/CD28單抗誘導的IL-6和IL-10與CD3/CD28單抗誘導相比，均P<0.05，見表2。提示PI3K特異性抑制劑LY294002對AD患者T細胞體外自發(fā)分泌和CD3/CD28單抗誘導的IL-6和IL-10均有顯著抑制作用。

6．AD患者T細胞PI3K通路活性與AD疾病嚴重程度積分的相關性：AD患者T細胞PI3K活性和Akt活性與AD疾病嚴重程度指數(shù)（EASI）均無相關關系，r值分別為0.25和0.29，P值分別為0.08和0.13。

表1 特應性皮炎（AD）患者和健康對照血清對T細胞PI3K信號通路活性的影響（%，±s）

表1 特應性皮炎（AD）患者和健康對照血清對T細胞PI3K信號通路活性的影響（%，±s）

注：a：與T細胞 +對照血清培養(yǎng)比較，t=2.032，P＜0.05；b：與T細胞+對照血清培養(yǎng)比較，t=2.472，P＜0.05；c：與T細胞 +自身血清培養(yǎng)比較，t=2.015，P＜0.05；d：與T細胞 +自身血清培養(yǎng)比較，t=2.496，P ＜ 0.05

組別 例數(shù)PI3K活性 AKt活性AD患者T細胞+自身血清培養(yǎng) 381.02±0.63a 1.12±0.59b T細胞+對照血清培養(yǎng) 380.62±0.27 0.53±0.26健康對照T細胞+AD患者血清培養(yǎng) 380.89±0.33c 1.03±0.56d 0.50±0.25 0.49±0.26 T細胞+自身血清培養(yǎng) 38

表2 抑制PI3K通路活性和CD3/CD28單抗對特應性皮炎（AD）患者T細胞分泌細胞因子的影響（±s）

表2 抑制PI3K通路活性和CD3/CD28單抗對特應性皮炎（AD）患者T細胞分泌細胞因子的影響（±s）

注：a：與無抑制劑AD患者T細胞培養(yǎng)比較，t=2.242，P＜0.05；b：與無抑制劑AD患者T細胞培養(yǎng)比較，t=2.013，P＜0.05；c：與CD3/CD28單抗誘導培養(yǎng)比較，t=2.429，P＜0.05；d：與CD3/CD28單抗誘導培養(yǎng)比較，t=2.143，P＜0.05

IL-6（ng/L） IL-10（ng/L）168±33a 56±14b 265±46 98±25 431±64c 120±21d 823±128 213±35組別 例數(shù)LY294002+AD患者T細胞培養(yǎng) 38無抑制劑AD患者T細胞培養(yǎng) 38 LY294002+CD3/CD28單抗誘導 38 CD3/CD28單抗誘導培養(yǎng) 38

討 論

PI3K是由調節(jié)亞基和催化亞基組成的異源二聚體，在靜息細胞中以無活性的P85-P110復合物存在于胞質中，當被激活后在細胞膜上生成（3，4，5）-磷酸化磷脂酰肌醇（PIP3），然后以此作為第二信使激活下游蛋白如Akt，從而誘導細胞內一系列信號蛋白變化，參與調控蛋白合成、肌動蛋白聚合、細胞生存和增殖等細胞生化過程［9］。Akt是PBK下游最為關鍵的信號蛋白。近年研究表明，PI3K信號通路不僅參與T細胞遷移，而且在CD3和（或）CD28介導的T細胞活化、增殖和存活中起著關鍵性的調節(jié)作用［10-11］。

本文結果顯示，AD患者新鮮分離的外周血T細胞PI3K和Akt活性顯著高于健康對照組。AD患者T細胞經(jīng)體外用胎牛血清孵育24 h后，原來增高的PI3K通路活性能夠被逆轉至正常水平；AD患者T細胞與健康對照組血清培養(yǎng)后，PI3K通路活性也顯著下降，而健康對照組T細胞與AD患者血清培養(yǎng)后其PI3K通路活性則明顯增高。提示AD患者外周血T細胞中異常增高的PI3K通路活性可能是繼發(fā)性的，可能與其血清中存在某種致病因子有關。有研究［12］發(fā)現(xiàn)，特應性皮炎患者急性皮損中Th17細胞可能通過增強Th2記憶細胞功能、促進角質形成細胞免疫活性，誘導TGF-1、IL-11、IL-6等炎癥因子表達，推測當PI3K被炎性因子激活后，可以將P2轉變成第二信使P3（也稱PIP3），PIP3可以和PKB的PH結構域結合，使PKB磷酸化，引起細胞核內靶基因的變化，從而參與特應性皮炎炎癥反應和組織重塑等生理病理過程。

為進一步探討AD患者外周血T細胞中PI3K通路活化的臨床意義，我們研究了PI3K通路與T細胞增殖、細胞因子分泌和AD疾病活動性的關系。結果顯示，通過特異抑制異常增高的PI3K活性可顯著抑制AD T細胞增殖和分泌IL-6和IL-10等細胞因子，提示AD患者外周血T細胞中PI3K通路異?；罨赡芘c其體內T細胞的內在活化有關。因此推測T細胞的病理性活化可能是AD發(fā)病機制中的關鍵環(huán)節(jié)，PI3K通路很可能是調節(jié)AD T細胞活性的重要靶點，通過抑制該通路活性可能有利于AD的治療。本研究未發(fā)現(xiàn)PI3K活性與AD活動指數(shù)存在相關性，或許與病例數(shù)偏少還是與其他原因有關，尚待進一步研究。

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Expression of the phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathway in peripheral blood T cells from patients with atopic dermatitis

Wei Ming*,Tu Ling,Liang Yinghong,Liu Jia,Gong Yanjie,Zhang Junhua,Zhang Yihua.*Department of Clinical Laboratory,Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

Wei Ming,Email:gushiweiming@126.com

Objective To estimate the activity of the phosphatidylinositol3-kinase（PI3K）signaling pathway in peripheral blood T cells from patients with atopic dermatitis （AD）,and to investigate its clinical significance.Methods T cells were isolated by using the Rosettsep T cell purification kit from the peripheral blood of 38 patients with AD and 38 healthy human controls,and classified into several groups to be treated with anti-CD3 monoclonal antibody,anti-CD28 monoclonal antibody,and LY294002 （an inhibitor of PI3K）respectively.The activity of PI3K signaling pathway in T cells was estimated by immunoprecipitation and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.Western blot was performed to measure the expressions of total Akt and phosphorylated Akt in T cells,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay to examine the proliferation of T cells,and ELISA to determine the levels of interleukin 6 （IL-6）and IL-10.Results The activity of PI3K and Akt was significantly higher in freshly isolated patient-derived T cells than in control-derived T cells （bothP<0.05）.However,the difference in the activity of PI3K and Akt between patient-derived and control-derived T cells disappeared （bothP>0.05）after 24-hourin vitroculture.The activity of PI3K and Akt in control-derived T cells was significantly increased after 24-hour incubation with sera from the patients with AD （bothP<0.05）.In addition,compared with patient-derived T cells treated with patients′sera or anti-CD3/CD28 monoclonal antibody alone,those treated with the combination of LY294002 and patients′sera or anti-CD3/CD28 monoclonal antibody showed a significant decrease in the proliferative activity（63%±11%vs.123%±25%,125%±22%vs.195%±28%,bothP<0.05）,supernatant levels of IL-6（（168 ± 33）vs.（265 ± 46）ng/L,（431 ± 64）vs.（823 ± 128）ng/L,bothP<0.05）and IL-10（（56 ± 14）vs.（98 ± 25）ng/L,（120 ± 21）vs.（213 ± 35）ng/L,bothP<0.05）.Eczema area and severity index （EASI）was unassociated with the activity of PI3K or Akt in fresh T cells from patients with AD （bothP>0.05）.Conclusions The PI3K signaling pathway is abnormally activated in peripheral blood T cells from patients with AD,which is associated with the proliferation of,as well as secretion of cytokines by,T cells,suggesting that there exist serum factors activating this pathway in peripheral blood of patients with AD.

Dermatitis,atopic;T-Lymphocytes;Signal transduction

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.009

450052鄭州大學附屬第五醫(yī)院檢驗科（魏明、涂玲、梁穎紅、龔艷杰、張俊華、張宜花），皮膚科（劉佳）

魏明，Email：gushiweiming@126.com

2014-02-26）

（本文編輯：吳曉初）