董慧君 曾憲卓 魯 菲 郭明輝 張 哲

（深圳愛生再生醫(yī)學科技有限公司，廣東 深圳518057）

隨著生物技術的飛速發(fā)展，單克隆抗體、細胞因子、疫苗和各種生物活性蛋白等生物制品在診斷和治療中應用日益廣泛，其需求量大大增加，因此，通過體外大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞生產(chǎn)生物制品技術的研究越來越受到青睞。CHO細胞是生產(chǎn)蛋白類生物制品最重要的表達系統(tǒng)，采用無血清培養(yǎng)CHO細胞相比含血清培養(yǎng)，能避免對實驗動物的傷害、潛在的污染源影響、不同批次血清間的生物活性和因子的不一致及價格高等諸多弊端，因而受到生物制藥領域的廣泛關注。

1 CHO細胞

CHO細胞即中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary Cell)，是最具代表性的動物細胞表達系統(tǒng)，被廣泛應用于生物制藥領域。它建株于1957年，由美國科羅拉多大學Theodore T.Puck從一成年雌性中國倉鼠卵巢中分離得到，是一種連續(xù)細胞系，能傳百代以上，具有永生性。后來陸續(xù)又有很多科學家用藥物加壓、極端條件篩選和誘導突變等方法篩選得到了一系列不同表型的CHO細胞株[1]，如DUKX-B11、DG-44和CHO-K1等。

CHO細胞能用于表達各種復雜的重組蛋白。據(jù)統(tǒng)計，70%以上的動物細胞表達藥物產(chǎn)品都是以CHO細胞為表達宿主[2]。2011年6月批準的27種單克隆抗體中，其中13種就是通過CHO細胞表達的，占了約50%的比例。

CHO細胞之所以成為最受歡迎的宿主細胞，主要在于其易于培養(yǎng)以及基因操作，而且相比其他表達系統(tǒng)，它還具有許多優(yōu)點[3-4]：①具有準確的轉錄后修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有產(chǎn)物胞外分泌功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；③具有外源重組基因的高效擴增和表達能力；④既可貼壁生長也可以進行懸浮培養(yǎng)，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，外源蛋白表達水平較高；⑤CHO細胞屬于成纖維細胞，很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的后分離。

2 無血清培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基是繼天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基之后的第三類培養(yǎng)基。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，無血清培養(yǎng)基不含動物血清或其他動物提取成分，但仍可滿足細胞在體外較長時間生長、繁殖的一種培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基和添加組分兩部分組成?；A培養(yǎng)基含有各種營養(yǎng)物質，能維持組織或細胞的生長、發(fā)育、遺傳、繁殖等一系列生命活動。目前應用最廣泛的是MEM、DMEM、RPMI1640等。添加組分為各種代替血清的因子總稱，主要包括促貼壁物質、生長因子與激素、酶抑制劑、結合蛋白以及微量元素等幾大類。這些因子既能滿足細胞的培養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素[5-6]。

3 無血清培養(yǎng)CHO細胞的研究進展

隨著生物制品的需求加大以及無血清培養(yǎng)基諸多優(yōu)勢，越來越多的生物制藥公司開始采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細胞，研制適合于CHO細胞生長和產(chǎn)物表達的低成本無血清培養(yǎng)基是生物制藥領域關注的熱點。

3.1 無血清培養(yǎng)基成分研究

無血清培養(yǎng)基的成分相對比較清楚，人們可根據(jù)培養(yǎng)目的及細胞種類的不同，對培養(yǎng)基成分進行調整優(yōu)化，以達到更好地培養(yǎng)目的。

研究證明，在無血清培養(yǎng)基中添加蛋白水解物可以提高最大細胞密度和生產(chǎn)效率。酵母水解物可作為一種低成本的無血清培養(yǎng)基添加物，用以成產(chǎn)人血小板生成素（hTPO）[7]。大豆水解物能較好地支持細胞生長和維持細胞活性[8]。Ballez等[9]研發(fā)出一種培養(yǎng)CHO-320細胞生產(chǎn)IFNγ的無蛋白培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中添加了大米水解物，最終最大細胞密度能提高25%，IFNγ濃度能提高60%。

還有研究評價激素、脂類及微量元素等成分對無血清培養(yǎng)CHO細胞的影響。趙麗麗等[10]以表達重組TNFR-Fc融合蛋白的CHOK1細胞為研究對象，確定大豆蛋白水解物和酵母提取物的混合物、地塞米松及脂肪乳劑這幾種關鍵組分對培養(yǎng)基的影響，為適合于細胞生長和產(chǎn)物表達的低成本無血清培養(yǎng)基的研制提供了參考。張大鶴等[11]研制出兩種適于重組CHO-K1細胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。微量元素完全可以替換無血清培養(yǎng)基中的蛋白，支持細胞生長和促進蛋白表達。通過優(yōu)化調整其他營養(yǎng)物質，去除蛋白水解物，且不需添加任何小肽化合物后，仍能支持高密度的CHO細胞培養(yǎng)。

添加氨基酸有利于維持細胞活性與抗體合成；添加B族維生素能促進細胞生長并延長培養(yǎng)時間；葡萄糖濃度較高時會抑制細胞生長，而濃度較低時又不能有效支持細胞的生長與抗體的合成，因此需要維持適當?shù)臐舛?。通過合理調整這幾類營養(yǎng)物的濃度配比形成的優(yōu)化無蛋白培養(yǎng)基，可使培養(yǎng)的CHO細胞最高密度達到52.6×105cells/mL，抗體產(chǎn)量達到274mg/L，與初始培養(yǎng)基相比分別提高了33%和63%[12]。

通過對無血清培養(yǎng)基成分的適當調整和改進，可以實現(xiàn)對某一類細胞或細胞產(chǎn)物快速、專一的培養(yǎng)目的，如何將這些改進應用到大規(guī)模生產(chǎn)中還需要進一步的研究。

3.2 適用于懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基

懸浮培養(yǎng)是哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)研究和應用的重要模式和首要選擇[13-14]。CHO細胞為貼壁依賴性細胞，進行懸浮培養(yǎng)面臨的最大問題就是細胞易集結成團使得細胞生長緩慢，且細胞團中央細胞因營養(yǎng)不足而容易凋亡。對于CHO細胞的懸浮培養(yǎng)而言，培養(yǎng)基是影響細胞生長和目標表達產(chǎn)物生產(chǎn)的最重要因素之一。目前已有適于CHO細胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的商業(yè)化無血清培養(yǎng)基，但存在成分復雜、不明確及知識產(chǎn)權問題，影響培養(yǎng)基的進一步優(yōu)化，且價格昂貴成本高，因此開發(fā)基于懸浮培養(yǎng)工藝的個性化無血清培養(yǎng)基至關重要。

研究發(fā)現(xiàn)腐胺、胰島素及轉鐵蛋白對11G-S細胞的懸浮培養(yǎng)具有明顯的生長促進作用，劉興茂等[15]選擇商業(yè)化的DMEM/F12(1∶1,V/V)為無血清培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基，并選取了腐胺、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、β-巰基乙醇等常用添加劑，得到SFM-CHO-S無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)效果優(yōu)于商品化的同類無血清培養(yǎng)基。郭紀元[16]從CHO細胞培養(yǎng)基庫中篩選得到無血清基礎培養(yǎng)基BM，在此基礎上調整酵母水解物、硫酸葡聚糖、檸檬酸鐵及起始葡萄糖與氨代謝相關氨基酸濃度，獲得其個性化無血清培養(yǎng)基Opti-BM，并研發(fā)得到相應的流加懸浮培養(yǎng)基FM與FM plus。

孫亞婷[17]研制出PFIA無血清無蛋白培養(yǎng)基，比HyQ和Ex-302兩種商業(yè)無血清培養(yǎng)基效果好，可作為后續(xù)流加培養(yǎng)的初始培養(yǎng)基。謝奎[18]獲得自主知識產(chǎn)權的無血清培養(yǎng)基，經(jīng)驗證蛋白表達結果優(yōu)于商業(yè)化培養(yǎng)基CD DG44，接近商業(yè)培養(yǎng)基P8，且成本節(jié)約一半以上。Zhang等[19]以表達重組TNFR-Fc融合蛋白的CHO-GS細胞為研究對象，以DMEM：F12：RPMI1640(2：1：1)為基礎培養(yǎng)基，通過調整添加氨基酸、胰島素、轉運蛋白及Pluronic F68，并結合流加培養(yǎng)工藝，研制出適合CHO懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。

4 結語

隨著重組蛋白、單克隆抗體及病毒疫苗需求量的加大，動物細胞無血清培養(yǎng)基的研究越來越多，也取得很大進展。隨著對細胞營養(yǎng)與代謝、細胞周期、細胞凋亡、信號轉導以及外源蛋白表達機制等各方面機理的深入研究，以及蛋白質組學和代謝組學技術[20]在細胞培養(yǎng)基設計和研究上的應用，必將為進一步推進哺乳動物細胞無血清培養(yǎng)基的開發(fā)，從而使細胞培養(yǎng)技術在生物制備、基因工程、細胞移植等領域得到更安全、更低成本和更廣泛的應用。

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