潘之 馬天驕 肖輝 趙敏 馬燕雪 楊桂蘭

自噬在銀屑病角質(zhì)形成細胞中的水平及病理意義

潘之 馬天驕 肖輝 趙敏 馬燕雪 楊桂蘭

自噬是真核細胞中普遍存在的現(xiàn)象，自噬水平的異常已被證明與諸多疾病存在關(guān)聯(lián)。研究表明，自噬水平下降與細胞異常增殖、分化及炎癥密切相關(guān)，而銀屑病皮損中存在細胞增殖、分化與免疫調(diào)節(jié)異常，表明銀屑病發(fā)病機制與角質(zhì)形成細胞自噬水平異常可能存在一定的聯(lián)系。近年來的研究提示，銀屑病角質(zhì)形成細胞中自噬的水平異?？赡軈⑴c了銀屑病病理機制的形成。概述自噬與細胞增殖、分化及炎癥的關(guān)系、銀屑病角質(zhì)形成細胞的病理狀態(tài)以及正常角質(zhì)形成細胞與銀屑病角質(zhì)形成細胞中的自噬的相關(guān)研究。

銀屑??；自噬；角蛋白細胞；病理學

本文主要縮寫：LC3：微管相關(guān)蛋白輕鏈3，Atg：自噬相關(guān)基因，CCL：趨化因子配體，GFP：綠色熒光蛋白常，這些研究提示自噬水平異?？赡茉阢y屑病發(fā)病機制中發(fā)揮了一定作用。

1 自噬與細胞增殖、分化及炎癥的關(guān)系

1.1 自噬與細胞增殖：研究表明，自噬與細胞增殖存在聯(lián)系。Eskelinen等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的動物細胞（包括正常鼠腎臟細胞、HeLa細胞、小鼠胚胎成纖維細胞等）中，自噬泡的形成由細胞周期嚴格控制。他們發(fā)現(xiàn)在由諾考達唑（nocodazole）導致的細胞分裂停滯在前中期時，自噬泡的形成被明顯抑制，這種狀態(tài)在分裂中期及后期也會出現(xiàn)，并且營養(yǎng)缺乏并不能使分裂間期細胞的自噬增加，但自噬泡在細胞分裂末期核膜封閉后又會重新出現(xiàn)。從而認為有絲分裂強烈抑制自噬。

Wang等［6］認為，可能存在一種有效的機制將自噬與細胞生長（包括細胞增大及分裂）聯(lián)系起來，其中之一水平上升可引起另一種水平下降，由此防止營養(yǎng)與能量的浪費。自噬可以抑制細胞生長并促進細胞在應(yīng)激狀態(tài)下存活。Fimia等［7］利用大鼠模型實驗表明，自噬相關(guān)蛋白（如Ambra1）的缺失可導致細胞增生加快。自噬的減少可能會導致不正常的細胞周期調(diào)控因子如周期素依賴性蛋白激酶抑制因子的產(chǎn)生，使細胞進入不正常的細胞周期［6］。

在涉及角質(zhì)形成細胞的研究中，Lee等［8］研究表明，巨噬細胞活化脂肽2誘導角質(zhì)形成細胞增殖后，抑制支架蛋白p62的表達，引起了呈時間依賴性的角質(zhì)形成細胞的增殖抑制。此外，用對p62特異的shRNA轉(zhuǎn)染人原代角質(zhì)形成細胞可顯著減少細胞周期素D1、細胞周期素依賴性激酶4和Akt（即蛋白激酶B）的磷酸化作用，提示p62在角質(zhì)形成細胞增殖及細胞周期進程起重要作用。研究還證明，自噬與p62的表達負相關(guān)，提示自噬可抑制角質(zhì)形成細胞增殖。

1.2 自噬與細胞分化：自噬與細胞分化間的關(guān)系尚未完全闡明。微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）及LC3-Ⅱ被認為是自噬的特異標記物，LC3在細胞自噬的過程中起作用，并可進一步生成LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ可附著于自噬體上。研究證明，在一些應(yīng)激條件下，如細胞饑餓、缺氧等，LC3及LC3-Ⅱ的水平可升高［9］。

Salemi等［10］利用透射電鏡發(fā)現(xiàn)，相比 NB4 細胞，在表皮干細胞、真皮干細胞和造血干細胞中，有大量自噬泡存在。利用共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，在NB4細胞有微弱而分散的LC3及自噬相關(guān)基因（Atg）5的表達，而在以上3種干細胞中顯示更多的光斑。用免疫印跡法檢測干細胞中有LC3-II，但無p62表達，在分化不成熟的此類細胞中，有p62和相對較少的LC3-II表達，在分化的細胞中還有更少的Atg-5和Beclin1表達。使用Atg-5 shRNA阻斷自噬的形成，導致了這些干細胞自我更新的能力下降。使用3甲基腺嘌呤和Atg-5 shRNA阻滯自噬會導致3種干細胞分化能力下降?？傊?，成人皮膚及造血干細胞的自噬水平降低可導致其自我更新和分化的能力下降。在自噬被抑制時，這些細胞將不再顯示出多向分化的潛質(zhì)。

在涉及角質(zhì)形成細胞的研究中，Rossiter等［11］利用HE染色、透射電鏡、免疫染色、Western印跡等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Atg-7表達缺陷的小鼠除了背部角質(zhì)形成細胞層增厚之外，耳與尾部的角質(zhì)形成細胞的角化完全正常。此外Atg-7表達缺陷的小鼠表皮中的自噬抑制并沒有打亂角質(zhì)形成細胞中角蛋白5、角蛋白6、角蛋白10和絲聚合蛋白等分化標記物的表達。研究提示，有自噬現(xiàn)象的角質(zhì)形成細胞和自噬缺陷的角質(zhì)形成細胞的分化差異較小。

在Haruna等［12］使用鈣離子誘導人類正常角質(zhì)形成細胞分化后，采用Western印跡和免疫組化的方法檢測LC3水平，發(fā)現(xiàn)誘導分化后7 d內(nèi)的LC3水平升高呈時間依賴性。細胞被收集前的6 h和24 h在誘導分化的角質(zhì)形成細胞中加入E64d和胃酶抑素A（溶酶體蛋白酶抑制劑）后，自噬對LC3-Ⅱ的降解被明顯抑制。與未分化的狀態(tài)相比，分化的角質(zhì)形成細胞中LC3-Ⅱ聚集更明顯。使用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞在誘導分化的7 d后，LC3陽性光斑明顯增多，提示與未分化的角質(zhì)形成細胞相比，分化的角質(zhì)形成細胞中有更多的自噬體聚集。

1.3 自噬與炎癥：近年來的研究表明，自噬在炎癥調(diào)控、感染控制、對病原體的免疫反應(yīng)中作用顯著，這些研究提示，自噬是疾病病理機制的重要調(diào)節(jié)因素。自噬的細菌清除作用，可能在細菌感染性疾病中具有保護作用。在涉及炎癥損傷的研究表明，自噬可能具有下調(diào)促炎癥細胞因子的功能，可能在細菌感染的炎癥性疾病中具有保護作用［13］。

在涉及角質(zhì)形成細胞的研究中，Lee等［8］發(fā)現(xiàn)，對自噬的阻斷會顯著增強人角質(zhì)形成細胞中炎癥因子和支架蛋白p62的表達。在角質(zhì)形成細胞中，使用3甲基腺嘌呤和巴佛洛霉素A1分別干擾早期和晚期自噬，或使用針對重要Atg的siRNA（如巴佛洛霉素A1，hAtg5）阻斷Atg表達后，炎癥反應(yīng)會增強，細胞增殖也會增加。他們發(fā)現(xiàn)，用特定的siRNA阻斷p62的表達后，減少了角質(zhì)形成細胞中炎癥因子相關(guān)基因和抑菌肽的表達，并延緩了細胞增殖，減輕了核因子κB啟動因子的作用。已有證據(jù)表明，自噬通過調(diào)控重要的銜接蛋白（如p62）的效應(yīng)調(diào)控細胞穩(wěn)態(tài)和信號通路［14］。還有研究表明，對自噬抑制造成了轉(zhuǎn)染細胞中p62的聚集，可與清除泛素-蛋白酶體底物的作用相抵消［15］。p62是自噬在細胞內(nèi)的重要吞噬目標。

2 銀屑病角質(zhì)形成細胞的病理狀態(tài)

2.1 銀屑病角質(zhì)形成細胞的增殖：角質(zhì)形成細胞的細胞周期縮短、增殖加速是銀屑病的重要機制。在Weinstein 和 Frost［16］利用放射性自顯影技術(shù)發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損的細胞周期明顯縮短，他們檢測出了分裂的角質(zhì)形成細胞各期的時間，發(fā)現(xiàn)正常表皮細胞與銀屑病表皮細胞的細胞周期時間差異主要在G1期，其余各期差異相對較小。表明在銀屑病皮損中，有絲分裂的細胞增多，細胞周期縮短，增殖加速。

2.2 銀屑病角質(zhì)形成細胞的分化：銀屑病皮損中存在分化不完全的角質(zhì)形成細胞，銀屑病皮損鱗屑即是由未完全分化的角質(zhì)形成細胞構(gòu)成的角質(zhì)層，在這些細胞中細胞核依然殘存。正常角質(zhì)形成細胞終末分化由表皮顆粒層開始，但在銀屑病皮損中顆粒層明顯變薄甚至消失。在銀屑病中還存在多種分化標志物的異常表達，如過度增殖相關(guān)的角蛋白6和16、基底層特異表達的角蛋白5、14表達增加。而與細胞成熟相關(guān)的角蛋白1和10減少并延遲表達。此外尚有微弱而分散的源自透明角質(zhì)的絲聚合蛋白表達［17］。

2.3 銀屑病角質(zhì)形成細胞與炎癥：銀屑病是免疫介導的，以過度增殖為特點的炎癥性疾病。引起銀屑病皮損的是由不同類型細胞相互作用形成的復雜慢性炎癥網(wǎng)絡(luò)。一旦銀屑病皮損臨近具有異常遺傳基礎(chǔ)的T細胞被激活，一個由細胞因子、趨化因子及生長因子組成的復雜網(wǎng)絡(luò)就會啟動，形成惡性循環(huán)，使T細胞和樹突細胞被反復激活。最終表皮增厚、鱗屑產(chǎn)生、血管增生形成斑塊，與之相伴隨的是CD8+T細胞和中性粒細胞浸潤。但目前對于銀屑病皮損過程中T細胞激活的確切機制尚不明確。已證明多種炎癥因子、趨化因子及生長因子參與了銀屑病的形成，細胞因子包括腫瘤壞死因子α、干擾素γ、白細胞介素（IL）1、IL-8等，趨化因子包括趨化因子配體（CCL）3、CCL4、CCL5 等，生長因子包括轉(zhuǎn)化生長因子α、胰島素樣生長因子1、角質(zhì)形成細胞生長因子等［18］。近年來，銀屑病發(fā)病機制中的IL-17、IL-22、IL-23、核因子 κB 等因子［19］是研究的熱點。

3 正常角質(zhì)形成細胞與銀屑病角質(zhì)形成細胞中的自噬

3.1 自噬在正常角質(zhì)形成細胞中的可能狀態(tài)：用綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)染LC3后，使用熒光顯微鏡定位LC3是重要的自噬檢測方法［10］。而目前已培育出了GFP-LC3轉(zhuǎn)基因鼠，可作為研究自噬的動物模型［20］。Rossiter等［11］利用 Cre/LoxP 技術(shù)使 GFP-LC3轉(zhuǎn)基因的鼠系與Atg7表達缺陷的鼠系雜交，培育出了GFP-LC3 Atg7Δepi小鼠與GFP-LC3 Atg7 F/F小鼠，并使用Western印跡及熒光分析分別檢測LC3與GFP-LC3，發(fā)現(xiàn)無Atg7表達缺陷的小鼠表皮中的自噬持續(xù)活躍，反之Cre/LoxP技術(shù)可使小鼠表皮中Atg7的表達顯著下降，使自噬體的形成受阻，提示自噬在正常角質(zhì)形成細胞中持續(xù)活躍。

3.2 自噬在銀屑病角質(zhì)形成細胞中的狀態(tài)及作用：Haruna等［12］檢測出了銀屑病皮損中LC3與正常表皮相比水平下降。認為皮膚顆粒層的自噬可能對于角質(zhì)形成細胞正常分化起到了一定作用。

在Lee等［8］的研究中，發(fā)現(xiàn)自噬通過支架蛋白p62負向調(diào)節(jié)銀屑病角質(zhì)形成細胞的炎癥反應(yīng)，對于阻止人類角質(zhì)形成細胞中過度的炎癥反應(yīng)和誘導產(chǎn)生抑菌肽至關(guān)重要。他們發(fā)現(xiàn)，阻斷自噬的形成，使得人角質(zhì)形成細胞中炎癥因子和p62表達顯著上升，從反面證明了自噬對于角質(zhì)形成細胞中的p62和炎癥的抑制作用。通過RNA干擾抑制p62表達減少了角質(zhì)形成細胞中核因子κB的激活、炎癥因子的產(chǎn)生、抑菌肽的表達和細胞增生。進一步發(fā)現(xiàn)，在銀屑病表皮中表達的p62與正常皮膚相比明顯下降。

4 結(jié)語

銀屑病皮損中存在復雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)，正常分化的角質(zhì)形成細胞中有更多的自噬體聚集，而銀屑病角質(zhì)形成細胞未完全分化，均提示自噬可能在銀屑病角質(zhì)形成細胞中水平下降。在直接涉及自噬與銀屑病的研究中，Haruna等［12］證明，自噬體標志蛋白LC3的水平在銀屑病皮損中下降，并認為表皮顆粒層的自噬可能對角質(zhì)形成細胞正常分化起一定的作用。 Lee等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，自噬通過支架蛋白p62負向調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞炎癥反應(yīng)，而p62在角質(zhì)形成細胞增殖及細胞周期進程中起重要作用。這些研究也提示了銀屑病角質(zhì)形成細胞自噬水平可能下降，并與其異常增殖、分化及皮損炎癥有關(guān)。自噬與銀屑病角質(zhì)形成細胞的研究尚待進一步深入。

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Levels of autophagy in psoriatic keratinocytes and its pathological role

Pan Zhi,Ma Tianjiao,Xiao Hui,Zhao Min,Ma Yanxue,Yang Guilan.Department of Dermatology,Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command,Lanzhou 730050,China

Autophagy is a general phenomenon in eukaryotic cells,and it has turned out that dysregulated autophagy contributes to the development of many diseases.Researches have indicated that downregulation of autophagy is closely related to abnormal cell proliferation,differentiation and inflammation.It has been found that abnormal cell proliferation,differentiation and immune regulation exist in skin lesions of psoriasis.These findings suggest a link between the pathogenesis of psoriasis and dysregulated autophagy in keratinocytes,and recent studies have shown that abnormal keratinocyte autophagy may be involved in the pathological mechanism in psoriasis.This review presents recent advances in studies on the relationship of autophagy with cell proliferation,differentiation and inflammation,pathological state of psoriatic keratinocytes,autophagy in normal keratinocytes and psoriatic keratinocytes.

Psoriasis;Autophagy;Keratinocytes;Pathology

Yang Guilan,Email:drgly2006@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.02.010

730050蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院皮膚科

楊桂蘭，Email:drgly2006@126.com

2014-04-09）

自噬是廣泛存在于真核細胞中的現(xiàn)象，是細胞內(nèi)主要的降解途徑，其不僅可清除細胞內(nèi)的某些物質(zhì)，還可作為動態(tài)的循環(huán)機制，產(chǎn)生新的物質(zhì)與能量，維持細胞的更新與穩(wěn)態(tài)［1］。但目前對自噬的認識已從對細胞穩(wěn)態(tài)的維持拓展為對生理病理過程的調(diào)控，包括自噬在炎癥與應(yīng)激狀態(tài)下的作用［2］。已證明，自噬水平異常與諸多疾病存在聯(lián)系，如阿爾茨海默病、腫瘤、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、2型糖尿?。?，3-4］。炎癥、表皮過度增殖和表皮中伴有角化不全的異常分化是銀屑病的發(fā)病機制中存在的既獨立又相互聯(lián)系的生物學過程。相關(guān)研究已表明，自噬水平下降與細胞異常增殖、分化、炎癥存在關(guān)聯(lián)，而銀屑病角質(zhì)形成細胞也存在細胞增殖、分化與免疫的異