楊依依，王青，牛海軍，馮前進，陳武凡

關(guān)節(jié)軟骨是一種表面光滑、富有彈性的結(jié)締組織，可減少運動過程中骨面之間的摩擦，能夠最大限度地吸收、緩沖應(yīng)力作用[1]。關(guān)節(jié)軟骨主要由大量細(xì)胞外基質(zhì)與散在分布其中的軟骨細(xì)胞組成，主要成分包括水(占軟骨組織凈重的60%～80%)、蛋白多糖(proteoglycan，占5%～10%)、膠原蛋白(collagen，占10%～20%)。軟骨基質(zhì)成分丟失和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞是骨性關(guān)節(jié)炎的早期病理特征[2]。蛋白多糖是由大量的聚氨基葡萄糖通過連接蛋白連接于透明質(zhì)酸鏈上，可吸引大量水分子形成凝膠，具有良好的彈性和膨脹能力。胰蛋白酶是一種蛋白溶解酶，能降解軟骨內(nèi)的蛋白多糖，從而破壞軟骨的水合功能，使關(guān)節(jié)軟骨失去彈性和抗壓性。軟骨成分改變可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退化，表現(xiàn)為軟骨組織結(jié)構(gòu)及其生物力學(xué)、組織學(xué)、生物化學(xué)性質(zhì)改變[3-4]。本研究應(yīng)用高頻超聲測量技術(shù)觀察了蛋白多糖降解導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨水合膨脹行為的改變，旨在探討蛋白多糖對軟骨水合作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取12塊成年豬的新鮮髕骨，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑無破損，置于–20℃冰箱保存待用。以髕骨的外側(cè)部分作為超聲掃描部位。

實驗前，將樣本置于磷酸緩沖溶液(PBS)中解凍2h(室溫保持25℃)。將12塊豬髕骨軟骨樣本隨機均分為2組：正常組作為參考樣本，不做任何處理；胰蛋白酶消化組在0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液中浸泡8h，以消化軟骨組織內(nèi)的蛋白多糖，建立蛋白多糖降解軟骨的離體退化模型，模擬自然骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨退化。消化過程在37℃恒溫箱內(nèi)進行，消化完成后使用pH 7.4的PBS沖洗3次，然后進行超聲掃描測量。

1.2 儀器與方法 采用開放式綜合A型超聲測量實驗系統(tǒng)。該系統(tǒng)由脈沖發(fā)射/接收儀(Olympus，Model 5800)、聚焦換能器(Panametrics，中心頻率為25MHz)、12位的模數(shù)(A/D)采集卡(Gage，CompuS-cope 12400)及一臺計算機(Lenovo)組成。掃描軟骨樣本時，先調(diào)整探頭位置，使超聲波垂直入射軟骨組織，以獲得清晰且幅度較大的回波信號。從軟骨表面、組織內(nèi)部及軟骨與骨的交界面反射的回波被超聲脈沖發(fā)射接收器接收放大后，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換卡將模擬信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，通過GageScope信號采集處理軟件(ver.3.80.02，Gage，Canada)進行實時顯示，并自動存儲到計算機硬盤，用于后續(xù)的離線數(shù)據(jù)分析。同時由A型超聲信號的時間序列重建M型超聲圖像，可觀察軟骨組織隨深度及時間的變化。

1.3 超聲檢測 將樣品固定在容器底部，用生理鹽水將其完全浸泡，觀測所記錄的A型超聲信號，信號無波動則表明軟骨在生理鹽水中達到平衡狀態(tài)。然后，先用針管抽凈生理鹽水，再用紙巾吸干軟骨表面的水分，將樣本于空氣中暴露40min(保持恒溫不變)。之后重新在容器中加入生理鹽水，整個換液過程在30s內(nèi)完成，之后以1幀/s的采樣頻率采集超聲回波信號，連續(xù)記錄40min后，軟骨達到平衡狀態(tài)。

1.4 參數(shù)計算 利用跟蹤窗口選擇感興趣的超聲回波信號(即軟骨表面回波)，應(yīng)用互相關(guān)算法計算超聲波在水合過程中的時間偏移量ΔT，通過公式Δh=vsΔT/2可計算得到軟骨表面位移(Δh)值，其中vs為超聲在生理鹽水中的聲速，即1532m/s。通過超聲在軟骨組織中的聲速vc及傳播時間T可計算得到軟骨的厚度(h0)。h0=vcT/2，其中vc為1675m/s。軟骨的水合應(yīng)變ε可通過公式ε=Δh/h0計算獲得。

本實驗中后期數(shù)據(jù)處理及參數(shù)提取均采用自編的Matlab 7.0程序來完成。

1.5 病理組織學(xué)評價 超聲測量后的樣品保存于福爾馬林溶液中，待病理組織學(xué)分析。

將正常和退化后的軟骨樣本經(jīng)洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟制成厚約5μm的石蠟切片，進行番紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察其組織結(jié)構(gòu)的變化，確定軟骨的退化程度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以s表示，應(yīng)用非參數(shù)統(tǒng)計方法排除因樣本量小帶來的“隨機顯著性”[5]，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 水合應(yīng)變測定結(jié)果 經(jīng)胰蛋白酶消化后，胰蛋白酶消化組的軟骨組織厚度為1.34±0.04mm，與正常組(1.34±0.07mm)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但胰蛋白酶消化組軟骨組織的平衡應(yīng)變值為1.8%±0.2%，明顯低于正常組(3.5%±0.5%，P＜0.05)。

M型超聲圖像可顯示，與正常組比較，胰蛋白酶消化組水合膨脹幅度明顯下降(圖1)。跟蹤軟骨表面的超聲回波信號，繪制出軟骨表面隨時間變化的水合膨脹動態(tài)應(yīng)變，結(jié)果顯示，正常組的軟骨組織大約20min時達到平衡狀態(tài)，而胰蛋白酶消化組在大約5min時即迅速達到平衡(圖2)。

2.2 病理組織學(xué)檢查結(jié)果 光鏡觀察顯示，正常組軟骨的蛋白多糖被番紅染成紅色，可見較多均勻一致的紅色區(qū)域；蛋白多糖降解后(胰蛋白酶消化組)的關(guān)節(jié)軟骨在軟骨下層部分呈紅色，提示有部分蛋白多糖存在，而軟骨中上層番紅染色減少，可見軟骨細(xì)胞破壞，提示軟骨蛋白多糖減少，軟骨細(xì)胞破壞(圖3)。

圖1 兩組關(guān)節(jié)軟骨水合膨脹的M型超聲圖像Fig. 1 M-mode ultrasound image of hydration progress of articular cartilages

圖2 正常組及胰蛋白酶消化組關(guān)節(jié)軟骨的動態(tài)應(yīng)變曲線Fig. 2 Dynamic strain curve of articular cartilages in normal group and trypsin group

圖3 正常組及胰蛋白酶消化組關(guān)節(jié)軟骨番紅染色(×100)Fig. 3 Articular cartilages in normal group and trypsin group(Safranine O staining ×100)

3 討 論

軟骨的蛋白多糖具有完整的化學(xué)結(jié)構(gòu)，即一個或多個糖胺聚糖匯聚在一個蛋白質(zhì)核心上形成蛋白多糖，蛋白多糖結(jié)合透明質(zhì)酸形成蛋白多糖聚合物[6]，糖胺聚糖中的負(fù)電荷在基質(zhì)中則起著吸收和保持水分的作用。關(guān)節(jié)軟骨的滲透性膨脹行為與Donnan滲透壓下的水分含量和離子擴散緊密相關(guān)[7-8]，并表現(xiàn)出“過激松弛”的現(xiàn)象[9]。本研究超聲檢測發(fā)現(xiàn)，軟骨脫水后的水合逐漸達到滲透性膨脹平衡而未表現(xiàn)出“過激松弛”現(xiàn)象。這種差異可能是由于軟骨層中水分蒸發(fā)以及細(xì)胞外溶液中離子交換引起的溶液濃度改變所致。本研究結(jié)果表明，當(dāng)正常的軟骨組織放入生理鹽水后，蛋白多糖對軟骨的水合及脫水后恢復(fù)原狀具有重要作用，蛋白多糖、離子和水之間的相互作用對關(guān)節(jié)軟骨的機械力學(xué)性能具有重要影響。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，脫水后的軟骨組織容易發(fā)生損傷的原因之一是軟骨中缺乏流體支撐[10]。

蛋白多糖降解可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的滲透膨脹性能下降[11-12]。研究顯示，降解后的蛋白多糖變得不穩(wěn)定，并容易從基質(zhì)中流失，隨著蛋白多糖的缺失，基質(zhì)對水分的吸收及保持性能均下降[6]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，糖胺聚糖的缺失可能只是影響軟骨水合特性的因素之一[13]，蛋白多糖降解和膠原網(wǎng)架破壞均可導(dǎo)致軟骨滲透性升高，故退化的軟骨中水分含量增加[14-15]。在骨性關(guān)節(jié)炎中，關(guān)節(jié)軟骨水分含量的改變通常與細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖和膠原蛋白的含量及結(jié)構(gòu)變化相關(guān)。為探討蛋白多糖缺失對軟骨水合的影響，本研究利用胰蛋白酶消化軟骨中的蛋白多糖，觀察經(jīng)軟骨表面水分蒸發(fā)引起軟骨脫水后兩組樣本的水合特性，結(jié)果顯示，蛋白多糖缺失可導(dǎo)致軟骨水合膨脹性能顯著降低。

高頻超聲可用于測量正常與退化關(guān)節(jié)軟骨的滲透性膨脹行為[9,11-12,16]。本研究應(yīng)用超聲檢測軟骨的水合行為，跟蹤變形組織，獲取動態(tài)應(yīng)變曲線和平衡應(yīng)變值，定量評價蛋白多糖對軟骨水合功能的影響。超聲測量系統(tǒng)可非接觸、無創(chuàng)地實時評估關(guān)節(jié)軟骨組織的力學(xué)性能，在活體及體外原位測量中具有明顯優(yōu)勢。本研究應(yīng)用瞬態(tài)超聲測量技術(shù)監(jiān)測外部環(huán)境變化引起的關(guān)節(jié)軟骨水合膨脹行為，結(jié)果顯示，M型超聲圖像可清晰顯示脫水后軟骨的水合膨脹過程，利用互相關(guān)算法跟蹤軟骨表面的超聲回波，可獲取在水合過程中組織的膨脹程度，并計算動態(tài)應(yīng)變和平衡應(yīng)變。

綜上所述，本研究通過高頻超聲系統(tǒng)，探討了蛋白多糖對軟骨水合膨脹的影響。該結(jié)果對關(guān)節(jié)軟骨生物力學(xué)性能研究、軟骨病變檢測及人工關(guān)節(jié)軟骨材料的研制均具有一定參考價值，同時對關(guān)節(jié)炎的早期診斷也具有潛在的應(yīng)用價值。

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