胡丹丹，王付才，張震宇，孫付保，周邦煒（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室和糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

無外源脯氨酸發(fā)酵產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸重組大腸桿菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化

胡丹丹，王付才，張震宇*，孫付保，周邦煒
（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室和糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

為實現(xiàn)無外源脯氨酸的條件下直接從葡萄糖轉(zhuǎn)化生成反式-4-羥脯氨酸，本實驗采用定點突變和基因共表達的方法構(gòu)建重組大腸桿菌：首先對L-脯氨酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶谷氨酸激酶進行定點突變E143A、K145A，以增強L-脯氨酸生物合成能力；然后引入脯氨酸4-羥化酶基因，通過兩個基因的共表達可以實現(xiàn)從葡萄糖到反式-4-羥脯氨酸的連續(xù)轉(zhuǎn)化，而不再需要添加外源L-脯氨酸。得到的L-脯氨酸生物合成能力增強的菌株在搖瓶階段L-脯氨酸的產(chǎn)量可達到1.4 g/L；proBA2與hyp雙基因共表達菌株的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為98.9 mg/L，比原始菌株提高了一倍，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后得到培養(yǎng)基為：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨15 g/L，硫酸亞鐵3 mmol/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，氯化鈣0.015 g/L，在這個培養(yǎng)條件下反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量為220.0 mg/L，比優(yōu)化前提高1.2倍。

脯氨酸4-羥化酶，反式-4-羥脯氨酸，L-脯氨酸，谷氨酸激酶，共表達

反式-4-羥基-L-脯氨酸（trans-4-hydroxy-L-proline，Hyp，反式-4-羥脯氨酸）是一個重要的手性合成元件，是合成某些化學(xué)藥物的重要前體物［1-2］，還是合成其他羥脯氨酸同分異構(gòu)體的重要起始原料［2-3］。傳統(tǒng)生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的方法主要是水解動物膠原蛋白，隨著基因工程等技術(shù)的發(fā)展，其生產(chǎn)方法也有了很大的進步。1995年，Serizawa等［4］開創(chuàng)了利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的先河；2000年，Shibasaki等［2］構(gòu)建的生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的重組E.coli W1485發(fā)酵罐培養(yǎng)100 h的產(chǎn)量達到41 g/L；2014年，劉合棟等［5］構(gòu)建的生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的重組E.coli BL21（DE3）發(fā)酵罐水平的產(chǎn)量達到42.5 g/L。這些研究中均需要添加外源脯氨酸來生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸，生產(chǎn)成本較高。

微生物體內(nèi)合成L-脯氨酸是以谷氨酸為底物，經(jīng)谷氨酸激酶、谷氨酸脫氫酶、Δ′-二氫吡咯-5-羧酸還原酶的依次催化完成［6-7］，其中谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反饋抑制［7］，是限速酶［8］，這也是反式-4-羥脯氨酸生產(chǎn)過程中需要添加外源脯氨酸的原因之一。對于谷氨酸激酶的研究，大都通過基因定點突變來改變其序列中的一個或多個氨基酸［9］，有些突變降低了L-脯氨酸對谷氨酸激酶的反饋抑制作用，使微生物細胞可以大量積累L-脯氨酸。通過對大腸桿菌谷氨酸激酶的兩個氨基酸位點E143A、K145A進行突變得到突變基因proBA2，降低L-脯氨酸對谷氨酸激酶的反饋抑制作用；然后引入脯氨酸4-羥化酶基因hyp，使proBA2和hyp共表達，實現(xiàn)在無外源L-脯氨酸的條件下，直接從葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸，以期提高反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本，應(yīng)用前景廣闊。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗所用菌株和質(zhì)粒見表1；實驗用到的引物見表2；LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，調(diào)pH至7.0～7.2，固體培養(yǎng)基另加1.5%的瓊脂粉；L-脯氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基（PF培養(yǎng)基） 葡萄糖20 g/L，蛋白胨8 g/L，F(xiàn)eSO41 mmol/L，（NH4）2SO410 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO40.2 g/L，CaCl20.015 g/L，調(diào)pH至8.0；反式-4-羥脯氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基（TF培養(yǎng)基）葡萄糖10 g/L，蛋白胨8 g/L，F(xiàn)eSO41 mmol/L，（NH4）2SO410 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO40.2 g/L，CaCl20.015 g/L，調(diào)pH至8.0。

TC-512型PCR擴增儀TECHNE；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH-W600型數(shù)顯三用恒溫水箱江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；IEC型高速冷凍離心機THERMO；HYG-A型全溫搖瓶柜江蘇太倉實驗設(shè)備廠；DYY-10C型電泳儀北京市六一儀器廠；UV-1100型紫外分光光度計上海精密儀器儀表公司；精密pH計梅特勒-托利多儀器上海有限公司；凝膠成像儀BIORAD。

表1　實驗所用菌株和質(zhì)粒Table 1　The strains and plasmids used in this work

表2　實驗所用引物Table 2　Primers used in this work

1.2實驗方法

1.2.1L-脯氨酸及反式-4-羥脯氨酸濃度測定L-脯氨酸的測定采用酸性茚三酮顯色法［10］：將發(fā)酵液離心后，取上清，適當(dāng)稀釋后取1 mL于10 mL試管中，加入1 mL冰乙酸；搖勻后加入1 mL酸性茚三酮；搖勻后沸水浴1 h；接著加入冰乙酸2 mL，搖勻后冷水冷卻，然后測定515 nm波長處的吸光度值，得到的數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可測得重組大腸桿菌的L-脯氨酸積累量。10 g/L L-脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)不同濃度稀釋后，分別得到L-脯氨酸濃度為0、5、8、11、14、17、20 mg/L的L-脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液溶液，在不同濃度的L-脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中依次加入冰乙酸和酸性茚三酮反應(yīng)，方法同以上所述，于515 nm波長處測定吸光度值。以O(shè)D515的值為橫坐標(biāo)，L-脯氨酸濃度為縱坐標(biāo)，繪制出L-脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到一個線性回歸方程：Y=aX+b，式中Y為L-脯氨酸濃度（mg/L），X為OD515的值，由此公式得到的L-脯氨酸濃度再乘以樣品的稀釋倍數(shù)即為樣品中的L-脯氨酸濃度。

反式-4-羥脯氨酸的測定采用氯胺T法［11］：將發(fā)酵液離心后，取上清，稀釋后取2.5 mL于10 mL試管中，加入1 mL氯胺T，搖勻后在室溫中放置20 min；然后加入1 mL顯色劑，搖勻后迅速將試管置于60℃水浴鍋中，20 min后取出冷水冷卻，用分光光度計在560 nm波長處測定吸光度值，得到的數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可測得重組大腸桿菌的反式-4-羥脯氨酸積累量。1 g/L反式-4-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)不同濃度稀釋后，分別得到反式-4-羥脯氨酸濃度為0、1、2、3、4、5 mg/L的反式-4-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，將稀釋后不同濃度的反式-4-羥脯氨酸溶液按照上述方法，測定560 nm波長處的吸光度值，以O(shè)D560為橫坐標(biāo)，反式-4-羥脯氨酸的濃度為縱坐標(biāo)，繪制出反式-4-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到一個線性回歸方程：Y=aX+b，式中Y為反式-4-羥脯氨酸濃度（mg/L），X為OD560的值，由此公式得到的反式-4-羥脯氨酸濃度再乘以樣品的稀釋倍數(shù)即為樣品中的反式-4-羥脯氨酸濃度。

1.2.2載體構(gòu)建以E.coli BL21（DE3）基因組DNA為模板，P1、P2為上下游引物，PCR擴增得到野生型proBA基因。色氨酸串聯(lián)啟動子基因序列用EcoRⅠ（G^AATTC）、HindⅢ（A^AGCTT）雙酶切pUC19-Ptrp2-hyp獲得。將proBA和色氨酸串聯(lián)啟動子重組到載體上，得到pET28a-Ptrp2-proBA。以pET28a-Ptrp2-proBA為模板，P3、P4為上下游引物，全質(zhì)粒PCR擴增獲得含有點突變的質(zhì)粒pET28a-Ptrp2-proBA2。用EcoRⅠ（G^AATTC）、BamHⅠ（G^GATCC）雙酶切pUC19-Ptrp2-hyp得到Ptrp2-hyp片段，同時用同樣的內(nèi)切酶處理pET28a-Ptrp2-proBA2，膠回收得到目的基因片段和載體，連接得到重組質(zhì)粒pET28a-PH。以pET28a-PH為模板，P5、P6為上下游引物，PCR擴增得到PH片段（hyp-Ptrp2-Ptrp2-proBA2），用內(nèi)切酶BamHⅠ（G^GATCC）、SacⅠ（G^AGCTC）同時雙酶切處理PCR克隆得到的基因片段和質(zhì)粒pUC19，膠回收后連接得到重組質(zhì)粒pUC19-PH。

1.2.3重組菌的發(fā)酵驗證將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細胞中得到重組菌，進行發(fā)酵驗證。含有重組質(zhì)粒pET28a-Ptrp2-proBA2的重組菌用PF培養(yǎng)基發(fā)酵驗證，培養(yǎng)條件：30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h。含有重組質(zhì)粒pUC19-PH、pET28a-PH的重組菌用TF培養(yǎng)基發(fā)酵驗證，培養(yǎng)條件：pH8.0，30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

在前期單因素實驗的基礎(chǔ)之上，選擇葡萄糖、胰蛋白胨、硫酸亞鐵、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉的濃度進行七因素三水平正交實驗，各因素的水平見表3。

表3　正交實驗因素水平表Table 3　Factors and levels table of orthogonal experiment

1.4數(shù)據(jù)處理

利用軟件IBM SPASS Statistics 20進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1L-脯氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建及發(fā)酵驗證

2.1.1重組質(zhì)粒pET28a-Ptrp2-proBA2的構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-Ptrp2-proBA2酶切驗證電泳結(jié)果見圖1，泳道1所示的條帶大小約為8100 bp，是該重組質(zhì)粒的大??；泳道2所示的兩條帶分別是質(zhì)粒pET28a（5369 bp）、目的片段Ptrp2-proBA2（約2700 bp）的條帶，電泳驗證的這些條帶大小與預(yù)期相符，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1　質(zhì)粒pET28a-Ptrp2-proBA2酶切電泳驗證Fig.1　The electrophoresis verification of the plasmid pET28a-Ptrp2-proBA2 by enzyme digestion

圖2　重組質(zhì)粒pET28a-Ptrp2-proBA2結(jié)構(gòu)Fig.2　The structure of recombinant plasmid pET28a-Ptrp2-proBA2

重組質(zhì)粒pET28a-Ptrp2-proBA2結(jié)構(gòu)如圖2所示，其含有突變基因proBA2。在大腸桿菌的基因圖譜上，proB和proA緊鄰［8-9］，兩者串聯(lián)表達并相互影響，構(gòu)成一個proBA操縱子［12-13］。含有兩個氨基酸突變位點的proBA2基因，表達的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反饋抑制作用顯著降低，從而使脯氨酸生物合成途徑受脯氨酸的反饋抑制作用顯著降低，可以實現(xiàn)L-脯氨酸的大量合成積累。該重組質(zhì)粒還含有色氨酸串聯(lián)啟動子［14］，在宿主細胞中無需添加誘導(dǎo)劑即可高效表達proBA2。

2.1.2L-脯氨酸發(fā)酵驗證含有突變基因proBA2的E.coli菌株L-脯氨酸的產(chǎn)量明顯高于不含質(zhì)粒的原菌株，其中E.coli JM109/pET28a-Ptrp2-proBA2菌株的L-脯氨酸產(chǎn)量是E.coli JM109原菌的27倍，是E.coli BL21（DE3）/pET28a-Ptrp2-proBA2的21倍，含有該突變基因的重組質(zhì)粒pET28a-Ptrp2-proBA2更適合在E.coli JM109菌株中表達（表4）。在30 mL的PF培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)24 h后L-脯氨酸的產(chǎn)量可以達到1436.2 mg/L。

表4　原菌及重組菌中L-脯氨酸的產(chǎn)量Table 4　The productivity of L-proline in E.coli

proB編碼的谷氨酸激酶是L-脯氨酸生物合成系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，該酶的活性受脯氨酸的反饋抑制作用。本研究通過基因工程手段對谷氨酸激酶基因進行定點突變后，proBA2編碼的谷氨酸激酶受脯氨酸的反饋抑制作用顯著降低，將突變基因轉(zhuǎn)入E.coli JM109中進行表達，L-脯氨酸的搖瓶產(chǎn)量可以達到1.4 g/L。Takeshi Shibasaki等［1］對proB進行定點突變得到proB74并將該突變基因?qū)隕.coli W1485 putA菌株中進行表達，L-脯氨酸的產(chǎn)量達到1.2 g/L。K E Rushlow等［9］對E.coli的proB進行突變得到的突變基因DHPR proB編碼的谷氨酸激酶第143位的谷氨酸突變?yōu)楸彼岷螅涫芨彼岬姆答佉种谱饔帽纫吧偷拿傅?00倍。Kenji Omori等［15］對來自脯氨酸高產(chǎn)菌株Serratia marcescens的proBA operon進行研究后發(fā)現(xiàn)，谷氨酸激酶第117位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸后的谷氨酸激酶受脯氨酸的反饋抑制作用比野生型的酶低700倍。近來，也有許多針對谷氨酸激酶的結(jié)構(gòu)研究。Isabel Perez-Arellano等［8，16］研究了谷氨酸激酶的PUA結(jié)構(gòu)域及脯氨酸與該酶的結(jié)合位點，主要利用定點突變技術(shù)進行研究；Clara Marco-Marin等［17］則對谷氨酸激酶的結(jié)構(gòu)進行了較全面地研究分析，包括AAK結(jié)構(gòu)域及PUA結(jié)構(gòu)域；Isabel Perez-Arellano等［18］在研究谷氨酸激酶結(jié)構(gòu)的同時利用基因工程技術(shù)對酶進行定點突變，更加深入透徹的展示了酶的結(jié)構(gòu)、活性與氨基酸之間的關(guān)系。諸多對谷氨酸激酶的研究極大地促進了L-脯氨酸的工業(yè)生產(chǎn)，對得到的重組菌株E.coli JM109/pET28a-Ptrp2-proBA2進行了培養(yǎng)，L-脯氨酸的搖瓶產(chǎn)量可以達到1.4 g/L，相信對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化后L-脯氨酸的產(chǎn)量會具有很大的提升空間。

2.2重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸

2.2.1反式-4-羥脯氨酸重組菌的構(gòu)建質(zhì)粒酶切驗證結(jié)果如圖3所示，其中（A）是重組質(zhì)粒pUC19-PH酶切驗證結(jié)果，泳道1中的兩條帶分別是基因片段hyp-Ptrp2-Ptrp2-proBA2（PH片段，約3100 bp）、pUC19質(zhì)粒（2686 bp），泳道2中的條帶是該重組質(zhì)粒的大?。s6400 bp），這些片段的大小均符合預(yù)期目標(biāo)；（B）是重組質(zhì)粒pET28a-PH酶切驗證結(jié)果，泳道1的條帶是該重組質(zhì)粒的大?。s9100 bp），泳道2中的條帶是質(zhì)粒pET28a-Ptrp2-proBA2（8058 bp）、Ptrp2-hyp（1058 bp），這些條帶的大小也都與預(yù)期目標(biāo)相符。該電泳圖說明了重組質(zhì)粒pUC19-PH、pET28a-PH構(gòu)建成功。

圖3　質(zhì)粒酶切電泳驗證Fig.3　The electrophoresis verification of the recombinant plasmid by enzyme digestion

重組質(zhì)粒pUC19-PH、pET28a-PH都含有基因proBA2和hyp，兩基因在各自的色氨酸串聯(lián)啟動子的作用下分別表達，先將葡萄糖轉(zhuǎn)化為L-脯氨酸，再轉(zhuǎn)化為反式-4-羥脯氨酸，以實現(xiàn)在無外源L-脯氨酸的條件下，直接從葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸。

2.2.2反式-4-羥脯氨酸發(fā)酵驗證反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量如表5所示。在使用TF培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，各菌株的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量出現(xiàn)較大差異：含有重組質(zhì)粒pUC19-PH的E.coli BL21（DE3）反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量最高，與雙質(zhì)粒表達菌株的產(chǎn)量較接近；同時雙質(zhì)粒表達菌株的L-脯氨酸均有一定量的積累，但以E.coli JM109作為宿主時的L-脯氨酸積累量最高，這與表4的結(jié)果吻合；與含有pUC19-Ptrp2-hyp的重組菌的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量相比，含有重組質(zhì)粒pUC19-PH和雙質(zhì)粒表達體系的E.coliBL21（DE3）菌株的產(chǎn)量都提高了約1倍；表5的結(jié)果也說明hyp基因在質(zhì)粒pUC19上的表達明顯高于在質(zhì)粒pET28a上的表達。

表5　原菌及重組菌中反式-4-羥脯氨酸的積累量Table 5　The productivity of trans-4-hydroxyproline in E.coli

不同發(fā)酵時間下各菌株的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量如圖4所示，在發(fā)酵14 h時重組菌E.coli BL21（DE3）/ pUC19-PH的反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量略低于雙質(zhì)粒表達系統(tǒng)，但是發(fā)酵14 h以后該重組菌的反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量明顯高于雙質(zhì)粒表達菌株。

圖4　不同發(fā)酵時間下下各菌株的Hyp產(chǎn)量Fig.4　Hyp yield of virious strains under the different fermentation time

2.3培養(yǎng)基優(yōu)化的正交實驗結(jié)果

正交實驗結(jié)果如表6所示，在反式-4-羥脯氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，各個因素對產(chǎn)物積累量影響的主次順序是：胰蛋白胨濃度＞硫酸銨濃度＞硫酸亞鐵濃度＞葡萄糖濃度＞磷酸氫二鉀濃度＞硫酸鎂濃度＞氯化鈉濃度；該正交實驗得到的各因素的最優(yōu)水平組合為A1B3C3D1E2F3G1，由于正交實驗中氯化鈣的濃度固定不變?yōu)?.015 g/L，所以得到的反式-4-羥脯氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基的各因素及水平的最佳濃度為：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨15 g/L，硫酸亞鐵3 mmol/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，氯化鈣0.015 g/L。

驗證正交優(yōu)化結(jié)果：按照優(yōu)化后得到的培養(yǎng)基成分培養(yǎng)重組大腸桿菌BL21（DE3）/pUC19-PH，培養(yǎng)24 h后反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為220.0 mg/L，用優(yōu)化前的TF培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為98.9 mg/L，優(yōu)化后提高約1.2倍。

3　討論

本實驗中用到的脯氨酸4-羥化酶基因（hyp）來源于指孢囊菌RH1［5］，該酶可以把游離的脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥脯氨酸，在已構(gòu)建的脯氨酸合成途徑增強了的重組大腸桿菌細胞內(nèi)再引入hyp，使生成的脯氨酸在hyp表達的脯氨酸-4-羥化酶的作用下繼續(xù)轉(zhuǎn)化生成反式-4-羥脯氨酸，實現(xiàn)從葡萄糖到反式-4-羥脯氨酸的連續(xù)轉(zhuǎn)化。關(guān)于兩基因的共表達策略，耿風(fēng)廷等［19］指出大腸桿菌表達系統(tǒng)主要有多順反子表達系統(tǒng)與雙質(zhì)粒表達系統(tǒng)，其中雙質(zhì)粒表達系統(tǒng)的優(yōu)勢高于前者，但需要少量抗生素來維持質(zhì)粒的共存，共存時間較短；馬蓉等［20］指出單一載體上由獨立啟動子分別驅(qū)動兩個基因表達的產(chǎn)量高于單個啟動子驅(qū)動的兩個基因的表達，同時用少量抗生素維持不相容質(zhì)粒來表達多個基因也是一個較好的方法。本工作中構(gòu)建的產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的的重組菌中既有單一載體/獨立啟動子驅(qū)動的的載體、也有不同抗性的雙質(zhì)粒共表達載體，實驗結(jié)果（圖4）表明，發(fā)酵14 h以后含有雙質(zhì)粒表達系統(tǒng)的重組菌的反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量低于單一載體/獨立啟動子驅(qū)動的重組菌的產(chǎn)量，表明雙質(zhì)粒表達系統(tǒng)穩(wěn)定共存、高效表達的時間是有限的，發(fā)酵約14 h后穩(wěn)定共存環(huán)境被打破。

反式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn)菌株E.coli BL21（DE3）的目標(biāo)氨基酸的產(chǎn)量相比于Shibasaki等［1］的研究低，一方面是因為E.coli W1485 putA菌株中脯氨酸脫氫酶基因（putA）經(jīng)過突變失活，不能表達脯氨酸脫氫酶，細胞中的脯氨酸只能在脯氨酸4-羥化酶的作用下轉(zhuǎn)化為反式-4-羥脯氨酸；另一方面是E.coli W1485是脯氨酸4-羥化酶的最佳宿主［21］，在這個宿主中該酶的表達效果明顯高于在E.coli BL21（DE3）中的表達。本工作中對反式-4-羥脯氨酸生產(chǎn)菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化后，氨基酸的產(chǎn)量提高了1.2倍，這一結(jié)果表明了無外源脯氨酸發(fā)酵產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸方法的應(yīng)用價值。后續(xù)的工作中可以對putA進行基因敲除、繼續(xù)優(yōu)化宿主菌，以期最大限度的提高反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量，實現(xiàn)無外源脯氨酸發(fā)酵生產(chǎn)該氨基酸的工業(yè)生產(chǎn)。

4　結(jié)論

產(chǎn)L-脯氨酸能力增強的重組大腸桿菌E.coli JM109/pET28a-Ptrp2-proBA2在搖瓶階段，以葡萄糖為單一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，L-脯氨酸產(chǎn)量為1.4 g/L。不需添加外源L-脯氨酸產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的重組大腸桿菌E.coli BL21（DE3）/pUC19-PH在搖瓶階段，以葡萄糖為單一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為98.9 mg/L；對發(fā)酵條件進行優(yōu)化以后，得到培養(yǎng)基為：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨15 g/L，硫酸亞鐵3 mmol/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，氯化鈣0.015 g/L。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)進行發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸，產(chǎn)量達到220.0 mg/L，相比優(yōu)化前提高了1.2倍。

對上述兩個菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化后，相應(yīng)氨基酸的產(chǎn)量都得到了大幅提升。proBA2與hyp共表達可以實現(xiàn)從葡萄糖到反式-4-羥脯氨酸的連續(xù)轉(zhuǎn)化，而不需要添加外源L-脯氨酸，這對于反式-4-羥脯氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)具有很好的應(yīng)用價值。

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Construction and fermentation optimization of a recombinant Escherichia coli for the production of trans-4-hydroxyproline without extra addition of proline

HU Dan-dan，WANG Fu-cai，ZHANG Zhen-yu*，SUN Fu-bao，ZHOU Bang-wei
（School of Biotechnology，Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry& Biotechnology Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to produce trans-4-hydroxyproline directly from the conversion of glucose without extra addition of L-proline，site-directed mutagenesis and gene co-expression were used in this experiment to construct the recombinant E.coli.Firstly，two mutations E143A，K145A were made on glutamate kinase，which was the key enzyme of L-proline biosynthetic pathway，to enhance the L-proline biosynthesis.Then，proline-4-hydroxylase gene was inserted to co-expressed with the mutated glutamate kinase gene.Co-expression of the two genes resulted in a continuous conversion from glucose to trans-4-hydroxyproline，without the extra addition of exogenous L-proline.At the shaking-flask stage，output of L-proline by the biosynthetic capacity enhanced strain reached 1.4 g/L.Yield of trans-4-hydroxyproline by the co-expression strain of proBA2 and hyp was 96.9 mg/L，which doubled than the original strain.After the fermentation optimization，the optimum medium was：glucose 10 g/L，tryptone 15 g/L，ferrous sulfate 3 mmol/L，magnesium sulfate 1 g/L，dipotassium phosphate 3 g/L，calcium chloride 0.015 g/L.The recombinant E.coli was cultured with the optimized medium for 24 h. The output of trans-4-hydroxyproline was achieved at 220.0 mg/L，a 1.3-fold increase than the original strain. Key words：proline 4-hydroxylase；trans-4-hydroxyproline；L-proline；glutamate kinase；co-expression

TS201.1

A

1002-0306（2015）20-0168-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.027

2015－03－09

胡丹丹（1987-），女，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：hudandan604@163.com。

張震宇（1976-），男，教授，研究方向：發(fā)酵工程、生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：zhangzy@jiangnan.edu.cn。

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（200802951036）；國家自然科學(xué)基金（30800018，30970058）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012554）。