向　　歡，高　耀，彭國茳，吳麗君，田俊生，*

（1.山西大學(xué)體育學(xué)院，山西太原030006；2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西太原030006）

葡萄籽提取物對健康人體尿液的代謝組學(xué)研究

向歡1，高耀2，彭國茳2，吳麗君1，田俊生2，*

（1.山西大學(xué)體育學(xué)院，山西太原030006；2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西太原030006）

目的：采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究口服葡萄籽提取物后人體尿液中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律。方法：選擇16名健康男生隨機(jī)平均分成兩組，即試食組（A）和對照組（B）。試食組每人每天口服葡萄籽提取物軟膠囊2粒，連續(xù)14d，對照組連續(xù)服用安慰劑14d。分別收集試食組及對照組服藥前（0d）和服藥后（14d）的晨尿，運(yùn)用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)分析尿液中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化及其規(guī)律。結(jié)果：與對照組相比，服藥14d后，試食組人體尿液中乳酸水平下降，肌酐水平上升，且具有顯著性差異（p＜0.05，0.01）；結(jié)論：葡萄籽提取物（GSE）對人體尿液中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用顯著，涉及能量代謝和氨基酸代謝通路，對能量代謝的調(diào)節(jié)尤為顯著，是一種很好的運(yùn)動營養(yǎng)補(bǔ)充劑。1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)在運(yùn)動科學(xué)研究中的應(yīng)用前景廣闊。

代謝組學(xué)，葡萄籽提取物，尿液，核磁共振，代謝產(chǎn)物

葡萄籽提取物（Grape Seed Extract，GSE）中的主要活性成分為原花青素，是一類具有較高生物活性的黃酮類物質(zhì)［1］，分子中含有多個酚羥基，可以有效清除有害的氧自由基，是一種高效抗氧化劑，對自由基引起的過氧化損傷具有保護(hù)作用［2-3］，而導(dǎo)致骨骼肌損傷和疲勞的重要原因之一就是運(yùn)動引起骨骼肌自由基和其他形式的活性氧增加［4］，因此，葡萄籽原花青素不僅是一種很好的運(yùn)動營養(yǎng)補(bǔ)充劑，具有抗疲勞、提高運(yùn)動能力的作用，而且，可以抑制紅細(xì)胞膜和低密度脂蛋白過氧化，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞松弛因子的形成，防止血小板凝聚［5-8］。

代謝組學(xué)（Metabonomics）是研究機(jī)體代謝產(chǎn)物譜變化的一種系統(tǒng)生物學(xué)方法，可通過揭示新陳代謝動態(tài)進(jìn)程中代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，全面理解機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑［9-10］。它以高通量、大規(guī)模實驗方法和計算機(jī)統(tǒng)計分析為特征，具有“系統(tǒng)性”、“整體性”和“動態(tài)性”的特點(diǎn)［11-12］。1H-NMR、LC-MS、GCMS是代謝組學(xué)研究中常用的分析方法［13］，尤以1HNMR技術(shù)最為常用［14］。代謝組學(xué)分析的數(shù)據(jù)采集會得到多元性、復(fù)雜性的數(shù)據(jù)，需要借助專門的數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，模式識別分析如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）以及正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）是代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理過程中應(yīng)用最多的方法［11］。近年來，代謝組學(xué)在運(yùn)動科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用逐年增加，代謝組學(xué)通過分析運(yùn)動導(dǎo)致內(nèi)源性物質(zhì)的變化，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的代謝通路，為運(yùn)動人體科學(xué)的發(fā)展提供一個新的思路［15-16］。本文采用1H-NMR方法結(jié)合多元統(tǒng)計分析人體尿液中代謝產(chǎn)物的變化及其規(guī)律，旨在為探討葡萄籽原花青素干預(yù)對人體代謝產(chǎn)物的影響機(jī)制的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

千林葡萄籽提取物軟膠囊（0.4g×90粒，每100mg含原花青素21.5mg）（20120810）廣東保瑞藥業(yè)有限公司。

Bruker 600 MHz Avance III NMR譜儀德國布魯克公司；Centrifuge TDL-5型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；D2O美國默克試劑公司；其他試劑均為分析純。

1.2實驗對象

實驗對象為山西大學(xué)體育學(xué)院體育教育專業(yè)大二的健康男生，共16名，隨機(jī)分為試食組（A）和對照組（B），每組8人，平均年齡（19.54±0.84）歲，身高（178.29±4.35）cm，體重（69.14±6.19）kg。所有受試者均簽署知情同意書并經(jīng)過病史詢問，排除循環(huán)、呼吸系統(tǒng)重大疾病史及近期內(nèi)上呼吸道感染史，且近期都沒有服用維生素E、維生素C等自由基清除劑以及其他中藥補(bǔ)劑。并且實驗期間，所有受試者避免海鮮、辛辣食物，飲食清淡，禁止飲酒、吸煙以減少食物對代謝造成的波動，避免劇烈的運(yùn)動。

1.3實驗方案及尿液樣本收集

實驗前（0d）清晨8∶00～9∶00空腹留取全部受試者尿液約10mL于EP管中。實驗開始后，試食組每人每天口服葡萄籽提取物軟膠囊2粒，連續(xù)14d，溫水送服；對照組則口服外觀相似的安慰劑（淀粉膠囊），連續(xù)14d。第15d清晨8∶00～9∶00再次空腹留取尿液約10mL。全部尿液樣本在3000r/min離心10min，上清液于-80℃冰箱保存，待測。

1.41H-NMR代謝組學(xué)分析

1.4.1尿液樣本預(yù)處理取解凍后的尿液樣本500μL，置于1.5mL Eppendorf管中，加入200μL D2O配制的磷酸緩沖液（0.2mol/L Na2HPO4/0.2mol/L NaH2PO4， 81∶19，v/v，pH=7.40），并加入適量0.15%TSP（3-三甲基硅基氘代丙酸鈉）作為化學(xué)位移零點(diǎn)的定標(biāo)。4℃下13000r/min離心15min，取上清液600μL置于5mm的核磁管中待測。

1.4.21H-NMR測定條件采用NOESY脈沖序列進(jìn)行樣本測定，參數(shù)設(shè)置為譜寬為8kHz，混合時間為0.15s，弛豫延遲為320ms，采樣點(diǎn)數(shù)64k，累加次數(shù)64。在弛豫延遲期間采用預(yù)飽和方式抑制水峰，譜儀偏置設(shè)置在水峰位置，自由感應(yīng)衰減信號經(jīng)過傅里葉變換轉(zhuǎn)換為1H-NMR圖譜。

1.4.31H-NMR譜圖處理采用MestReNova（Mestrelab Research，Santiago de Company，Spain）核磁圖譜處理軟件對所有1H-NMR圖譜進(jìn)行相位、基線調(diào)整，并以TSP峰參考調(diào)零進(jìn)行化學(xué)位移的校正。參考文獻(xiàn)［17-18］并結(jié)合Chenomx NMR Suite數(shù)據(jù)庫（加拿大Chenomx Inc.公司）軟件對譜圖峰進(jìn)行歸屬。以δ 0.02為單位進(jìn)行分段積分，同時排除包含水峰和尿素峰的部分（δ 4.6～6.4），即得到與化學(xué)位移值段相對應(yīng)的積分值。采用歸一化法，將數(shù)據(jù)歸一化處理，使數(shù)據(jù)集中在0～1范圍內(nèi)，所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換為Excel文件保存，用于多元統(tǒng)計分析。

1.4.4多元統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SIMCA-P 13.0（Umetric，Sweden）將積分?jǐn)?shù)據(jù)中心化和規(guī)格化后，應(yīng)用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用SPSS 17.0（Chicago，IL，USA）軟件，采用獨(dú)立樣本t檢驗，對具有差異的代謝產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示。

2　結(jié)果與分析

2.11H-NMR圖譜的指認(rèn)與分析

依據(jù)每個代謝物的化學(xué)位移，裂峰情況及耦合常數(shù)，并結(jié)合Chenomx NMR Suite軟件對1H-NMR譜圖進(jìn)行指認(rèn)分析。從圖譜中指認(rèn)出24個代謝物，如圖1所示，主要包括氨基酸、有機(jī)酸等，化學(xué)位移指認(rèn)結(jié)果見表1。

圖1　人體尿液樣本1H-NMR譜圖Fig.1　1H-NMR spectra from urine samples

2.2試食組不同時間點(diǎn)尿液1H-NMR譜圖的PLSDA分析

試食組不同時間點(diǎn)尿液PLS-DA分析結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，試食組2個不同時間點(diǎn)的尿液樣本沿t［1］軸分開，表明口服葡萄籽提取物（GSE）后，人體尿液樣本中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物發(fā)生了變化。

表1　人體尿液樣本中1H-NMR圖譜中主要代謝產(chǎn)物峰歸屬Table 1　Peak attribution of main metabolites in1H-NMR spectra for urine sample

圖2　試食組不同時間點(diǎn)尿液1H-NMR譜PLS-DA散點(diǎn)圖Fig.2　PLS-DA scores plot in1H-NMR spectra for urine samples from GSE-treated group at different periods

2.3服藥后試食組和對照組尿液1H-NMR譜圖PLS-DA分析

服藥后試食組和對照組尿液1H-NMR譜圖PLSDA分析結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，試食組第（14d）與對照組（0d）、試食組（0d）以及對照組（14d）分開，說明試食組（14d）尿液中代謝產(chǎn)物變化較為顯著，即口服葡萄籽提取物（GSE）對尿液代謝產(chǎn)物影響較大；而對照組（14d）、對照組（0d）和試食組（0d）分開趨勢不明顯，表明實驗14d后，對照組尿液樣本內(nèi)源性代謝產(chǎn)物變化不顯著，即安慰劑對體內(nèi)代謝產(chǎn)物影響較小。

圖3　服藥后試食組和對照組尿液1H-NMR譜圖PLS-DA分析Fig.3　PLS-DA scores plot in1H-NMR spectra for urine samples of GSE-treated group and placebo-treated group

為了進(jìn)一步探討口服GSE后尿液中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化及其規(guī)律，采用多元統(tǒng)計分析對試食組（14d）和對照組（14d）的尿液1H-NMR譜圖進(jìn)行單獨(dú)分析，結(jié)果如圖4所示。其中圖4（a）為PLS-DA分析散點(diǎn)圖，由圖可知，試食組與對照組沿t［1］軸分開，表明兩組尿液中的代謝產(chǎn)物水平存在差異。圖4（b）是PLS-DA分析模型驗證圖，模型驗證通過R2和Q2評價模型的擬合情況和預(yù)測能力，R2和Q2介于0和1之間，越接近1表示模型越有效［19-20］。圖4（b）中R2（0.575）和Q2（0.831）的回歸線與左邊縱軸相交，且左邊的R2和Q2實驗值低于右邊的原始值，可見上述方法模型是可靠有效的。為找出變化顯著的代謝產(chǎn)物，得到試食組和對照組PLS-DA分析載荷圖，如圖4（c）所示。依據(jù)圖中離原點(diǎn)遠(yuǎn)的點(diǎn)VIP值較大，變量VIP值越大，對分組的貢獻(xiàn)就越大的原則，得到7個VIP值＞1的代謝產(chǎn)物（乳酸、檸檬酸、肌酐、肌酸、?；撬?、甘氨酸、苯乙尿酸）。用SPSS軟件對這些代謝產(chǎn)物的相對峰面積進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗，結(jié)果如圖4（d）所示，由圖可知，口服GSE 14d后，與對照組相比，乳酸和肌酐兩個代謝產(chǎn)物的水平變化具有顯著性差異（p＜0.05）。

圖4　服藥后試食組和對照組尿液1H-NMR譜圖PLS-DA分析Fig.4　1H-NMR spectra for urine samples of GSE-treated group and placebo-treated group

3　討論

自由基是機(jī)體正常代謝的產(chǎn)物，是生命活動中必不可少的能量載體。正常情況下，生物機(jī)體內(nèi)自由基維持在一種平衡狀態(tài)，但在出現(xiàn)運(yùn)動疲勞、疾病等狀況時，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除則會失去平衡。研究表明原花青素能夠有效清除機(jī)體內(nèi)過多的自由基［21-22］，但運(yùn)用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)從機(jī)體整體角度探討原花青素對尿液代謝產(chǎn)物的影響及其機(jī)制研究的文獻(xiàn)報道較少。

本文采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)對服用原花青素引起的體內(nèi)代謝物的變化規(guī)律進(jìn)行動態(tài)觀察，探討原花青素對人體內(nèi)源性代謝物的影響機(jī)制。由1HNMR圖譜及模式識別分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試食組中乳酸和肌酐水平顯著改變。

乳酸是機(jī)體無氧代謝的產(chǎn)物，即機(jī)體供能過程中，糖在無氧或氧氣不足情況下酵解的最終產(chǎn)物，在供能體系中占有重要地位。在正常的新陳代謝中，機(jī)體中基本處于酸堿平衡狀態(tài)，乳酸雖然會不斷被產(chǎn)生，但其濃度不會明顯升高。當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動時，機(jī)體內(nèi)供能加快，糖酵解供能比例增加。同時，乳酸產(chǎn)生速度加快，無法被及時運(yùn)走而在機(jī)體內(nèi)堆積，濃度增加，造成機(jī)體內(nèi)pH降低，導(dǎo)致機(jī)體運(yùn)動能力下降，產(chǎn)生疲勞［23］。在本實驗中，與對照組相比，試食組尿液中乳酸水平明顯下降，可能是葡萄籽提取物（GSE）提高了機(jī)體的有氧代謝所致。

肌酐是骨骼肌中肌酸與磷酸肌酸通過自發(fā)和不可逆的脫水縮合而形成的。一般情況下，機(jī)體內(nèi)肌酐含量基本穩(wěn)定，每日排出量變化很小，飲水量、飲食以及利尿劑等對肌酐的排出率沒有太大的影響，被用于尿液中毒物含量檢測的校正。實驗中經(jīng)常用肌酐量來表示被測物濃度水平與接觸濃度有較好的相關(guān)性。而肌酸是由甘氨酸、甲硫氨酸以及精氨酸等3種必須氨基酸組成，前體為磷酸肌酸，是制造人體細(xì)胞能量——三磷酸腺甘（ATP）最重要的化學(xué)物質(zhì)之一。機(jī)體中大約95%的肌酸儲存在骨骼肌中，骨骼肌中的肌酸與高能磷酸鍵結(jié)合以磷酸肌酸的形式貯存自由能，以供應(yīng)機(jī)體做功所需能量。正常情況下，機(jī)體內(nèi)肌酸庫穩(wěn)定，當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動時，機(jī)體所需能量增加，骨骼肌中肌酸與磷酸肌酸作用加快，轉(zhuǎn)化為肌酐隨尿液排除體外［24-25］。本實驗研究結(jié)果顯示，試食組（14d）尿液中肌酐水平顯著升高，說明口服葡萄籽提取物（GSE）后，機(jī)體供能加快，運(yùn)動能力增強(qiáng)。

本實驗運(yùn)用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)對口服葡萄籽提取物（GSE）后人體尿液中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化及其規(guī)律進(jìn)行探討，結(jié)果表明葡萄籽提取物（GSE）對人體尿液內(nèi)源性代謝物的調(diào)節(jié)作用明顯，關(guān)于葡萄籽提取物的機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

4　結(jié)論

初步證實了葡萄籽提取物（GSE）對人體尿液中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用顯著，對機(jī)體代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)涉及能量代謝和氨基酸代謝等代謝通路，對能量代謝的調(diào)節(jié)作用尤為顯著，具有提高運(yùn)動能力、抗疲勞的功效，是一種較好的營養(yǎng)補(bǔ)充劑，可以作為運(yùn)動損傷及康復(fù)保健的理想選擇。本研究為葡萄籽提取物的功效及作用機(jī)制研究提供實驗依據(jù)。

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Effect of grape seed extract on endogenous metabolites in human urine

XIANG Huan1，GAO Yao2，PENG Guo-jiang2，WU Li-jun1，TIAN Jun-sheng2，*
（1.School of Physical Education，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Objective：To investigate the changes of endogenous metabolites in Human urine after administration of grape seed extract（GSE）via NMR-based metabolomics.Methods：Sixteen healthy male students were randomly and averagely divided into two groups（A and B）.The volunteers in the group（A）were administrated 2 GSE capsules per day for 14 days，while those in the group（B）were given the Placebo capsules only.Urine samples were collected at 0th and after administration of grape seed extract（14th）individually.The urine samples were analyzed with technique of1H-NMR and pattern recognition.Results：Compared with the Placebo-treated group，the levels of lactate decreased and the levels creatinine increased significantly in the GSE-treated group（p＜0.05，0.01）.The level of lactate，creatin，taurine in GSE-treated group were lower than the placebo-treated group with significant difference（p＜0.05）.Conclusion：As one of good nutrition supplements for sports，administration of GSE heavily regulated the endogenous metabolites，which involved with the energy metabolism and amino acid metabolism.The application of1H-NMR metabolomics technology in sports science will be in spread in the future.

metabolomics；grape seed extract（GSE）；urine；1H-NMR；metabolites

TS201.1

A

1002-0306（2015）12-0344-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.065

2014－11－18

向歡（1984-），女，碩士研究生，助教，研究方向：運(yùn)動保健與中醫(yī)藥康復(fù)。

田俊生（1980-），男，博士，副教授，研究方向：中藥藥理與新藥研發(fā)。

國家自然科學(xué)基金項目（81102833）。