崔青曼，劉　萍，王　悅，袁春營

（天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津科技大學海洋科學與工程學院，天津300457）

單環(huán)刺螠糖胺聚糖抗凝血機制初步研究

崔青曼，劉萍，王悅，袁春營

（天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津科技大學海洋科學與工程學院，天津300457）

采用人乏AT-Ⅲ血漿、乏HCII血漿及兩種肝素輔因子均缺乏的血漿，探討單環(huán)刺螠糖胺聚糖的抗凝血途徑；通過糾正乏因子血漿所致的凝固時間延長的能力測定人血漿凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ的活性，凝固法測定纖維蛋白原濃度；體外復鈣凝血實驗，研究糖胺聚糖對復鈣凝血時間的影響；甲基百里酚藍比色法測定大鼠和小鼠血清中鈣離子濃度。結果表明：單環(huán)刺螠糖胺聚糖的抗凝血酶作用主要呈AT-Ⅲ依賴性，并能夠鈍化肝素輔因子Ⅱ抑制凝血酶的活性；單環(huán)刺螠糖胺聚糖顯著降低血漿凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的活性（p＜0.05）；糖胺聚糖可通過屏蔽血液中Ca2+，延長大鼠血復鈣凝血時間，極顯著降低大鼠和小鼠血液中的鈣離子濃度（p＜0.01），且其降低血液鈣離子濃度的作用極顯著優(yōu)于肝素鈉（p＜0.01）。

單環(huán)刺螠，糖胺聚糖，抗凝血機制

糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）又稱氨基多糖，是由氨基己糖和己糖醛酸交替結合而形成的長鏈分子，廣泛存在于動物體內，是蛋白多糖的糖鏈部分，具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、降血糖等廣泛的生物學功能［1-6］。單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus），俗名海腸子，屬于螠蟲動物門（Echiurioidea）、螠綱（Echiurida）、無管螠目（Xenopneusta）、刺螠科（Urchidae），是一種長圓筒形軟體動物，分布于俄羅斯、日本、朝鮮和我國渤海灣等，是我國北方沿海泥沙岸潮間帶下區(qū)及潮下帶淺水區(qū)底棲生物的常見種。前期研究表明，單環(huán)刺螠糖胺聚糖具有較好的抗凝血作用［7］，為此，本研究從肝素輔因子、凝血因子和鈣離子等多個方面，探討該糖胺聚糖的抗凝血作用機制，為單環(huán)刺螠糖胺聚糖進一步的開發(fā)利用提供良好的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

單環(huán)刺螠糖胺聚糖天津科技大學應用海洋生物研究室提取純化，相對分子質量450.032ku，硫酸根含量為30.26%，糖醛酸含量為25.25%，氨基糖含量為7.58%［7］；人凝血酶（TT）時間診斷試劑盒、凝血酶原（PT）時間診斷試劑盒、活化部分凝血活酶（APTT）時間診斷試劑盒、纖維蛋白原（FIB）測定試劑、標準血漿、凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ活性測定試劑盒（凝固法）、乏抗凝血酶-Ⅲ血漿、乏肝素輔因子II血漿和兩種肝素輔因子均缺乏的血漿德國Siemens Healthcare Diagnostics Inc.；肝素鈉效價：≥140U/mg，Cat.No.H8060，北京索萊寶科技有限公司；Wister大鼠

SPF級，體重（163.88±4.51）g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，批號SCXK-（軍）2012-0004；Km小鼠SPF級，體重（23.58±1.43）g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，批號SCXK-（軍）2012-0004。

Allegra X-15R臺式冷凍離心機美國貝克曼庫爾特有限公司；CA-7000全自動凝血分析儀日本希森美康株式會社；TU-1810紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2實驗方法

1.2.1糖胺聚糖對抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）及肝素輔因子Ⅱ（HC-Ⅱ）抑制凝血酶作用的影響標準血漿、乏AT-Ⅲ、乏HC-Ⅱ及兩種肝素輔因子均缺乏的血漿中分別加入糖胺聚糖（1∶10），對照組加入等體積生理鹽水，糖胺聚糖濃度4mg/mL，預溫5min后加入預溫15min的PT和TT試劑，用凝血因子分析儀測定凝固時間。

1.2.2糖胺聚糖對血漿凝血因子活性的影響糖胺聚糖設置三個濃度梯度，即50、100、200μg/mL，陽性對照肝素鈉濃度50μg/mL，空白對照組為同體積生理鹽水。按照凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ測定試劑盒說明書測定其活性，凝固法測定纖維蛋白原濃度。

1.2.3糖胺聚糖對大鼠血體外復鈣凝血時間的影響

采用10mg/mL和3mg/mL兩種不同質量濃度鈣離子，糖胺聚糖濃度分別為1、2、4mg/mL，生理鹽水作為空白對照，肝素鈉作為陽性對照。大鼠股動脈取血，制備抗凝血（5mL血液中加入0.1mL 5%草酸鉀溶液）。0.9mL血液中加入0.1mL不同濃度糖胺聚糖，空白對照組和陽性對照組分別加入等體積生理鹽水和肝素鈉（1mg/mL），然后加入不同濃度的的氯化鈣溶液0.1mL，37℃恒溫水浴，每隔30s將試管輕輕傾斜一次，當血液在離心管中不再流動時，記錄下時間，以秒表示。

1.2.4糖胺聚糖對大鼠血液中鈣離子濃度的影響選擇雌雄大鼠36只，隨機分為6組，正常喂養(yǎng)3d后尾靜脈注射糖胺聚糖（1、4、16mg/kg）、肝素鈉（4mg/kg）和生理鹽水，注射量0.5mL，30min后股動脈采血，3000r/min離心15min，取上清液，甲基百里酚藍比色法測定血清中的鈣離子濃度［8］。

1.2.5糖胺聚糖對小鼠眼眶后靜脈叢血液中鈣離子濃度的影響分別用1、2、4mg/mL糖胺聚糖、2mg/mL肝素鈉（陽性對照）和生理鹽水（空白對照）浸泡毛細吸管24h，烘干備用。60只小鼠隨機分為6組，每組10只，用處理過的毛細管對小鼠進行眼眶后靜脈叢取血0.12mL，置于塑料離心管中，3000r/min離心10min，測定方法同1.2.4。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析。分析軟件為SPSS 17.0，實驗數(shù)據(jù)均以mean±SD表示。

2　結果與分析

2.1糖胺聚糖抗凝血酶活性對抗凝血酶（AT）Ⅲ和肝素輔因子（HC）Ⅱ的依賴關系

標準血漿、乏AT-Ⅲ、乏HC-Ⅱ及兩種肝素輔因子均缺乏的血漿中糖胺聚糖對血液PT和TT的作用結果見表1，從表1看出，標準血漿、乏ATⅢ血漿、乏HC-Ⅱ的血漿、兩種因子均缺乏的血漿中加入糖胺聚糖后，TT均極顯著延長（p＜0.01），除了標準血漿加入糖胺聚糖后PT顯著延長（p＜0.05）外，其他PT均極顯著延長（p＜0.01）。與標準血漿加GAG組比較，乏AT-Ⅲ血漿中加入糖胺聚糖后，TT極顯著縮短（p＜0.01），PT極顯著延長（p＜0.01），兩種肝素輔因子均缺乏的血漿中加入糖胺聚糖后，TT顯著縮短（p＜0.05），乏HC-Ⅱ的血漿中加入糖胺聚糖后PT極顯著延長（p＜0.01），明顯延長TT。推測存在著不同于肝素的抗凝血途徑。

馬西等［9］報道剌參酸性粘多糖的抗凝血酶作用主要呈AT-Ⅲ依賴性，也有資料顯示其抗凝血酶作用主要呈HC-Ⅱ依賴性［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)在標準血漿中加入糖胺聚糖后，TT極顯著延長（p＜0.01），PT顯著延長（p＜0.05），乏HC-Ⅱ血漿中加入糖胺聚糖后，TT和PT均極顯著延長（p＜0.01），與標準血漿加入糖胺聚糖比較，乏AT-Ⅲ血漿中加入糖胺聚糖后TT和PT均極顯著縮短（p＜0.01），推測單環(huán)刺螠糖胺聚糖的抗凝血酶作用主要呈AT-Ⅲ依賴性。此外，還發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖可能具有鈍化肝素輔因子Ⅱ抑制凝血酶活性的作用，因為與標準血漿加入糖胺聚糖比較，乏HC-Ⅱ血漿中加入糖胺聚糖后TT明顯延長，PT極顯著延長（p＜0.01）。

表1　糖胺聚糖抗凝血酶活性對抗凝血酶Ⅲ和肝素輔因子（HC）Ⅱ的依賴關系（n=6）Table 1　Effect of glycosaminoglycan on the function of AT-Ⅲand HC-Ⅱinhibiting thrombin activity（n=6）

2.2糖胺聚糖對血漿凝血因子活性的影響

通過糾正乏因子血漿所致的凝固時間延長的能力來測定凝血因子活性。結果見表2，從表2看出，肝素鈉組血漿纖維蛋白原（FIB）含量明顯低于對照組，但未達顯著水平（p＞0.05），不同濃度的糖胺聚糖組FIB含量與對照組相比沒有明顯差異；肝素鈉、糖胺聚糖能夠極顯著降低凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ的活性（p＜0.01），肝素鈉和中高濃度的糖胺聚糖能夠極顯著降低凝血因子Ⅺ的活性（p＜0.01），低濃度的糖胺聚糖能夠顯著降低凝血因子Ⅺ的活性（p＜0.05）；且相同濃度下，糖胺聚糖降低凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ活性的能力極顯著低于肝素鈉（p＜0.01），降低凝血因子Ⅴ、Ⅶ活性的能力明顯低于肝素鈉，降低凝血因子Ⅹ、Ⅷ活性的能力略微高于肝素鈉。

肝素能夠與AT結合，催化滅活凝血因子Ⅱa、Ⅹa、Ⅸa、Ⅺa和Ⅻa，肝素激活肝素輔因子Ⅱ而直接滅活凝血因子Ⅱa，這是肝素抗凝作用的主要機制［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠糖胺聚糖顯著降低血漿凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ的活性（p＜0.05，p＜0.01），推測由于糖胺聚糖與抗凝血酶Ⅲ結合，引起AT-Ⅲ構象的改變，使AT-Ⅲ的精氨酸殘基更易與凝血因子Ⅶ、Ⅹ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的絲氨酸殘基結合，從而滅活或抑制這些凝血因子的活性。糖胺聚糖顯著降低血漿凝血因子Ⅴ、Ⅷ活性的原因可能是該糖胺聚糖與這兩種大分子糖蛋白中的氨基酸結合，直接抑制兩種因子的活性。糖胺聚糖降低血漿凝血因子Ⅱ的作用較小，推測是糖胺聚糖對肝素輔因子Ⅱ的鈍化作用所致。

2.3糖胺聚糖對大鼠血體外復鈣凝血時間的影響

實驗結果見表3。與對照組相比較，肝素鈉中加入3mg/mL和10mg/mL氯化鈣后，能極顯著延長凝血時間（p＜0.01），中高濃度糖胺聚糖中加入3mg/mL氯化鈣后，均能顯著延長凝血時間（p＜0.05），糖胺聚糖中加入10mg/mL氯化鈣后，明顯延長凝血時間，但未達顯著性水平（p＞0.05）。10mg/mL氯化鈣組與3mg/mL氯化鈣組相比較，對照組、肝素鈉和糖胺聚糖均極顯著縮短了凝血時間（p＜0.01）。

表2　糖胺聚糖對血漿凝血因子的影響（n=6）Table 2　Effect of glycosaminoglycan on coagulation factor activities in plasma（n=6）

Ca2+是血液中極其重要的活性離子，作為凝血因子Ⅳ在凝血過程中發(fā)揮極其重要的作用［13］。單環(huán)刺螠糖胺聚糖是一類富含硫酸基團的聚陰離子多糖，對K+、Na+、Ca2+、Mg2+等具有較大的親和力［7］。本研究證實，該糖胺聚糖可通過屏蔽血液中Ca2+，延長大鼠血復鈣凝血時間。

表3　糖胺聚糖對大鼠體外復鈣凝血時間的影響（s，n=6）Table 3　Effect of glycosaminoglycan on blood recalcification time of rats in vitro（s，n=6）

表4　糖胺聚糖對大鼠血液中鈣離子濃度影響（n=6）Table 4　Effect of glycosaminoglycan on Ca2+concentration in rats blood（n=6）

2.4糖胺聚糖對大鼠血液中鈣離子濃度的影響

大鼠血液中鈣離子濃度測定結果見表4，從表4看出，大鼠尾靜脈注射單環(huán)刺螠糖胺聚糖后，血液中鈣離子濃度極顯著降低（p＜0.01），且存在著濃度依賴關系，肝素鈉組大鼠血液中鈣離子濃度明顯低于對照組，但未達顯著水平（p＞0.05），中高濃度糖胺聚糖組大鼠血液中鈣離子濃度極顯著低于肝素鈉組（p＜0.01）；此外還發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠糖胺聚糖降低血液鈣離子濃度的強度極顯著高于肝素鈉（p＜0.01），可能是由于糖胺聚糖的硫酸根含量較高的緣故［7］。

2.5糖胺聚糖對小鼠眼眶后靜脈叢取血過程中血液鈣離子濃度的影響

實驗結果見表5，從表5看出，不同濃度單環(huán)刺螠糖胺聚糖和肝素鈉均能極顯著降低小鼠血液中鈣離子濃度（p＜0.01），與朱偉等［13］的研究結果相一致。Goto等［14］曾給犬股動脈灌注肝素，發(fā)現(xiàn)血液鈣離子水平下降，且呈劑量依賴型。此外，發(fā)現(xiàn)不同濃度糖胺聚糖組小鼠血液中鈣離子濃度極顯著低于肝素鈉組鈣離子濃度（p＜0.01），說明單環(huán)刺螠糖胺聚糖對小鼠血液中鈣離子濃度的影響明顯大于肝素鈉。

表5　糖胺聚糖對小鼠眼眶后靜脈叢血液中鈣離子濃度的影響（n=10）Table 5　Effect of glycosaminoglycan on Ca2+concentration during blood collectin from posterior orbital venous plexus in mice（n=10）

3　結論

單環(huán)刺螠糖胺聚糖抗凝血的可能機制是：糖胺聚糖通過與抗凝血酶Ⅲ結合，抑制凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的活性，直接抑制凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活性，降低血漿中鈣離子濃度，抑制內源性和外源性凝血系統(tǒng)功能，從而完成抗凝血作用。

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Preliminary study on the anticoagulation mechanism of glycosaminoglycan from Urechis unicinctus

CUI Qing-man，LIU Ping，WANG Yue，YUAN Chun-ying
（Tianjin Key Laboratory of Marine Resource and Chemistry，College of Marine Science&Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

In this paper，the anticoagulation approaches of glycosaminoglycan was studied with AT-III-deficient plasma，HC-II-deficient plasma and both factor-deficient plasma in human.The activities of coagulation factor II，V，VII，VIII，IX，X，XI，XII and the fibrinogen content in human plasma were measured using the solidification method.The influence of glycosaminogly could on blood recalcification time in rats was studied by using recalcification experiment.The Ca2+concentrations in rats and mice serum were measured through methyl thymol blue colorimetric method.The results showed that the antithrombin role of glycosaminoglycan from Urechis unicinctus mainly presented AT-Ⅲ dependency.Glycosaminoglycan could passivate the thrombin inhibitory activity of heparin cofactor II.Glycosaminoglycan significantly reduced the activities of coagulation factor V，VII，X，VIII，IX，XI，XII in the plasma（p＜0.05）.Besides，glycosaminoglycan could extend prolong recalcification time in rats by shielding Ca2+in plasma，and significantly reduced Ca2+concentration in rats and mice serum（p＜0.01）.Glycosaminoglycan reduced the Ca2+concentration in a more intensive way than that of heparin sodium（p＜0.01）.

Urechis unicinctus；glycosaminoglycan；anticoagulation mechanism

TS254.9

A

1002-0306（2015）12-0337-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.063

2014－10－20

崔青曼（1964-），女，博士，教授，主要從事海洋生物資源開發(fā)利用技術方面的研究。

天津市自然科學基金重點項目（13JCZDJC29600）。