楊　　劍，邵　榮，王志祥，*，陳然然

（1.中國藥科大學(xué)制藥工程教研室，江蘇南京210009；2.鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城224051）

綜合指標(biāo)正交設(shè)計(jì)優(yōu)選杭白菊揮發(fā)油萃取工藝

楊劍1，邵榮2，王志祥1，*，陳然然1

（1.中國藥科大學(xué)制藥工程教研室，江蘇南京210009；2.鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城224051）

以杭白菊為研究對(duì)象，超臨界CO2為溶劑，β-欖香烯得率和揮發(fā)油得率為指標(biāo)，分別考察顆粒粒徑、萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間對(duì)提取過程的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮雙指標(biāo)，利用正交設(shè)計(jì)，得到優(yōu)化工藝條件：顆粒粒徑80目，萃取壓力17.24MPa，萃取溫度35℃，萃取時(shí)間100min。在此條件下，杭白菊中β-欖香烯得率達(dá)到104.57mg/kg，揮發(fā)油得率達(dá)到3.26%。用綜合指標(biāo)優(yōu)化萃取工藝條件，兼顧了杭白菊中重要抗癌活性成分β-欖香烯得率和揮發(fā)油得率，使工藝條件更加合理。

杭白菊，β-欖香烯，超臨界，綜合指標(biāo)，正交設(shè)計(jì)

杭白菊是藥食兼用的花卉，是浙江省八大名藥材“浙八味”之一，具有很高的藥用價(jià)值和保健價(jià)值［1］。杭白菊中主要活性成分為黃酮類物質(zhì)和揮發(fā)油等。揮發(fā)油中的β-欖香烯具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗腫瘤轉(zhuǎn)移和主動(dòng)免疫保護(hù)等作用，還有抗氧化、抗菌、抗病毒、改善微循環(huán)等作用。因其廣譜、安全、有效、價(jià)廉等突出優(yōu)點(diǎn)而具有良好的應(yīng)用前景。臨床上β-欖香烯可以單獨(dú)使用，或與其他化療藥物合用于治療肺癌、消化道腫瘤、乳腺癌等［2］。

菊花揮發(fā)油的傳統(tǒng)提取法為水蒸氣蒸餾法，但杭白菊的有效成分中有些低沸點(diǎn)、易氧化物質(zhì)，在水蒸氣蒸餾提取時(shí)會(huì)發(fā)生變化和損失，使精油的品質(zhì)下降，且揮發(fā)油得率也很低。超臨界流體萃取技術(shù)具有低溫提取、效率高、無溶劑殘留和可選擇性分離等特點(diǎn)，尤其適用于熱不穩(wěn)定的揮發(fā)性組分的提?。?］。

菊花揮發(fā)油提取工藝的文獻(xiàn)雖有報(bào)道［4-7］，但一般均采用揮發(fā)油得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用超臨界萃取技術(shù)提取杭白菊中的揮發(fā)油，通過氣相色譜內(nèi)標(biāo)法將萃取工藝過程中重要的抗癌活性成分β-欖香烯得率作為主要指標(biāo)，揮發(fā)油得率作為次要指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，綜合考慮雙指標(biāo)，優(yōu)選工藝條件，進(jìn)而為杭白菊中高附加值產(chǎn)物的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

杭白菊浙江遠(yuǎn)福茶葉有限公司；β-欖香烯標(biāo)準(zhǔn)品中國藥品生物制品檢定所；高純二氧化碳鹽城市廣源氣體有限公司；正十二烷標(biāo)準(zhǔn)品上海晶純生化科技股份有限公司；正己烷色譜純。

SFT-100XW超臨界二氧化碳萃取儀美國超臨界流體技術(shù)有限公司；GC-2014氣相色譜儀、AUY220電子天平日本島津公司；720060/720050移液槍蘇州百得實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取揮發(fā)油的工藝流程取一定粒徑的杭白菊，稱為w0，裝于茶葉袋中，稱為w1，置于超臨界萃取釜中萃取，收集萃出的揮發(fā)油，用正己烷定容供β-欖香烯含量測(cè)定備用，并將萃取完成后的含渣茶葉袋稱為w2。則揮發(fā)油的得率計(jì)算公式為：

1.2.2色譜條件色譜柱：SE-54毛細(xì)管色譜柱（30m× 0.32mm，0.25μm）；載氣：氮?dú)?；進(jìn)樣口溫度為280℃；檢測(cè)器溫度：280℃；柱溫：采用程序升溫，起始溫度為50℃，保持2min，再以5℃/min升高到260℃，保持5min。分流比：40；載氣速度：30mL/min，空氣：400mL/min，氫氣：40mL/min；進(jìn)樣量：1μL［8］。

1.2.3β-欖香烯得率測(cè)定稱定β-欖香烯標(biāo)準(zhǔn)品0.0403g于10mL容量瓶中，正己烷定容后精密量取1mL于25mL容量瓶中，并用正己烷定容，得到161.2μg/mL的β-欖香烯標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液；稱定正十二烷0.5993g于10mL容量瓶中，正己烷定容后精密量取1mL于100mL容量瓶中，并用正己烷定容，得到599.3μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液；分別移取β-欖香烯標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液25、50、100、200、400、800μL于1mL量瓶中，并分別加入50μL內(nèi)標(biāo)溶液，經(jīng)氣相色譜制得內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)溶液峰面積之比為橫坐標(biāo)X，對(duì)照品濃度為縱坐標(biāo)C；制得內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線為C=28.852X+0.5949（R2=0.9993，n=6），線性范圍為4.03～128.96μg/mL。依據(jù)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得備用液濃度。超臨界萃取產(chǎn)物用正己烷定容于10mL量瓶中。取250μL于1mL量瓶，加入50μL內(nèi)標(biāo)溶液，定容得供試樣品溶液。經(jīng)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法得樣品溶液中β-欖香烯含量。杭白菊中β-欖香烯含量（mg/kg）按下式計(jì)算：

式中，C為樣品溶液中β欖香烯質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為供試樣品溶液的體積，即1mL；M為加入萃取釜的菊花粉末質(zhì)量（g）。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)超臨界二氧化碳萃取杭白菊揮發(fā)油過程中，影響萃取效果的因素較多，本實(shí)驗(yàn)考察菊花粉末的顆粒粒徑，萃取溫度，萃取壓力和萃取時(shí)間這四個(gè)影響揮發(fā)油萃取效果的主要因素。確定各參數(shù)的較優(yōu)條件。

1.2.4.1顆粒粒徑對(duì)提取效果的影響保持CO2流量為15.00mL/min，分別取粒徑為過40、60、80、100、 120目篩的菊花顆粒14.0g，萃取溫度為45℃，萃取壓力為17.24MPa，萃取60min，研究不同顆粒粒徑對(duì)β-欖香烯得率和菊花揮發(fā)油得率的影響。

1.2.4.2萃取溫度對(duì)提取效果的影響保持CO2流量為15.00mL/min，取粒徑為過100目篩的菊花顆粒14.0g，萃取溫度分別采用32、35、40、45、50℃，萃取壓力為17.24MPa，萃取60min，研究不同萃取溫度對(duì)β-欖香烯得率和菊花揮發(fā)油得率的影響。

1.2.4.3萃取壓力對(duì)提取效果的影響保持CO2流量為15.00mL/min，取粒徑為過100目篩的菊花顆粒14.0g，萃取溫度為35℃，萃取壓力分別采用10.34、13.79、17.24、20.68、24.13MPa，萃取60min，研究不同萃取壓力對(duì)β-欖香烯得率和菊花揮發(fā)油得率的影響。

1.2.4.4萃取時(shí)間對(duì)提取效果的影響保持CO2流量為15.00mL/min，取粒徑為過100目篩的菊花顆粒14.0g，萃取溫度為35℃，萃取壓力為17.24MPa，分別萃取40、60、80、100、120min，研究不同萃取時(shí)間對(duì)β-欖香烯得率和菊花揮發(fā)油得率的影響。

1.2.5工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)β-欖香烯是杭白菊揮發(fā)油中的一種重要的活性成分，在本實(shí)驗(yàn)中，以β-欖香烯得率和杭白菊揮發(fā)油得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。根據(jù)兩指標(biāo)的主次順序，設(shè)定β-欖香烯權(quán)重系數(shù)為0.8，揮發(fā)油權(quán)重系數(shù)為0.2［9］。提取工藝優(yōu)化過程中，分別測(cè)定兩者得率，再通過給出的統(tǒng)計(jì)權(quán)重算出工藝評(píng)價(jià)參數(shù)，對(duì)優(yōu)化工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)參數(shù)的表達(dá)式如下：

1.2.6正交設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用超臨界萃取工藝，選擇顆粒粒徑、萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間四個(gè)因素，以β-欖香烯的得率和杭白菊揮發(fā)油的得率為考察指標(biāo)，選用正交設(shè)計(jì)表L9（34）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1　L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels of L9（34）orthogonal experiments

1.2.7數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)過程中每個(gè)處理均重復(fù)三次，取其平均值。單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)采用Origin pro 7.5和Excel 2010處理數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1顆粒粒徑對(duì)提取效果的影響由圖1可知，隨著目數(shù)增加，β-欖香烯得率先上升后下降。在40～100目，隨著粒徑減小，β-欖香烯得率緩慢升高，這是因?yàn)殡S著顆粒粒徑的減小，內(nèi)傳質(zhì)阻力減小，傳質(zhì)速率增大。但隨后到120目時(shí)，β-欖香烯得率驟降至較低水平，可能是因?yàn)榫栈w粒粒徑較小時(shí)，超臨界CO2流過萃取器中固體介質(zhì)床層時(shí)沒有與固體介質(zhì)有效接觸，沒有發(fā)揮萃取作用，從而導(dǎo)致整體萃取效率下降。另外，粉碎過程中顆粒過細(xì)可能導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分的直接流失。杭白菊揮發(fā)油得率隨著目數(shù)的增加先升高后降低，40～80目提高較快，在80目時(shí)達(dá)到最高。隨著粒徑進(jìn)一步減小，揮發(fā)油得率急劇下降。在60～100目時(shí)，粒徑對(duì)β-欖香烯得率影響甚微，但對(duì)揮發(fā)油得率影響顯著。故選擇粒徑在60～100目比較適宜。

圖1　顆粒粒徑對(duì)β-欖香烯和揮發(fā)油得率的影響Fig.1　Influence of particle diameter on β-elemene and volatile oil yield

2.1.2萃取溫度對(duì)提取效果的影響由圖2可知，隨著萃取溫度的升高，β-欖香烯得率先升高后下降。在32～35℃，隨著溫度的升高，β-欖香烯得率急劇升高，這是因?yàn)闇囟壬邥r(shí)，β-欖香烯的蒸氣壓增大，在超臨界流體中的溶解度增大。在35～50℃，溫度升高，超臨界流體的密度降低，超臨界流體溶解β-欖香烯的能力下降，至50℃時(shí)，β-欖香烯得率下降到較低水平。總體上講，杭白菊揮發(fā)油得率隨溫度升高而緩慢升高，在35～45℃基本保持不變。綜合考慮，萃取溫度選擇在35～45℃較為合理。

圖2　萃取溫度對(duì)β-欖香烯和揮發(fā)油得率的影響Fig.2　Influence of extraction temperature on β-elemeneextraction yield and volatile oil yield

2.1.3萃取壓力對(duì)提取效果的影響由圖3可知，β-欖香烯得率隨著壓力增大先升高后降低，在10.34～17.24MPa，壓力越高，超臨界CO2的密度越大，超臨界CO2的溶解能力越高。17.24MPa以后，隨著壓力進(jìn)一步升高，β-欖香烯的擴(kuò)散系數(shù)也會(huì)逐漸減小，同時(shí)萃取過程中分離選擇性降低，最終導(dǎo)致β-欖香烯得率降低。杭白菊揮發(fā)油得率隨著壓力增加先升高后降低，同樣在17.24MPa達(dá)到最高。高壓條件下選擇性差，揮發(fā)油品質(zhì)較低，同時(shí)考慮到工業(yè)規(guī)模設(shè)備選型和操作要求，選擇較低壓力為宜。所以萃取壓力選擇在10.34～17.24MPa比較合適。

圖3　萃取壓力對(duì)β-欖香烯和揮發(fā)油得率的影響Fig.3　Influence of extraction pressure on β-elemene extraction yield and volatile oil yield

2.1.4萃取時(shí)間對(duì)提取效果的影響由圖4可知，隨著萃取時(shí)間的增加，β-欖香烯得率先升高后降低。在40～100min，隨著萃取時(shí)間的增加，β-欖香烯得率逐漸提高，這是因?yàn)殡S著萃取時(shí)間的延長，溶質(zhì)會(huì)被萃取的越來越充分。然而100min之后，β-欖香烯得率可能由于逸散損失逐漸下降。同時(shí)，萃取時(shí)間過長會(huì)將其他物質(zhì)萃取出來，導(dǎo)致選擇性變差，揮發(fā)油品質(zhì)下降。杭白菊揮發(fā)油得率隨著萃取時(shí)間的延長也是先升高后降低，在100min時(shí)達(dá)到最大值。同時(shí)考慮設(shè)備的運(yùn)行成本和揮發(fā)油的品質(zhì)，萃取時(shí)間選擇在60～100min比較合理。

圖4　萃取時(shí)間對(duì)β-欖香烯和揮發(fā)油得率的影響Fig.4　Influence of extraction time on β-elemene extraction yield and volatile oil yield

2.2正交設(shè)計(jì)優(yōu)化杭白菊揮發(fā)油萃取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響得率的四個(gè)因素按照表1進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

極差分析結(jié)果為RC＞RD＞RB＞RA，即對(duì)杭白菊揮發(fā)油提取效果影響的主次順序?yàn)椋狠腿毫Γ据腿r(shí)間＞萃取溫度＞顆粒粒徑。表3方差分析結(jié)果為FC＞FD＞F0.05＞FB＞FA，表明萃取壓力和萃取時(shí)間對(duì)杭白菊揮發(fā)油萃取效果影響顯著，而萃取溫度和顆粒粒影響不顯著。最佳提取工藝條件為A2B1C3D3，即顆粒粒徑選用80目，萃取溫度為35℃，萃取壓力為17.24MPa，萃取時(shí)間為100min。在此工藝條件下進(jìn)行了三次平行實(shí)驗(yàn)，綜合評(píng)價(jià)參數(shù)為105.79，β-欖香烯的平均得率為104.57mg/kg，杭白菊揮發(fā)油的平均得率為3.26%。而利用水蒸氣蒸餾法從杭白菊中獲得的β-欖香烯得率為12.98mg/kg［10］，揮發(fā)油得率為0.55%［6］，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于超臨界CO2萃取法。

表2　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2　Design and results of orthogonal experiment

表3　正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3　Variance analysis results of orthogonal experiment

3　結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)對(duì)杭白菊中揮發(fā)油提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。最終確定的優(yōu)選工藝條件為顆粒粒徑80目，萃取溫度35℃，萃取壓力17.24MPa，萃取時(shí)間100min，在此實(shí)驗(yàn)條件下，β-欖香烯的平均得率為104.57mg/kg，杭白菊揮發(fā)油的平均得率為3.26%。采用超臨界CO2萃取技術(shù)對(duì)杭白菊中揮發(fā)油成分進(jìn)行了萃取，與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法相比，顯著降低了提取溫度，縮短了提取時(shí)間，大大減少了β-欖香烯在提取過程的氧化變質(zhì)的發(fā)生。

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Optimization of extraction conditions of volatile oil from Chrysanthemum morifolium Ramat by orthogonal design

YANG Jian1，SHAO Rong2，WANG Zhi-xiang1，*，CHEN Ran-ran1
（1.China Pharmaceutical University，Pharmaceutical Engineering Teaching and Research Section，Nanjing 210009，China；2.Yancheng Institute of Technology，School of Chemical and Biological Engineering，Yancheng 224051，China）

With Chrysanthemum morifolium Ramat as the research object，supercritical CO2as solvent，the βelemene yield and volatile oil yield as measure indicators，the effects of four extraction parameters including particle diameter，extraction pressure，extraction temperature，extraction time on extraction processes were separately studied.Then it was optimized using orthogonal design based on single factor investigations for achieving higher β-elemene extraction yield and volatile oil extraction yield.Under the condition of particle diameter of 80 meshes，extraction pressure of 17.24MPa，extraction temperature of 35℃，extraction time of 100min，the β-elemene yield was 104.57mg/kg and the volatile oil yield was 3.26%.It gave priority to βelemene yield with due consideration to volatile oil yield with comprehensive index orthogonal design.It made process conditions more reasonable.

Chrysanthemum morifolium Ramat；β-elemene；supercritical；comprehensive index；orthogonal design

TS201.1

B

1002-0306（2015）12-0270-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.048

2014－09－23

楊劍（1989-），男，碩士，研究方向：制藥分離工程。

王志祥（1968-），男，教授，研究方向：制藥分離工程。