龔　媛，劉敦華，曲云卿，廖若宇，徐夢(mèng)霞

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

響應(yīng)面法優(yōu)化臭氧與紫外復(fù)合處理枸杞干果殺菌工藝

龔媛1，劉敦華2，*，曲云卿3，廖若宇3，徐夢(mèng)霞3

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

以枸杞干果為原料，采用臭氧與紫外復(fù)合處理進(jìn)行殺菌，通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化確定出臭氧與紫外復(fù)合處理枸杞殺菌的最佳工藝條件為：輻射距離31cm、處理時(shí)間32min、臭氧濃度31mg/m3，在此工藝條件下測(cè)得臭氧紫外復(fù)合處理殺菌率為99.999%，在最佳工藝條件下處理對(duì)枸杞干果品質(zhì)無(wú)顯著影響（p＞0.05），表明臭氧與紫外復(fù)合作用在殺菌方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。本文為寧夏枸杞微生物降解提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)和有效的技術(shù)手段。

枸杞，臭氧與紫外復(fù)合處理，殺菌率

隨著生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越注重保健，醫(yī)學(xué)證明枸杞具有保護(hù)肝臟、抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤等作用［1-2］，但因市售枸杞干果的微生物超標(biāo)等問(wèn)題，枸杞的質(zhì)量問(wèn)題備受關(guān)注。因此探尋一種方法以解決超標(biāo)問(wèn)題是非常有必要的。

降解果蔬表面微生物主要方法有：臭氧降解、紫外降解、微波降解、微生物降解等。臭氧是一種不穩(wěn)定伴有特殊氣味的氣體，具有強(qiáng)氧化性，中間不產(chǎn)生有害產(chǎn)物，單個(gè)的氧原子具有極強(qiáng)的氧化性，其強(qiáng)的氧化作用能殺滅多種致病微生物，而多余的氧原子在30min后又會(huì)轉(zhuǎn)化成穩(wěn)態(tài)的氧分子，不會(huì)產(chǎn)生有毒有害的殘留物［3-5］。紫外降解微生物、農(nóng)藥殘留主要利用短波紫外線（254nm）的作用，是能量作用最強(qiáng)的紫外線，一般用來(lái)殺死細(xì)菌和病毒［6］，但會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌增殖等問(wèn)題［7］。單獨(dú)使用臭氧處理含有水的食品，可能會(huì)產(chǎn)生致突變物，會(huì)影響人類健康，并且對(duì)枸杞干果的殺菌效果也不明顯。而臭氧-紫外光輻射聯(lián)用法（O3/UV）法的氧化過(guò)程首先是液相臭氧在紫外光輻射下分解產(chǎn)生OH自由基，再由OH自由基氧化水中的污染物［8］，大大提高了難氧化物質(zhì)的氧化速率。

本研究以枸杞干果為原料，采用臭氧紫外復(fù)合處理進(jìn)行殺菌，通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化確定出臭氧與紫外復(fù)合處理枸杞干果殺菌效果的最佳工藝條件，以期為寧夏枸杞微生物降解提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)和有效的技術(shù)手段。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

枸杞干果寧夏銀川同心路市場(chǎng)，寧杞1號(hào)，水分：11.5874%。

AL204型電子天平梅勒-勒托利多儀器（上海）有限公司；AB-K-Y-10型移動(dòng)式臭氧發(fā)生器南京奧坂干燥設(shè)備廠；DZF-6020型真空干燥箱、DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱、JH-SCA型超凈工作臺(tái)上海鴻都電子科技有限公司；GJWS-A2型溫濕度表天津市津南區(qū)工藝美術(shù)陶瓷廠；7230G可見分光光度計(jì)上海精密科技有限公司；EST-10-03型臭氧濃度檢測(cè)儀深圳市源恒通科技有限公司；20W雙端雙針石英紫外線殺菌消毒燈東?？h創(chuàng)新燈具廠；PW103型空氣加濕器上海奔騰企業(yè)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1枸杞殺菌流程在密封的4m2無(wú)菌室里用（智能檔）加濕器加濕使室內(nèi)濕度達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需濕度，將準(zhǔn)確稱取500g枸杞干果置于已殺過(guò)菌篩子中，關(guān)門，通入臭氧。當(dāng)里面的臭氧濃度穩(wěn)定時(shí)，關(guān)閉臭氧發(fā)生器，打開紫外燈，進(jìn)行殺菌，殺菌結(jié)束后迅速將枸杞干果烘干裝入無(wú)菌自封袋中，并封口，置于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行微生物檢測(cè)。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別考察輻射距離、輻射時(shí)間、臭氧濃度、臭氧處理時(shí)間以及相對(duì)濕度各因素對(duì)臭氧與紫外復(fù)合處理枸杞干果殺菌率的影響，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，確定各因素的適宜條件。

分別選取輻射距離30cm，輻射時(shí)間40min，臭氧濃度12.72mg/m3，臭氧處理時(shí)間30min，相對(duì)濕度90%的條件下，考察不同紫外輻射距離（10、20、30、40、50、60cm）、紫外輻射時(shí)間（20、30、40、50、60、90min）、臭氧濃度（0、6.36、12.72、25.44、38.16mg/m3）、臭氧處理時(shí)間（20、30、40、50、60min）、相對(duì)濕度（50%、60%、70%、80%、90%、95%）對(duì)臭氧與紫外復(fù)合處理枸杞干果殺菌效果的影響。

1.2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken Design（BBD）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)擬合出多項(xiàng)回歸模型并進(jìn)行方差分析，確定出臭氧與紫外復(fù)合處理枸杞干果最大殺菌率的最優(yōu)工藝條件。

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上選取單因素的最佳條件：輻射距離30cm、處理時(shí)間40min、臭氧濃度25.44mg/m3作為自變量，殺菌率（Y）作為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)（見表1）。

表1　BBD設(shè)計(jì)因素水平表Table 1　Factors and levels in the BBD design

1.2.4枸杞干果微生物降解前后品質(zhì)變化測(cè)定根據(jù)SNT 0878-2000《進(jìn)出口枸杞子檢驗(yàn)規(guī)程》測(cè)定臭氧與紫外復(fù)合處理后的枸杞干果的理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)。

1.2.5微生物測(cè)定根據(jù)GB47892-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定細(xì)菌總數(shù)；SNT 0169-2010《進(jìn)出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢測(cè)方法》測(cè)定大腸菌群數(shù)。

1.2.6殺菌率計(jì)算公式

殺菌率（%）＝（殺菌前菌落總數(shù)-殺菌后菌落總數(shù)）/殺菌前菌落總數(shù)×100

1.2.7理化指標(biāo)的測(cè)定水分：GB 5009.3《食品中水分的測(cè)定》直接干燥法；灰分：GB 5009.4《食品中灰分的測(cè)定》；總糖：GB 18672-2014《枸杞》；蛋白質(zhì)：GB 5009.5《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；脂肪：GB 5009.6《食品中脂肪的測(cè)定》。

1.2.8大腸菌群檢測(cè)根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出最佳工藝條件處理枸杞干果后，對(duì)其大腸菌群數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1輻射距離對(duì)枸杞干果殺菌率的影響由圖1可知，隨著輻射距離的減小，臭氧紫外復(fù)合處理對(duì)枸杞干果的殺菌率逐漸增大，并且輻射距離越近，紫外線更易被生物體吸收，并直接作用于微生物的遺傳物質(zhì)DNA，使DNA結(jié)構(gòu)遭到破壞，而使微生物不能繁殖生長(zhǎng)，從而使殺菌率增大；方差分析表明，不同輻射距離之間，殺菌率呈現(xiàn)明顯的差異性（p＜0.05），輻射距離在10、20、30cm之間差異不太明顯，但輻射距離太近會(huì)影響枸杞干果的品質(zhì)［9］，所以輻射距離選取的最佳范圍是20～30cm。

圖1　輻射距離對(duì)枸杞干果殺菌率的影響Fig.1　Influence of radiation distance on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

2.1.2輻射時(shí)間對(duì)枸杞干果殺菌率的影響由圖2可知，隨著紫外線輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，臭氧紫外復(fù)合處理對(duì)枸杞干果的殺菌率逐漸增大，紫外輻射時(shí)間越長(zhǎng)，紫外線對(duì)微生物DNA結(jié)構(gòu)破壞的更徹底，微生物不能合成蛋白質(zhì)和酶而死亡，從而提高了殺菌率。方差分析結(jié)果表明，當(dāng)輻射時(shí)間大于40min時(shí)殺菌率達(dá)97%以上，60～90min時(shí)，殺菌率無(wú)明顯差異（p＞0.05），并且在90min時(shí)，殺菌率達(dá)到99.99%，考慮到紫外長(zhǎng)時(shí)間作用枸杞干果對(duì)其品質(zhì)的影響，所以輻射時(shí)間的最佳范圍50～60min。

2.1.3臭氧濃度對(duì)枸杞干果表面微生物殺菌率的影響由圖3及方差分析可知，隨著臭氧濃度的增大，臭氧紫外復(fù)合處理枸杞干果的殺菌率逐漸增大，在低濃度范圍內(nèi)，不同臭氧濃度對(duì)枸杞干果殺菌率的影響存在著顯著差異，高濃度的臭氧對(duì)枸杞干果殺菌率的影響無(wú)明顯差異（p＜0.05），臭氧殺菌是通果破壞細(xì)胞膜成分，改變細(xì)胞膜通透性，阻止菌體新陳代謝從而達(dá)到殺菌的作用，臭氧濃度越高，阻止菌體新陳代謝的效果越好，殺菌效果也就越明顯，但高濃度的臭氧會(huì)對(duì)人體和大氣造成很大的危害，所以臭氧濃度的最佳范圍為12.72～38.17mg/m3。

2.1.4臭氧處理時(shí)間對(duì)枸杞干果殺菌率的影響由圖4可知，隨著臭氧處理時(shí)間的延長(zhǎng)，臭氧紫外復(fù)合處理對(duì)枸杞干果的殺菌率逐漸增高，方差分析表明，在50min之前不同臭氧處理時(shí)間的殺菌率存在著顯著差異（p＜0.05），這是因?yàn)橐欢舛鹊某粞跗茐奈⑸锛?xì)胞膜的成分，阻止菌體新陳代謝，臭氧會(huì)隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)繼續(xù)滲透于菌體內(nèi)部使其死亡，本實(shí)驗(yàn)臭氧處理時(shí)間在50min以上，殺菌率無(wú)顯著性差異，綜合考慮，臭氧處理時(shí)間范圍是30～60min。

2.1.5相對(duì)濕度對(duì)枸杞干果殺菌率的影響由圖5可知，隨著室內(nèi)相對(duì)濕度的增加，臭氧紫外復(fù)合處理枸杞干果的殺菌率總體呈上升的趨勢(shì)，說(shuō)明增加相對(duì)濕度可以提高臭氧紫外復(fù)合處理的殺菌率，這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道一致［10-11］。主要是因?yàn)闈穸仍酱?，微生物?xì)胞膜因膨脹而變薄，其組織更易被臭氧破壞。方差分析可知，相對(duì)濕度對(duì)殺菌率的影響極顯著（p＜0.01），當(dāng)相對(duì)濕度大于90%時(shí)，殺菌率無(wú)明顯差異，根據(jù)文獻(xiàn)［12］，相對(duì)濕度越高殺菌效果越明顯，此實(shí)驗(yàn)相對(duì)濕度最佳取值應(yīng)為90%±5%。

圖2　輻射時(shí)間對(duì)枸杞干果殺菌率的影響Fig.2　Influence of radiation time on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

圖3　臭氧濃度對(duì)枸杞干果殺菌率的影響Fig.3　Influence of the ozone concentration on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

圖4　臭氧處理時(shí)間對(duì)枸杞干果殺菌率的影響Fig.4　Influence of the ozone processing time on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

圖5　相對(duì)濕度對(duì)枸杞干果殺菌率的影響Fig.5　Influence of relative humidity on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可得，此實(shí)驗(yàn)是臭氧紫外復(fù)合處理枸杞干果，輻射時(shí)間與臭氧處理時(shí)間最佳范圍大致相同，所以將這兩個(gè)因素合并為一個(gè)因素：處理時(shí)間，綜合考慮，確定出單因素實(shí)驗(yàn)的最佳條件為：相對(duì)濕度90%±5%，輻射距離30cm，處理時(shí)間40min，臭氧濃度25.44mg/m3。

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果該研究選用Box-Behnken Design（BBD）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在三個(gè)中心點(diǎn)處共進(jìn)行15次實(shí)驗(yàn)，其中12次是分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果隨機(jī)完成，結(jié)果見表2。

通過(guò)Design Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到響應(yīng)值與各因素之間二次多元回歸擬合方程如下：

Y=99.88-0.35X1+0.062X2+2.27X3+0.095X1X2+ 0.28X1X3-0.69X12-0.68X22-1.53X32，對(duì)此模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，該模型極顯著（p＜0.0001），表明本實(shí)驗(yàn)采用的二次模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；臭氧紫外殺菌率失擬項(xiàng)p=0.0711不顯著，表明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用來(lái)預(yù)測(cè)臭氧紫外復(fù)合作用對(duì)枸杞干果微生物殺菌工藝的條件。方程的一次項(xiàng)中X1、X3，二次項(xiàng)X12、X22、X32，交互項(xiàng)X1X3對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著（p＜0.01）。表明實(shí)驗(yàn)的各因素與響應(yīng)值之間關(guān)系復(fù)雜，不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。由F值的大小，可以反映出各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值影響程度，F(xiàn)值越大，表明對(duì)響應(yīng)值的影響越大。通過(guò)方差分析表可知，對(duì)枸杞干果微生物殺菌率影響程度的大小順序是：臭氧濃度＞輻射距離＞處理時(shí)間。

2.2.2響應(yīng)面分析經(jīng)Design Expert v8.0.6 Trial軟件分析，由回歸方程分析得到殺菌率與各因素的響應(yīng)面結(jié)果見圖。3D響應(yīng)面圖將二次回歸模型直觀的展現(xiàn)出來(lái)。在響應(yīng)面圖中，曲面越陡峭，表明該實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。等高線圖與響應(yīng)面圖相對(duì)應(yīng)，等高線圖隨著響應(yīng)面圖的變化而變化，其曲線越接近中心，則對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值也就越大［13］。

表2　BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2　Design and result of BBD

表3　臭氧紫外復(fù)合殺菌率研究模型的方差分析結(jié)果Table 3　Research model analysis of variance for ozone and ultraviolet combined sterilization efficiency

圖6表示了處理時(shí)間和輻射距離對(duì)枸杞干果殺菌率的交互作用，隨著輻射距離的增大，殺菌率逐漸降低，當(dāng)輻射距離大于30cm時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，殺菌率逐漸升高，說(shuō)明距離遠(yuǎn)時(shí)，處理時(shí)間影響比較顯著，而從整個(gè)交互作用來(lái)看，輻射距離對(duì)殺菌率影響比較大。

圖6　處理時(shí)間和輻射距離對(duì)枸杞干果殺菌率影響的響應(yīng)面Fig.6　Response surface showing the effects of processing time and radiation distance on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

由圖7可以看出，無(wú)論處理時(shí)間短還是長(zhǎng)，隨著臭氧濃度的增大，殺菌率都明顯增大。臭氧濃度一定時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，殺菌率呈緩慢的先增后減。

圖7　臭氧濃度和處理時(shí)間對(duì)枸杞干果殺菌率影響的響應(yīng)面Fig.7　Response surface showing the effects of the ozone concentration and processing time on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

由圖8可以看出，響應(yīng)面陡峭，臭氧濃度和輻射距離的交互作用對(duì)枸杞干果殺菌率的影響很顯著，當(dāng)輻射距離小于40cm時(shí)，隨著臭氧濃度的增大，殺菌率都明顯增大，并能接近100%，但當(dāng)輻射距離為40cm時(shí)，雖然殺菌率隨臭氧濃度的增大而增大，當(dāng)殺菌率永遠(yuǎn)都達(dá)不到100%；臭氧濃度一定時(shí)，隨著輻射距離的增大，殺菌率呈緩慢的先增后減。

圖8　臭氧濃度和輻射距離對(duì)枸杞干果殺菌率影響的響應(yīng)面Fig.8　Response surface showing the effects of the ozone concentration and radiation distance on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

2.3最佳工藝參數(shù)的確定于模型驗(yàn)證

在相對(duì)濕度為90%±5%，根據(jù)回歸方程預(yù)測(cè)及響應(yīng)面分析結(jié)果，由軟件分析得出臭氧與紫外復(fù)合處理枸杞干果殺菌效果的最佳工藝條件為：輻射距離30.79cm、處理時(shí)間31.84min、臭氧濃度31.18mg/m3，理論殺菌率為100%?？紤]到實(shí)際操作問(wèn)題，最終確定臭氧與紫外復(fù)合處理枸杞干果殺菌效果的的最佳工藝條件為：輻射距離31cm、處理時(shí)間32min、臭氧濃度31mg/m3。以此條件進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得枸杞干果的殺菌率為99.999%，與理論值基本一致，說(shuō)明方程與實(shí)際情況擬合較好，所建模型適用于研究臭氧與紫外復(fù)合處理對(duì)枸杞干果殺菌效果的影響。

2.4枸杞干果微生物降解前后品質(zhì)變化測(cè)定

通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化出的最佳工藝條件：輻射距離31cm、處理時(shí)間32min、臭氧濃度31（mg/m3）以此條件進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定臭氧與紫外復(fù)合處理前后的枸杞干果的品質(zhì)指標(biāo)，見表4。

表4　處理前后枸杞干果品質(zhì)指標(biāo)Table 4　The quality indexes of dried Lycium barbarum L.before and after processing

處理后灰分總糖、蛋白質(zhì)、脂肪減少，水分的變化最大且處理后的水分增加，由于本實(shí)驗(yàn)在相對(duì)濕度90%±5%的環(huán)境中進(jìn)行的，枸杞容易吸潮，所以導(dǎo)致水分增加，但仍在枸杞干儲(chǔ)存范圍內(nèi)，經(jīng)方差分析可知處理前后各理化指標(biāo)均無(wú)明顯差異，且微生物指標(biāo)都在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

3　結(jié)論

本研究以臭氧與紫外復(fù)合處理枸杞干果，使用SPSS軟件和Design Expert軟件分析確定出臭氧與紫外復(fù)合處理枸杞干果殺菌效果的最佳工藝條件為：輻射距離31cm、處理時(shí)間32min、臭氧濃度31mg/m3，在此條件下實(shí)際測(cè)得臭氧紫外復(fù)合殺菌率為99.999%，菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)均在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)；臭氧與紫外復(fù)合處理對(duì)枸杞干果品質(zhì)無(wú)顯著影響，處理后的干果品質(zhì)均在枸杞子進(jìn)出口標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)，表明臭氧紫外復(fù)合作用在殺滅菌方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，為枸杞的安全性、可食性開辟了一條新的道路。

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Optimization of ozone and ultraviolet combined on dried Lycium barbarum L.sterilization process by response surface methodology

GONG Yuan1，LIU Dun-hua2，*，QU Yun-qing3，LIAO Ruo-yu3，XU Meng-xia3
（College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

Ozone and ultraviolet combined on Lycium barbarum L.dry fruit sterilization process.Sterilization process conditions were further optimized using response surface methodology as follow：radiation distance 31cm，processing time 32min，the ozone concentration 31mg/m3，for this condition，the sterilizing efficiency of ozone and ultraviolet combined on Lycium barbarum L.could be 99.999%.The quality of Lycium barbarum L.dry fruit did not change significantly after treatment under optimum conditions（p＞0.05）.This result indicating that the compound effects of ozone and ultraviolet had a certain advantages in terms of sterilization and provided scientific data and effective technical means for microbes degradation of Lycium barbarum L.Ningxia.

Lycium barbarum L.；ozone and ultraviolet combined；sterilization efficiency

TS255.36

B

1002-0306（2015）12-0254-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.045

2014－10－30

龔媛（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

劉敦華（1964-），男，博士，教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全。