張生生，閆靜芳，陸兆新，張麗娟，武奔月，陳陽(yáng)陽(yáng)，王昱灃

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095）

銳孔凝固浴法制備表面活性肽微膠囊

張生生，閆靜芳，陸兆新，張麗娟，武奔月，陳陽(yáng)陽(yáng)，王昱灃*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095）

采用銳孔凝固浴法制備表面活性肽微膠囊，并以海藻酸鈉為壁材，氯化鈣溶液作為固化液。在單因素的基礎(chǔ)上，以包埋率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)微膠囊制備過程中的氯化鈣濃度、芯壁比、海藻酸鈉濃度、操作溫度四個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：氯化鈣濃度為2%，操作溫度為49℃，海藻酸鈉與表面活性肽比例為1∶2，海藻酸鈉濃度為2.4%時(shí)，包埋率達(dá)到了87.6%，載藥量為12.5%。通過腸液緩釋實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，微膠囊在9h內(nèi)的釋放率達(dá)到了91.7%，具有很好的緩釋效果。

銳孔凝固浴法，微膠囊，表面活性肽，響應(yīng)曲面法

抗菌脂肽是由β-胺基脂肪酸與多肽以酰胺鍵結(jié)合而成［1］，并同時(shí)具有親水和親油基團(tuán)的兩親型物質(zhì)［2］。主要包括Surfactin（表面活性肽）、Iturin（伊枯草菌素）、Fengycin（芬薺素）等［3］，它們的合成是在革蘭氏芽孢桿菌內(nèi)以非核糖體的方式進(jìn)行［4-7］。Surfactin的分子則是由一個(gè)C（13～15）的脂肪酸鏈與一個(gè)由七個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽環(huán)以酰胺鍵的形式結(jié)合而成，分子量約為1000。

Surfactin是具有很高表面活性的生物類表面活性劑，相較于現(xiàn)在大量使用的化學(xué)合成表面活性劑，具有易降解、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，是表面活性劑未來的發(fā)展趨勢(shì)［8］。Surfactin的兩親分子結(jié)構(gòu)能夠提高微生物對(duì)石油類物質(zhì)的利用，促進(jìn)原油的分解，對(duì)那些被原油污染地區(qū)的土壤生態(tài)回復(fù)過程起到非常明顯的作用［9-10］，能夠有效緩解石油污染對(duì)環(huán)境的危害。研究還發(fā)現(xiàn)，Surfactin能夠有效地抑制真菌和細(xì)菌、病毒等病原體的生長(zhǎng)［11］，同時(shí)具有高效、不易產(chǎn)生抗藥性，因此可作為代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素的新型抑菌劑在醫(yī)藥行業(yè)中使用。Surfactin作為一種生物活性物質(zhì)，雖然具有潛在的應(yīng)用前景，但是相較于化學(xué)合成類物質(zhì)具有十分不穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)。暴露于過熱、過酸堿等逆境中，易受到外界環(huán)境的影響，甚至被一些微生物降解。因此為擴(kuò)大Surfactin的應(yīng)用范圍，使其持續(xù)有效地發(fā)揮生物活性，有必要采取措施增強(qiáng)Surfactin抵御外界不利環(huán)境的能力。微膠囊技術(shù)是未來食品與醫(yī)藥行業(yè)重點(diǎn)研究的領(lǐng)域，它不但能夠保護(hù)生物分子的活性，還能使其獲得緩釋的能力。而銳孔法微膠囊技術(shù)所需要的設(shè)備簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，易于工業(yè)上的擴(kuò)大生產(chǎn)。將銳孔凝固浴法應(yīng)用于surfactin的包埋能夠提高其在環(huán)境中的穩(wěn)定性，并獲得緩釋的能力，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

淀粉液化芽孢桿菌fmb50為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建與保藏；海藻酸鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水氯化鈣上海久億化學(xué)試劑有限公司；乙醇南京試劑廠；乙腈、三氟乙酸（色譜純） 德國(guó)Merck公司；超純水娃哈哈集團(tuán)公司。

ZQTY-70振蕩培養(yǎng)箱上海知楚儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋上海維城儀器有限公司；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司儀器設(shè)備廠；5mL注射器常州市回春醫(yī)療器材有限公司；WH-1微型旋渦混合儀上海滬西分析儀器廠有限公司；CP-114先行者精密電子天平美國(guó)OHAUS公司；SB5200DT超聲波清洗器寧波新芝生物科技股份有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀美國(guó)Aglient公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1抗菌脂肽樣品的制備采用搖瓶發(fā)酵的方法制備樣品，在landy培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加3‰的大豆油，接種后在33℃，180r/min條件下振蕩培養(yǎng)36h，經(jīng)分離純化得到抗菌脂肽樣品［12］。

1.2.2微膠囊制備流程將制備的抗菌脂肽樣品溶于超純水后，混勻，再加入一定比例的海藻酸鈉，水浴40℃溶解，將裝有混合液的25mL燒杯放置在所設(shè)定的溫度水浴鍋中，使用5mL的注射器吸取適量的混合液，以較快的速度推動(dòng)活塞，但是維持注射器前端滴下的液滴呈明顯的顆粒。造粒結(jié)束后固化0.5h，固化液為氯化鈣溶液，然后進(jìn)行抽濾，得到抗菌脂肽濕微囊。在45℃烘箱中烘干得到抗菌脂肽微膠囊成品［13］。

抗菌脂肽樣品+超純水→渦旋混合→加入海藻酸鈉→混合→水浴，溶解→銳孔造?！淘∧獭闉V，干燥→成品

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1氯化鈣對(duì)包埋率的影響稱取一定量的抗菌脂肽樣品以1∶1的比例與海藻酸鈉混合，溶解后使海藻酸鈉濃度為2%，置于40℃水浴鍋中，造粒時(shí)固化液氯化鈣的濃度設(shè)置為1%、2%、3%、4%，固化0.5h，抽濾干燥后，洗脫微囊表面的抗菌脂肽，并以HPLC法測(cè)定其含量，計(jì)算包埋率。

1.2.3.2操作溫度對(duì)包埋率的影響稱取一定量的抗菌脂肽樣品以1∶1的比例與海藻酸鈉混合，溶解后使海藻酸鈉濃度為2%，置于20、30、40、50℃水浴鍋中，造粒時(shí)固化液氯化鈣的濃度為2%，固化0.5h，抽濾干燥后，洗脫微囊表面的抗菌脂肽，并以HPLC法測(cè)定其含量，計(jì)算包埋率。

1.2.3.3芯壁比對(duì)包埋率的影響稱取一定量的抗菌脂肽樣品以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2的比例與海藻酸鈉混合，溶解后使海藻酸鈉濃度為2%，置于40℃水浴鍋中，造粒時(shí)固化液氯化鈣的濃度設(shè)置為2%，固化0.5h，抽濾干燥后，洗脫微囊表面的抗菌脂肽，并以HPLC法測(cè)定其含量，計(jì)算包埋率。

1.2.3.4海藻酸鈉濃度對(duì)包埋率的影響稱取一定量的抗菌脂肽樣品以1∶1的比例與海藻酸鈉混合，溶解后使海藻酸鈉濃度為1.0%、1.5%、2%、2.5%，置于40℃水浴鍋中，造粒時(shí)固化液氯化鈣的濃度設(shè)置為2%，固化0.5h，抽濾干燥后，洗脫微囊表面的抗菌脂肽，并以HPLC法測(cè)定其含量，計(jì)算包埋率。

1.2.4微膠囊制備工藝的響應(yīng)曲面法優(yōu)化根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以微膠囊的包埋率為響應(yīng)值（Y），每一個(gè)自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1、0、+1進(jìn)行編碼。因素編碼及水平見表1。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1　響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)水平及編碼Table 1　Levels and codes of response surface experiments

1.2.5包埋效果的評(píng)定采用包埋率作為微膠囊包埋效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，制備的微膠囊加入到5mL乙醇中，25℃，200r/min條件下恒溫振蕩洗脫0.5h。然后通過HPLC檢測(cè)洗脫液中的Surfactin含量c（mg/mL）。

包埋率的計(jì)算：

包埋率（%）=（m-5c）/m×100

式中，m：加入樣品的總質(zhì)量，mg。

1.2.6緩釋性能的研究將以100mg樣品制備的微膠囊置于100mL人工胃液、腸液［14］中，37℃，200r/min條件下振蕩，分別在0.5、1、……、30h時(shí)量取緩釋液，并通過液相檢測(cè)其中的Surfactin的含量，計(jì)算釋放率。

1.2.7載藥量的計(jì)算載藥量為微囊內(nèi)抗菌肽的質(zhì)量與微囊總質(zhì)量之間的比值。取一定量的樣品，制備微膠囊后，完全烘干，稱量微膠囊的質(zhì)量m1（mg）。然后在研缽中將微膠囊研碎，加入10mL的無(wú)水乙醇，充分混合溶解后，離心得到上清液。以液相檢測(cè)上清液中的抗菌脂肽含量c（mg/mL）

載藥量（%）=10c/m1×100

式中，c上清液中抗菌脂肽的含量，mg/mL；m1為制備得到的微膠囊總質(zhì)量，mg。

1.3數(shù)據(jù)處理

本文實(shí)驗(yàn)均為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用SAS 8.0和Design Expert 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平為p＜0.05，作圖為Orgin 8.0版本。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1氯化鈣濃度對(duì)包埋率的影響如圖1所示，在氯化鈣濃度小于2%的范圍內(nèi)包埋率呈上升的趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著氯化鈣濃度的升高，海藻酸鈉與Ca+在微囊表面形成致密的保護(hù)層，能夠有效的將Surfactin包封在微囊的內(nèi)部。但是當(dāng)氯化鈣濃度高于2%時(shí)，包埋率反而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因?yàn)楫?dāng)氯化鈣濃度過高時(shí)，微囊表面形成的保護(hù)層過于致密，當(dāng)以45℃進(jìn)行烘干時(shí)，烘干時(shí)間增加，并且微囊表面部分破裂，導(dǎo)致已經(jīng)包埋的樣品被洗脫下來，包埋率因此下降。經(jīng)過顯著性分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)氯化鈣濃度為2%時(shí)，與其他因素之間差異性顯著。因此選取2%的氯化鈣濃度最為該組實(shí)驗(yàn)的最佳條件。

圖1　氯化鈣濃度對(duì)包埋率的影響Fig.1　Effect of concentration of calcium chloride on the encapsulation efficiency

2.1.2溫度對(duì)包埋率的影響由圖2可知，在50℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，Surfactin包埋率一直在上升。這是因?yàn)檩^高溫度條件能夠促進(jìn)海藻酸鈉分子結(jié)構(gòu)的展開，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，海藻酸鈉與鈣離子的聚合反應(yīng)也會(huì)加烈，在微囊表面形成致密的保護(hù)層。但是考慮到Surfactin與海藻酸鈉都是生物活性物質(zhì)，超過一定溫度會(huì)使分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，失去生物活性。經(jīng)過顯著性分析發(fā)現(xiàn)50℃時(shí)與其他因素之間差異性顯著，因此綜合考慮選取50℃作為溫度單因素實(shí)驗(yàn)的最佳條件。

圖2　溫度對(duì)包埋率的影響Fig.2　Effect of temperature on the encapsulation efficiency

2.1.3芯壁材比對(duì)包埋率的影響由圖3可知，當(dāng)海藻酸鈉與Surfactin比例由2∶1～1∶2時(shí)，包埋率變化范圍不大，差異不顯著。海藻酸鈉與Surfactin比例增加到1∶3時(shí)，包埋率急劇下降，形成微囊的形狀不規(guī)則。而且隨著抗菌脂肽所占比例的提高，微膠囊載藥量隨之增加。當(dāng)以包埋率為指標(biāo)時(shí)，經(jīng)過顯著性分析，海藻酸鈉與Surfactin比例為1∶3與其他實(shí)驗(yàn)點(diǎn)之間的差異性顯著，下降趨勢(shì)明顯。當(dāng)以載藥量為指標(biāo)時(shí)，海藻酸鈉與Surfactin比例（2∶1，1∶1）同（1∶2，1∶3）之間的差異性顯著（p＜0.05）。但是海藻酸鈉與Surfactin比例1∶2同海藻酸鈉與Surfactin比例1∶3之間的差異性不顯著，載藥量的上升趨勢(shì)不明顯。綜合考慮包埋率和載藥量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)，選取1∶2作為最佳的海藻酸鈉：Surfactin比例。

圖3　芯壁比對(duì)包埋率的影響Fig.3　Effect of the rate（surfactin∶sodium alginate）on encapsulation efficiency

2.1.4海藻酸鈉濃度對(duì)包埋率的影響由圖4可知，隨著海藻酸鈉濃度的升高，包埋率先升高后下降。是因?yàn)樵诤Ｔ逅徕c濃度超過2.5%時(shí)，微囊固化效果雖然更好，但是混合液的粘度很大，而造粒時(shí)使用的注射器孔徑較小，造成造粒壓力極大。而且微囊在氯化鈣溶液中呈現(xiàn)不成形的片狀，包埋效果變差。濃度為2.0%時(shí)，與其他水平之間差異性顯著。因此選取2.0%作為制備過程中最佳的海藻酸鈉濃度。

圖4　海藻酸鈉濃度對(duì)包埋率的影響Fig.4　Effect of concentration of calcium chloride on the encapsulation efficiency

2.2響應(yīng)曲面法優(yōu)化微膠囊制備工藝條件

2.2.1響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2.2回歸模型的建立及顯著性分析利用Design expert 8.0進(jìn)行多元回歸擬合，得到以包埋率為響應(yīng)值（Y）對(duì)氯化鈣濃度（A）、溫度（B）、芯壁比（C）、海藻酸鈉濃度（D）四個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y= 0.86-0.046A-0.027B-0.004933C-0.10D+0.023AB+ 0.02AC+0.016AD-0.12BC+0.034BD+0.065CD-0.19A2-0.11B2-0.22C2-0.19D2

回歸方程方差分析結(jié)果如表3所示：

模型的回歸分析見表3。該模型的p＜0.01，說明模型是極顯著的，與實(shí)驗(yàn)的擬合度高，能夠很好地反應(yīng)各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。失擬項(xiàng)值＞0.05，該項(xiàng)不顯著，說明實(shí)驗(yàn)中的誤差控制在合理的范圍內(nèi)，模型能夠充分反映實(shí)際情況。通過對(duì)每個(gè)因素方差分析的比較可以發(fā)現(xiàn)，氯化鈣濃度、海藻酸鈉濃度、操作溫度的一次項(xiàng)及其二次項(xiàng)，芯壁比的二次項(xiàng)，海藻酸鈉濃度與芯壁比、海藻酸鈉與操作溫度、芯壁比與操作溫度的交互影響的p＜0.01，說明對(duì)包埋率的影響極其顯著。而芯壁比的一次項(xiàng)，氯化鈣濃度與海藻酸鈉濃度、芯壁比、操作溫度交互作用的p＞0.05，說明對(duì)包埋率的影響不顯著。

表2　Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及包埋率的測(cè)定值Table 2　Box-Behnken design matrix and the response of the dependent variables of encapsulation efficiency

表3　方差分析結(jié)果Table 3　Results of variance analysis

圖5　溫度與芯壁比（海藻酸鈉∶srf）對(duì)包埋率影響的響應(yīng)面圖Fig.5　Response surface for effect of temperature and ratio of wall to core on the capsulation efficiency

2.2.3響應(yīng)面分析從方差分析中可知，氯化鈣濃度與另外三個(gè)因素之間的交互關(guān)系不顯著，即氯化鈣濃度對(duì)包埋率的影響是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。為了考察微膠囊制備工藝其他三個(gè)因素中兩個(gè)因素之間的交互影響，將其他因素保持不變，就可以得到反映該兩種因素對(duì)包埋率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，見圖5～圖7。溫度與芯壁比、芯壁比與海藻酸鈉濃度的交互作用極顯著，溫度與海藻酸鈉濃度的交互作用顯著，與方差分析中的p值分析結(jié)果一致。

2.2.4包埋工藝的優(yōu)化組合及其驗(yàn)證根據(jù)BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果和二元多次回歸方程，利用Design Expert軟件計(jì)算出最佳的微膠囊制備工藝，為了實(shí)際中較易操作，對(duì)結(jié)果進(jìn)行了調(diào)整：氯化鈣濃度為2%，操作溫度為49℃，海藻酸鈉與Surfactin比例為1∶2，海藻酸鈉濃度為2.4%時(shí)，包埋率高達(dá)88.5%。根據(jù)得到的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)所測(cè)其包埋率為87.6%，與理論值相比下降了1.01%。由此可見，本實(shí)驗(yàn)建立的模型很好的預(yù)測(cè)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3微膠囊緩釋性能的研究

經(jīng)過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在模擬胃液中未發(fā)現(xiàn)Surfactin，這是因?yàn)楹Ｔ逅徕c與鈣離子形成的聚合物在胃液的酸性pH（1.5～2.0）條件下穩(wěn)定，微囊表面不發(fā)生破裂，所以沒有樣品釋放。腸液的pH為6.8，在此條件下，海藻酸凝膠發(fā)生腫脹，導(dǎo)致表面破裂，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)部的樣品逐漸被釋放出來。釋放效果如圖8所示，在時(shí)間為9h時(shí)，微膠囊的累計(jì)釋放率已經(jīng)達(dá)到91.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明微膠囊在進(jìn)入生物體后，在胃液中穩(wěn)定，進(jìn)入腸液中會(huì)緩慢釋放出來，被生物體吸收。微膠囊能夠作為動(dòng)物類抗生素藥物使用。

圖6　溫度與海藻酸濃度對(duì)包埋率影響的響應(yīng)面圖Fig.6　Response surface effect of temperature and concentration of sodium alginate on the capsulation efficiency

圖7　海藻酸鈉濃度與芯壁比（海藻酸鈉∶srf）對(duì)包埋率影響的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface for effect of concentration of sodium alginate and proporation of wall to core on the capsulation efficiency

圖8　微膠囊在模擬腸液中的累計(jì)釋放Fig.8　The cumulative release of microcapsule in simulation of intestinal juice

3　結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)確定在Surfactin微膠囊制備過程中各項(xiàng)工藝的最佳值，然后通過BBD中心組合設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析，建立包埋率與影響因素的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型顯著，具有很好的擬合度，能夠預(yù)測(cè)出最佳的包埋工藝。優(yōu)化的最佳條件為：氯化鈣濃度為2%，操作溫度為49℃，海藻酸鈉與Surfactin比例為1∶2，海藻酸鈉濃度為2.4%時(shí)，包埋率達(dá)到了87.6%。本實(shí)驗(yàn)采用的包埋方法，操作簡(jiǎn)單，而且包埋效果良好。經(jīng)過計(jì)算發(fā)現(xiàn)微膠囊的載藥量達(dá)到12.5%。Surfactin的微膠囊化能夠提高在環(huán)境中的穩(wěn)定性，獲得緩釋的性能，在人工腸液中的累計(jì)釋放率達(dá)到91.7%，為抗菌脂肽微膠囊能夠作為口服抗生素使用提供了初步實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是現(xiàn)階段銳孔凝固浴存在規(guī)模放大困難、微囊粒徑大的問題，相信未來通過改變?cè)炝７绞?，例如通過氮?dú)鈮毫ν苿?dòng)造粒能夠提高造粒效率、減小粒徑。

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The preparation of surfactin microcapsules by the method of piercing-solidifying

ZHANG Sheng-sheng，YAN Jing-fang，LU Zhao-xin，ZHANG Li-juan，WU Ben-yue，CHEN Yang-yang，WANG Yu-feng*
（College of Food Science and Technology，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095，China）

In this paper，piercing-solidifying method was applied to obtain the capsules of surfactin with sodium alginate as wall material and calcium chloride as solid solvent.On the basement of one-factor experiments，four factors including calcium chloride and sodium alginate concentration，ratio of core to wall，temperature were optimized by the method of response surface.The performance of all factors was evaluated by the microencapsulation efficiency.The results showed，under the condition of calcium chloride concentration 2%，temperature 49℃，the proportion of sodium alginate to surfactin 1∶2，sodium alginate concentration 2.4%，the microencapsulation efficiency reaches 87.6%，the load ratio of drug reaches 12.5%.The release rate of Surfactin from the microcapsule reached 91.7%，which showed that it had good slow-release effect.

piercing-solidifying method；microcapsules；surfactin；response surface method

TS201.2

B

1002-0306（2015）12-0221-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.038

2014－09－24

張生生（1989-），男，在讀碩士研究生，主要從事食品科學(xué)和生物發(fā)酵方面的研究。

王昱灃（1976-），男，副教授，主要從事生物分離方面的研究。

中央高?；緲I(yè)務(wù)專項(xiàng)基金（KYZ201154）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目和江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科人才引進(jìn)項(xiàng)目（80900210521）。