張　卉，張　妍，張　璇，王　丹

（沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110142）

蘋果果膠酯酶提取及其酶學(xué)性質(zhì)探究

張卉，張妍，張璇，王丹

（沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110142）

以國(guó)光蘋果為原料，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)考察了NaCl濃度、pH、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)蘋果果膠酯酶酶活的影響，確定了蘋果果膠酯酶最佳提取工藝參數(shù)，并研究了蘋果果膠酯酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：在NaCl濃度為2.5mol/L、pH為8.5、提取溫度30℃和提取時(shí)間為27h時(shí)，蘋果果膠酯酶的酶活達(dá)到0.98μmol/min·mL；該酶反應(yīng)的最適溫度為40℃，熱穩(wěn)定性較差，最適pH為11；金屬離子中Ca2+對(duì)果膠酯酶有顯著的激活作用，Na+、K+和Fe2+也有一定的激活作用，而Ba2+、Mn2+和EDTA對(duì)果膠酯酶有抑制作用。

果膠酯酶，提取條件，酶學(xué)性質(zhì)，蘋果

果膠酯酶（pectinesterase，EC.3.1.1.11）是果膠酶的一種，廣泛存在于植物組織和微生物體內(nèi)。在蘋果深加工中，果膠酯酶可以催化蘋果果膠（高甲氧基果膠）脫去甲氧基，進(jìn)一步與蘋果中存在的二價(jià)離子如鈣離子結(jié)合，形成果膠酸鈣凝膠和甲醇，引起蘋果汁的渾濁和蘋果酒甲醇含量提高［1-5］，從而對(duì)蘋果深加工產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性產(chǎn)生嚴(yán)重影響。目前釀酒工業(yè)上解決果酒甲醇含量問(wèn)題主要采用發(fā)酵后蒸餾環(huán)節(jié)脫甲醇和發(fā)酵前加熱滅酶的方法，但是蒸餾環(huán)節(jié)脫甲醇一直不能達(dá)到良好的效果，加熱滅酶會(huì)損失風(fēng)味物質(zhì)，嚴(yán)重影響果酒的質(zhì)量；而從商品果膠酶中將果膠酯酶分離，除去因成本過(guò)高在生產(chǎn)上也是不可行的；因此，對(duì)蘋果酒生產(chǎn)中內(nèi)源果膠酯酶的性質(zhì)及其催化果膠分解生成甲醇的機(jī)理，以及果膠酯酶抑制劑對(duì)其活性調(diào)控的研究具有重要的理論意義，對(duì)我國(guó)蘋果深加工產(chǎn)業(yè)具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。此外，在茶飲料等食品加工和造紙等生產(chǎn)工藝中也廣泛利用果膠酯酶來(lái)改善產(chǎn)品品質(zhì)。但目前國(guó)內(nèi)外大部分研究集中于真菌和細(xì)菌來(lái)源的果膠酯酶，對(duì)蘋果等植物內(nèi)源果膠酯酶的研究報(bào)道甚少［6-8］。根據(jù)已有報(bào)道可知，大部分果膠酯酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以影響蛋白質(zhì)提取的因素，如鹽離子濃度、溫度、pH等，在果膠酯酶的提取中也是必要的考察因素［9-10］。

本文以國(guó)光蘋果為原料，探索了蘋果果膠酯酶提取的影響因素和蘋果果膠酯酶的酶學(xué)性質(zhì)，為蘋果果膠酯酶結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系研究，以及果酒生產(chǎn)中甲醇含量的控制和蘋果濁汁脫穩(wěn)等食品加工問(wèn)題奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蘋果為東北地區(qū)種植面積廣、產(chǎn)量大的國(guó)光蘋果，購(gòu)買自沈陽(yáng)市寧官市場(chǎng)，袋裝后置于冰箱中-20℃冷凍保存?zhèn)溆?；果膠Sigma；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BS124S型電子天平北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HR（87）型勻漿機(jī)飛利浦電子香港有限公司；ZDJ-4A型自動(dòng)電位滴定儀上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CT15RT型高速冷凍離心機(jī)上海馭諾實(shí)業(yè)有限公司；BCD-215KS型立式海爾電冰箱青島海爾股份有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋上海國(guó)華電器有限公司；79-1型磁力攪拌器常州國(guó)華電器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蘋果果膠酯酶的提取將蘋果在4℃解凍24h后，去皮、核，果肉與NaCl溶液按照料液比1∶1混合后勻漿，勻漿在不同濃度NaCl、pH、溫度和時(shí)間條件下處理后經(jīng)紗布過(guò)濾，然后在15000r/min，4℃條件下離心30min，取上清液即為粗酶液。

1.2.2果膠酯酶酶活的測(cè)定采用pH-stat法測(cè)量蘋果果膠酯酶酶活［11］。取18mL去離子水、2mL 0.1mol/L的NaCl溶液、10mL的1%（w/v）果膠溶液混合，在35℃恒溫條件下加入1mL粗酶液，用0.05mol/L NaOH溶液和HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至7.5，開(kāi)始計(jì)時(shí)。利用自動(dòng)滴定儀不斷加入0.01mol/L NaOH溶液，使反應(yīng)體系的pH始終保持在7.5。滴定開(kāi)始后，每2min記錄一次消耗NaOH溶液的總體積，以消耗的NaOH溶液的總體積-反應(yīng)時(shí)間作圖，由所得直線的初始斜率計(jì)算果膠酯酶的酶活。酶活用每分鐘生成酸的微摩爾數(shù)表示，即酶活單位為μmol/min·mL。

1.2.3蘋果果膠酯酶提取參數(shù)的優(yōu)化

1.2.3.1單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在提取溫度為30℃，溶液pH為8，提取時(shí)間為12h時(shí)，設(shè)定NaCl濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mol/L）；在NaCl濃度2.0mol/L，pH為8，提取時(shí)間為12h時(shí)，設(shè)定溫度（5、10、15、20、25、30、35℃）；在NaCl濃度2.0mol/L，提取溫度為30℃，提取時(shí)間為12h時(shí)，設(shè)定pH（5、6、7、8、9、10）；在NaCl濃度2.0mol/L，提取溫度為30℃，pH為8時(shí)，設(shè)定提取時(shí)間（0、6、12、18、24、30、36h）。研究各個(gè)因素對(duì)蘋果果膠酯酶提取的影響。所有的實(shí)驗(yàn)均做3次重復(fù)。

1.2.3.2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇NaCl濃度、pH、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素為研究對(duì)象，以蘋果果膠酯酶酶活為評(píng)判指標(biāo)，選用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案設(shè)計(jì)，正交實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1　L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 1　The factors and levels for the L9（34）orthogonal design

1.3蘋果果膠酯酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.1溫度對(duì)蘋果果膠酯酶的影響取1mL粗酶液分別在20、25、30、35、40、45、50、55℃條件下測(cè)定酶活，用果膠酯酶酶活對(duì)溫度作圖，酶活最大值對(duì)應(yīng)的溫度即為該酶的最適作用溫度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2pH對(duì)蘋果果膠酯酶的影響在最適作用溫度條件下，分別用不同pH（5.0～12.0）的緩沖液配制1%的果膠溶液，測(cè)定不同pH條件下果膠酯酶的酶活，用果膠酯酶酶活對(duì)pH作圖，酶活最大值對(duì)應(yīng)的pH即為該酶的最適作用pH。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3蘋果果膠酯酶的熱穩(wěn)定性將果膠酯酶酶液分別置于10、20、30、40、50、60℃條件下保溫1h后，用最適pH的緩沖溶液配制1%（w/v）的果膠溶液，在最適溫度和最適pH條件下測(cè)定其酶活。以最高酶活值為100%，其他條件下所得的酶活以此為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出相對(duì)酶活，用相對(duì)酶活對(duì)溫度作圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4蘋果果膠酯酶的酸堿穩(wěn)定性各取3mL果膠酯酶酶液分別加到9mL pH為5、6、7、8、9、10、11、12的緩沖溶液中，40℃放置1h，分別在最適溫度和最適pH條件下測(cè)定酶活，以最高酶活值為100%，其他條件下所得的酶活以此為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出相對(duì)酶活，用相對(duì)酶活對(duì)時(shí)間作圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5金屬離子對(duì)蘋果果膠酯酶的影響在酶液中分別添加NaCl、KCl、CaCl2、FeSO4、BaCl2、MnSO4和EDTA的水溶液，使各金屬離子和EDTA的終濃度為2mmol/L［12］，在室溫下靜置30min后，用最適pH的緩沖溶液配制1%的果膠溶液（w/v），在最適溫度條件下測(cè)定其酶活。以未加金屬離子的酶活值為100%，其他條件下所得的酶活以此為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出相對(duì)酶活，用相對(duì)酶活對(duì)金屬離子作圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1提取因素對(duì)蘋果果膠酯酶酶活的影響

2.1.1NaCl濃度對(duì)蘋果果膠酯酶酶活的影響在溶液pH為8，提取溫度為30℃、提取時(shí)間12h條件下，不同NaCl濃度對(duì)蘋果果膠酯酶酶活的影響結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，隨著NaCl濃度的增加，粗酶液中蘋果果膠酯酶的酶活基本呈直線關(guān)系上升，當(dāng)NaCl濃度為2mol/L時(shí)達(dá)到最高值，后隨著濃度增加開(kāi)始急劇下降?？赡苁且?yàn)榈蜐舛鹊腘a+有助于蛋白質(zhì)的溶解，使得溶液中的酶量增加，溶液的酶活增大，但是當(dāng)Na+濃度過(guò)高時(shí)，果膠酯酶開(kāi)始逐漸被鹽析出來(lái)，導(dǎo)致溶液中酶量變小，酶活降低。故提取蘋果果膠酯酶的NaCl濃度選為2mol/L。

圖1　NaCl濃度對(duì)蘋果果膠酯酶酶活的影響Fig.1　Effect of NaCl concentration on PE activity extracted from apple

2.1.2提取溫度對(duì)蘋果果膠酯酶酶活的影響在NaCl濃度為2mol/L，pH為8，提取時(shí)間為12h條件下，不同溫度對(duì)提取蘋果果膠酯酶酶活的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，在5～15℃時(shí)，果膠酯酶的酶活變化不大，15～30℃時(shí)，隨著溫度的增加，粗酶液中蘋果果膠酯酶的酶活呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，超過(guò)30℃以后隨著溫度增加開(kāi)始呈下降趨勢(shì)?？梢?jiàn)溫度對(duì)果膠酯酶的提取影響較大，原因可能與酶的最適作用溫度有關(guān)，低溫條件下，酶沒(méi)有完全被釋放到溶液中，導(dǎo)致溶液的酶活性較低。因此，最適提取溫度選用30℃。

圖2　提取溫度對(duì)蘋果果膠酯酶酶活的影響Fig.2　Effect of temperature on PE activity extracted from apple

2.1.3pH對(duì)蘋果中果膠酯酶酶活影響在NaCl濃度為2mol/L、溫度為30℃、提取時(shí)間12h條件下，不同pH對(duì)蘋果果膠酯酶提取酶活的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，pH≤7時(shí)，果膠酯酶的酶活隨著pH的升高緩慢增加，pH超過(guò)7以后果膠酯酶的酶活隨著pH的增大迅速變大，到pH為8時(shí)達(dá)到最大值，pH≥8時(shí)，又開(kāi)始逐漸下降。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，pH超過(guò)9，溶液中開(kāi)始有少量沉淀析出，根據(jù)Jean-Marc Denes等［15］從cv Golden Delicious apple中提取的果膠酯酶等電點(diǎn)是高于9的，所以pH超過(guò)9以后，可能逐漸接近其等電點(diǎn)，開(kāi)始有少量蛋白酶析出，導(dǎo)致酶活下降［10］。所以，提取果膠酯酶的最適pH為8。

圖3　pH對(duì)蘋果果膠酯酶酶活的影響Fig.3　Effect of pH value on PE activity extracted from apple

2.1.4提取時(shí)間對(duì)蘋果中果膠酯酶活力影響在NaCl濃度為2mol/L，pH為8，溫度30℃條件下，不同提取時(shí)間對(duì)蘋果果膠酯酶酶活力的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，在提取時(shí)間為0～24h時(shí)，蘋果果膠酯酶活性隨著提取時(shí)間的增加而增大，到達(dá)24h時(shí)基本已經(jīng)完全浸出，之后酶活性略有降低，考慮到提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作帶來(lái)不便和酶液變質(zhì)問(wèn)題［13］，因此，選擇提取時(shí)間為24h。

圖4　提取時(shí)間對(duì)蘋果果膠酯酶酶活的影響Fig.4　Effect of extraction time on PE activity extracted from apple

2.2蘋果果膠酯酶提取條件的優(yōu)化結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化蘋果果膠酯酶提取的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of orthogonal experiment

由表2的極差分析可以看出，影響果膠酯酶酶活大小的因素主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C，即提取溫度＞提取時(shí)間＞NaCl濃度＞pH。蘋果果膠酯酶提取的最優(yōu)組合為A3B2C3D3，即最佳的提取條件為NaCl濃度2.5mol/L，pH為8.5，提取溫度30℃，提取時(shí)間為27h。

方差分析結(jié)果（見(jiàn)表3）表明提取溫度對(duì)提取蘋果果膠酯酶酶活有顯著性影響。

表3　正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3　Variance analysis of orthogonal experiment

由于最佳組合不在正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表中，因此要進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證最佳工藝條件的可靠性。準(zhǔn)確稱取3份100g蘋果，分別按照最優(yōu)條件（A3B2C3D3）進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。測(cè)得的果膠酯酶酶活的平均值為0.98μmol/min·mL，表明該工藝條件比較穩(wěn)定，可以作為提取蘋果果膠酯酶的最佳工藝條件。

2.3蘋果果膠酯酶酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1蘋果果膠酯酶最適作用溫度由圖5可知，蘋果果膠酯酶酶活在20～40℃時(shí)隨溫度的增加而增加，40℃達(dá)到最大值，40～55℃呈下降趨勢(shì)。其中溫度為在30～45℃之間時(shí)酶活較高，達(dá)到65%以上，超過(guò)55℃以后酶活僅剩10%左右。因此，該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃。這與已有關(guān)于植物源果膠酯酶的報(bào)道相比偏低，例如張敬民研究的向日葵花盤中果膠酯酶的最適作用溫度為45℃［6］，而孫君梅等從番茄果膠酯酶最適作用溫度達(dá)到60℃［14］。

圖5　溫度對(duì)果膠酯酶酶活的影響Fig.5　Effect of temperature on PE activity

2.3.2蘋果果膠酯酶最適作用pH由6可知，蘋果果膠酯酶在酸性條件下酶活較低，pH在8～10時(shí)增長(zhǎng)緩慢，當(dāng)pH大于10時(shí)酶活開(kāi)始迅速上升，pH達(dá)到11時(shí)，酶活達(dá)到最高值，之后開(kāi)始迅速下降，當(dāng)pH到達(dá)12時(shí)酶活降低為0。因此，該酶為堿性酶，最適反應(yīng)pH為11。有關(guān)堿性果膠酯酶的報(bào)道較少，已有的報(bào)道如Jean-Marc Denes等［15］利用抑制劑從cv Golden Delicious apple中提取的果膠酯酶的最適作用pH為7.5；Ozler等［16］從Malatya apricot中得到的果膠酯酶最適pH為9；Karen King［17］從Bramley apple中得到的果膠酯酶的最適pH為10。而本實(shí)驗(yàn)從國(guó)光蘋果中得到的果膠酯酶最適pH為11，從相關(guān)的研究和報(bào)道來(lái)看，尚未發(fā)現(xiàn)有堿性與之吻合的果膠酯酶，其堿性較高的原因和應(yīng)用方向有待進(jìn)一步研究。

2.3.3蘋果果膠酯酶熱穩(wěn)定性由圖7可知，蘋果果膠酯酶的熱穩(wěn)定性較差，在低于20℃條件下保溫1h后較穩(wěn)定，相對(duì)酶活能保持80%以上，20℃以后相對(duì)酶活開(kāi)始降低，而在超過(guò)50℃時(shí)保溫1h以后果膠酯酶活性全部喪失。

圖6　pH對(duì)果膠酯酶酶活的影響Fig.6　Effect of pH value on PE activity

圖7　果膠酯酶的熱穩(wěn)定性Fig.7　Temperature stability of PE

2.3.4蘋果果膠酯酶的pH穩(wěn)定性蘋果果膠酯酶的酸堿穩(wěn)定性如圖8所示。由圖8可以看出，該酶在pH＜7時(shí)穩(wěn)定性較差，pH為8～11范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，處理1h以后相對(duì)酶活仍然保持在80%以上，而pH超過(guò)12以后相對(duì)酶活僅為12.1%。因此該酶的pH穩(wěn)定性在8～11的堿性范圍內(nèi)。

圖8　果膠酯酶的pH穩(wěn)定性Fig.8　pH stability of PE

2.3.5金屬離子對(duì)蘋果果膠酯酶酶活的影響金屬離子和EDTA對(duì)蘋果果膠酯酶的影響結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可以看出，Ca2+對(duì)果膠酯酶有明顯的激活作用；Na+、K+和Fe2+也有一定的激活作用，但效果不明顯；Ba2+、Mn2+和EDTA對(duì)果膠酯酶有抑制作用，其中EDTA有明顯的抑制作用，說(shuō)明該酶為金屬酶。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)體系中若含有較高濃度的Ca2+，則Ca2+在加熱的條件下會(huì)與其中游離的半乳糖醛酸結(jié)合生成不溶性沉淀，進(jìn)而影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行。因此選用對(duì)果膠酯酶激活作用相對(duì)較強(qiáng)的NaCl溶液作為提取劑。

3　結(jié)論

綜合考慮了NaCl濃度、pH、提取溫度和提取時(shí)間四個(gè)影響因素，得到蘋果果膠酯酶提取的最優(yōu)工藝條件：NaCl濃度2.5mol/L、pH為8.5、提取溫度30℃、提取時(shí)間27h。蘋果果膠酯酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，溫度穩(wěn)定性較差，超過(guò)50℃保溫1h后活性全部喪失；最適作用pH為11，pH穩(wěn)定范圍為8～11，在pH8～11條件下放置1h以后相對(duì)酶活仍然保持在80%以上，為強(qiáng)堿性酶；Ca2+對(duì)果膠酯酶有明顯的激活作用，Na+、K+和Fe2+也有一定的激活作用，Ba2+、Mn2+和EDTA對(duì)果膠酯酶有抑制作用，其中EDTA有明顯的抑制作用。

本研究初步探究了蘋果果膠酯酶酶學(xué)性質(zhì)，有望為蘋果果酒生產(chǎn)中甲醇含量的控制問(wèn)題提供理論基礎(chǔ)。但其具體的果膠酯酶催化反應(yīng)機(jī)理還需要進(jìn)一步對(duì)其分離純化之后進(jìn)行研究。

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Extraction and enzyme properties of pectinesterase from apple

ZHANG Hui，ZHANG Yan，ZHANG Xuan，WANG Dan
（College of Pharmaceutical&Biology Engineering，Shenyang University of Chemical Technology，Shenyang 110142，China）

The optimal extraction condition of pectinesterase from apple was studied.Through single factor and orthogonal experiment，NaCl solution concentration，pH，extraction temperature and time were investigated，and the enzyme properties from apple were also studied in this article.The results showed that：under the conditions of NaCl solution concentration 2.5mol/L，pH8.5，extraction temperature 30℃，extraction time 27h，pectinesterase activity could reach 0.98μmol/min·mL.The optimal temperature and pH of pectinesterase was 40℃ and 11，respectively.Its temperature stability was poor.Metal ions such as Na+，Ca2+，K+，F(xiàn)e2+could stimulate pectinesterase activity，especially Ca2+was more remarkable stimulation than others.Ba2+，Mn2+and EDTA were inhibitors of pectinesterase activity.

pectinesterase；extraction condition；enzyme property；apple

TS201.2+5

A

1002-0306（2015）12-0197-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.033

2014－10－31

張卉（1968-），女，博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)、生物活性物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的研究。

遼寧省科技廳科技基金（2013020060）。