楊龍方，桑衛(wèi)國(guó)，*，段清源

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211；2.寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江寧波315010）

響應(yīng)面法優(yōu)化鰹魚(yú)褐色肉酶解工藝的研究

楊龍方1，桑衛(wèi)國(guó)1，*，段清源2

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211；2.寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江寧波315010）

研究了堿性蛋白酶酶解鰹魚(yú)褐色肉的工藝條件。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以初始pH、酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間為考察因素，以鰹魚(yú)褐色肉酶解產(chǎn)物的還原能力為響應(yīng)值，對(duì)堿性蛋白酶酶解鰹魚(yú)背褐色肉的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，以堿性蛋白酶酶解鰹魚(yú)褐色肉，適宜的酶解條件為：初始pH9.9、酶添加量5183U/g、酶解溫度49℃、酶解時(shí)間4.75h。在該條件下酶解液的還原能力為1.4308/OD700nm，與模型預(yù)測(cè)值1.4393/OD700nm接近。利用響應(yīng)面分析法得到的鰹魚(yú)褐色肉酶解工藝參數(shù)真實(shí)可靠，為鰹魚(yú)褐色肉的開(kāi)發(fā)利用、變廢為寶提供了技術(shù)支持。

鰹魚(yú)，酶解，堿性蛋白酶，還原能力

魚(yú)肌肉由普通肉和褐色肉構(gòu)成，普通肉體積較大、分布較廣，褐色肉從魚(yú)體脊柱擴(kuò)展到側(cè)皮下位置，占肌肉體積的2%～30%（鯖魚(yú)、鰹魚(yú)、沙丁魚(yú)等洄游性魚(yú)類(lèi)為15%～30%，活躍度較低的魚(yú)類(lèi)為2%～12%），為魚(yú)類(lèi)的長(zhǎng)時(shí)間快速游動(dòng)提供支持［1-2］。由于肉色暗紅及易于氧化等原因，褐色肉（尤其是洄游性魚(yú)類(lèi)的褐色肉）在加工過(guò)程中常作為廢棄物被丟棄［3］，然而，其在營(yíng)養(yǎng)特性、抗氧化活性等方面的潛在應(yīng)用價(jià)值逐漸引起關(guān)注。與普通肉相比，褐色肉含有更多的色蛋白、肌漿蛋白、基質(zhì)蛋白及銅、鐵、硒等金屬元素［4］，并具有較高的抗氧化酶及谷胱甘肽過(guò)氧化酶活性［5］。Hsu等［6］的研究還表明，分離純化藍(lán)鰭金槍魚(yú)（Thunnus Thynnus）褐色肉酶解物后得到的分子量在390～1400u的肽片段具有較強(qiáng)的抗MCF-7人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)散活性。

鰹魚(yú)（Skipjack Tuna）是一種主要分布在熱帶及溫帶水域的暖水性上層洄游魚(yú)類(lèi)，生長(zhǎng)繁殖快、種群修復(fù)能力強(qiáng)［7］。2002年鰹魚(yú)的全球捕獲量約200萬(wàn)噸，2007年達(dá)到250萬(wàn)噸（Source：FAO 2010），在所有主要貿(mào)易鮪類(lèi)中產(chǎn)量最高。鰹魚(yú)通常被加工成罐頭、柴魚(yú)、魚(yú)柳或生魚(yú)片，加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生魚(yú)頭、魚(yú)皮、魚(yú)骨、內(nèi)臟等下腳料。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于鰹魚(yú)下腳料的研究主要集中在通過(guò)提取、分離、純化等工藝從上述下腳料中獲得魚(yú)油［8］、磷脂［9］、生物活性成分［10］等，而對(duì)于鰹魚(yú)褐色肉的再利用卻鮮有研究。還原力是檢驗(yàn)受試物是否具有抗氧化活性的重要指標(biāo)，本文以酶解液還原力為指標(biāo)，對(duì)鰹魚(yú)褐色肉酶解工藝進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，為進(jìn)一步制備抗氧化活性肽提供理論依據(jù)，以及為鰹魚(yú)褐色肉的變廢為寶提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鰹魚(yú)購(gòu)于寧波水產(chǎn)市場(chǎng)，于-20℃條件下存放直至使用；肌肽標(biāo)準(zhǔn)品純度99%，Sigma-Aldrich公司；蛋白酶20萬(wàn)U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

SL-N型電子天平上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；XHF-D型高速分散器寧波新芝生物科技有限公司；PHS-2F pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋國(guó)華電器有限公司；L-550型臺(tái)式低速離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；UV-3300型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海美普達(dá)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1鰹魚(yú)褐色肉的酶解鰹魚(yú)于室溫下解凍后將褐色肉取下并絞碎，取5.00g肉糜放入三角燒瓶中，1∶10（w/v）加入蒸餾水后勻漿，調(diào)節(jié)初始pH，加入蛋白酶混勻后于恒溫振蕩箱（轉(zhuǎn)速150r/min）中酶解。85℃水浴20min滅酶，酶解液冷卻至室溫后4℃、4500r/min離心20min，收集上清液測(cè)定還原能力。

1.2.2鰹魚(yú)褐色肉酶解產(chǎn)物的還原能力的測(cè)定研究表明，具還原能力的化合物在脂肪過(guò)氧化過(guò)程中可作為電子供體減少氧化反應(yīng)中間體的數(shù)量，從而發(fā)揮主要或輔助的抗氧化作用［11-12］。

采用鐵氰化鉀法測(cè)定鰹魚(yú)褐色肉酶解產(chǎn)物的還原能力［13］。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：準(zhǔn)確配制濃度分別為0、1、10、20、50、100mmol/L的肌肽溶液。分別取上述不同濃度肌肽溶液5mL，加入0.2mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）2.50mL及1%鐵氰化鉀2.50mL，混勻后于50℃水浴20min，再加入10%三氯乙酸2.50mL終止反應(yīng)。將溶液混合均勻，取2.50mL于試管中，加入蒸餾水2.50mL及0.1%三氯化鐵溶液0.50mL，混勻后靜置10min，測(cè)定其在700nm處吸光度值。按照上述方法測(cè)定鰹魚(yú)褐色肉酶解產(chǎn)物的還原能力，以蒸餾水代替樣品作為空白。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。

1.2.3不同蛋白酶對(duì)鰹魚(yú)褐色肉酶解產(chǎn)物還原能力的影響采用GB/T 23527-2009福林法測(cè)定出各蛋白酶實(shí)際酶活分別為：堿性蛋白酶15.62萬(wàn)U/g；復(fù)合蛋白酶16.56萬(wàn)U/g；中性蛋白酶18.51萬(wàn)U/g；木瓜蛋白酶16.26萬(wàn)U/g；風(fēng)味蛋白酶18.21萬(wàn)U/g。以酶解產(chǎn)物的還原能力為指標(biāo)，在酶解溫度50℃及初始pH9.0的條件下，固定料液比1∶10、酶添加量5000U/g及酶解時(shí)間5h，考察堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶解效果，篩選出適合酶解鰹魚(yú)褐色肉的蛋白酶。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)以還原能力為指標(biāo)，單因素實(shí)驗(yàn)的基本條件為初始pH9.0、酶解溫度50℃、酶添加量5000U/g、酶解時(shí)間4h，改變其中一個(gè)條件，固定其他條件以分別考察酶解時(shí)間（2、3、4、5、6h）、酶解溫度（30、40、50、60、70℃）、初始pH（7.0、8.0、9.0、10.0、 11.0）及酶添加量（3000、4000、5000、6000、7000U/g）等因素對(duì)鰹魚(yú)褐色肉酶解產(chǎn)物還原能力的影響。

1.2.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以初始pH（X1）、酶添加量（X2）、酶解溫度（X3）和酶解時(shí)間（X4）為因子，以酶解液還原能力為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，確定最優(yōu)酶解條件。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平編碼見(jiàn)表1，每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的編碼值及水平Table 1　The cods and levels of RSM

2　結(jié)果與討論

2.1還原能力標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖1　還原能力標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1　Standard curve of reducing power

以肌肽濃度為橫坐標(biāo)、吸光度（OD700nm）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。一般認(rèn)為，在700nm處的吸光度值越大表示物質(zhì)還原力越強(qiáng)，圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)也表明，吸光度值隨抗氧化物濃度的增大而增大，而溶液的總還原力與其中所含的抗氧化成分含量呈量效關(guān)系，因此可用700nm處的吸光度值（OD700nm）表示還原力。

2.2不同蛋白酶對(duì)鰹魚(yú)褐色肉酶解產(chǎn)物還原能力的影響

蛋白質(zhì)在酶解過(guò)程中產(chǎn)生的氨基酸、二肽、三肽、寡肽或多肽會(huì)增加極性基團(tuán)的數(shù)量及酶解液的溶解性，從而改變蛋白質(zhì)的乳化性、抗氧化性等功能特性，并提高其功能及生物利用率。鰹魚(yú)褐色肉不同蛋白酶酶解產(chǎn)物還原能力的比較如圖2所示。實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的五種酶屬于肽鏈內(nèi)切酶、肽鏈外切酶，或兼具內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶兩種活性，在水解過(guò)程中均能將底物蛋白質(zhì)降解成分子量較小的活性肽。由圖2可知，不同酶水解鰹魚(yú)褐色肉制得的酶解液都表現(xiàn)出一定的還原能力，且酶解液還原能力由高到低依次為：堿性蛋白酶＞復(fù)合蛋白酶＞中性蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶＞木瓜蛋白酶。在水解過(guò)程中，底物、蛋白酶種類(lèi)、水解條件及水解程度等都會(huì)影響酶解產(chǎn)物的理化功能［14］，其中，不同種類(lèi)的酶由于其自身特異性使其各自產(chǎn)生具有不同氨基酸序列、分子量及肽鏈長(zhǎng)度的自由氨基酸和低肽［15］，并對(duì)水解產(chǎn)物的抗氧化性［16］及疏水性［17］等生物活性產(chǎn)生不同程度的影響，從而造成不同酶解產(chǎn)物還原能力的差異。

圖2　酶種類(lèi)對(duì)水解液還原能力的影響Fig.2　Effect of enzyme types on reducing power of hydrolysate

堿性蛋白酶是一種由地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）產(chǎn)生的、具有廣泛底物特異性的絲氨酸型內(nèi)切蛋白酶［18］，現(xiàn)已成功用于青魚(yú)（Mylopharyngodon piceus）［19］、金槍魚(yú)［20］等魚(yú)蛋白的水解。堿性蛋白酶酶解物中含有可作為供電體的多肽，因而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性［21］。Chobert等［22］的研究還表明，海鰻（Muraenesox cinereus）肉堿性蛋白酶酶解液中的蛋氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和組氨酸都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性［23］，其中組氨酸和含肽組氨酸的抗氧化活性可能歸因于咪唑環(huán)的螯合作用，色氨酸殘基則是較強(qiáng)的氫供體［24］。由于堿性蛋白酶的酶解特異性使其酶解液具有較高的還原能力，因此選用堿性蛋白酶對(duì)鰹魚(yú)褐色肉進(jìn)行酶解。

2.3鰹魚(yú)褐色肉酶解的單因素實(shí)驗(yàn)

圖3　酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物還原能力的影響Fig.3　Effect of enzyme time on reducing power of hydrolysate

在初始pH、酶添加量、酶解溫度一定時(shí)，酶解時(shí)間對(duì)還原能力的影響如圖3。酶解初始階段，還原能力增加較快并在4h時(shí)達(dá)到最大，而后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)還原能力增加不明顯。反應(yīng)初始階段，由于底物敏感肽鍵的快速斷裂使非核心蛋白質(zhì)降解成大量多肽，還原能力迅速增加；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，核心蛋白的降解速率較慢、酶活性下降、產(chǎn)物與剩余底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)等原因造成可降解肽鍵濃度下降，導(dǎo)致還原能力增速減緩［25］，因此鰹魚(yú)褐色肉酶解的適宜時(shí)間為4h。

圖4　酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物還原能力的影響Fig.4　Effect of enzyme temperature on reducing power of hydrolysate

初始pH、酶添加量、酶解時(shí)間一定時(shí)，酶解溫度對(duì)酶解液還原能力的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)溫度從30℃升高到50℃時(shí)，還原能力逐漸增大，在50℃時(shí)還原能力最大，溫度繼續(xù)升高還原能力反而下降。這是由于酶的催化能力與溫度有密切關(guān)系：溫度較低時(shí)，酶活性得不到充分發(fā)揮，影響蛋白酶催化反應(yīng)速率；溫度過(guò)高時(shí)，維持酶分子構(gòu)象的次級(jí)鍵可能發(fā)生解體，使酶逐漸失活從而影響酶催化反應(yīng)的進(jìn)行。因此鰹魚(yú)褐色肉酶解的適宜溫度為50℃。

圖5　初始pH對(duì)酶解產(chǎn)物還原能力的影響Fig.5　Effect of initial pH on reducing power of hydrolysate

酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間一定時(shí)，初始pH對(duì)酶解還原能力的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著初始pH的上升，酶解液還原能力升高較快，在pH為10.0時(shí)酶解液還原能力達(dá)到最大。pH高于10.0后，還原能力有所下降。不同初始pH條件下還原能力有所不同，可能是由于在酸-中性條件下，酶的構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變導(dǎo)致酶的活性降低或完全喪失，從而影響酶解反應(yīng)的進(jìn)行［26］。

在初始pH、酶解溫度、酶解時(shí)間一定時(shí)，酶添加量對(duì)酶解液還原能力的影響見(jiàn)圖6。當(dāng)酶添加量較少時(shí)，由于酶添加量不足時(shí)底物難以完全水解，故還原能力較低，隨著酶添加量的增大還原能力逐漸升高，在酶添加量為5000U/g時(shí)還原能力達(dá)到最大，之后還原能力隨酶添加量的變化不明顯。因此，酶添加量應(yīng)選擇5000U/g。

圖6　酶添加量對(duì)酶解產(chǎn)物還原能力的影響Fig.6　Effect of enzyme dosage on reducing power of hydrolysate

2.4鰹魚(yú)褐色肉酶解條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1回歸模型的確定在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)初始pH、酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度四個(gè)因素采用響應(yīng)面分析軟件設(shè)計(jì)四因素三水平的中心組合設(shè)計(jì)，對(duì)堿性蛋白酶酶解鰹魚(yú)褐色肉的條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2　Project and results of RSA experiment

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合并建立響應(yīng)面回歸模型，得到回歸方程為：Y=1.41-0.028X1+0.077X2-0.05X3+ 0.048X4-0.054X1X2-0.081X1X3-0.050X1X4-0.021X2X3+ 0.048X2X4-0.028X3X4-0.15X12-0.014X22-0.016X32-0.16X42。對(duì)模型進(jìn)方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，模型的F值為28.12、“p＞F”＜0.0001表明模型極顯著；失擬項(xiàng)p=0.0612＞0.05表現(xiàn)為“不顯著”，回歸方程與實(shí)際值可較好擬合；R2=96.57%，表明模型的擬合較好；變異系數(shù)（CV）為3.34%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的精確度高、可靠性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)操作可信。因此，擬合二次模型是本研究中評(píng)估還原能力的最佳模型。

一次項(xiàng)中酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響最大，達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），初始pH達(dá)到顯著水平（p＜0.05）；四個(gè)二次項(xiàng)因子均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）；在交互項(xiàng)中，pH和酶解溫度的交互為極顯著，pH與酶添加量、pH與酶解時(shí)間、酶添加量與酶解時(shí)間的交互達(dá)到顯著水平（p＜0.05），酶添加量與酶解溫度、酶解溫度與酶解時(shí)間交互作用不顯著。模型表明，所有一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及部分交互項(xiàng)都對(duì)響應(yīng)有顯著貢獻(xiàn)。由此可知，各因子對(duì)鰹魚(yú)褐色肉酶解產(chǎn)物還原能力的影響并非簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。

表3 響應(yīng)面二次多項(xiàng)式模型的ANOVA分析結(jié)果Table 3　ANOVA for response surface quadratic polynomial models

2.4.2響應(yīng)面圖分析為更直觀(guān)的表現(xiàn)某兩個(gè)因素的交互作用，通過(guò)令其他因素固定在零水平，將回歸方程降維得到的二元二次方程繪制成相應(yīng)的響應(yīng)面圖如圖7～圖12所示。

圖7　Y=f（X1，X2）的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface plot of Y=f（X1，X2）

圖8　Y=f（X1，X3）的響應(yīng)面圖Fig.8　Response surface plot of Y=f（X1，X3）

圖9　Y=f（X1，X4）的響應(yīng)面圖Fig.9　Response surface plot of Y=f（X1，X4）

圖10　Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面圖Fig.10　Response surface plot of Y=f（X2，X3）

圖11　Y=f（X2，X4）的響應(yīng)面圖Fig.11　Response surface plot of Y=f（X2，X4）

圖12　Y=f（X3，X4）的響應(yīng)面圖Fig.12　Response surface plot of Y=f（X3，X4）

每對(duì)變量的組合效果表明，在鰹魚(yú)褐色肉蛋白的水解物中，隨著pH、酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間的增加，還原能力也隨之增加到一個(gè)特定水平，高于該水平后，還原能力值略微下降，可能是由于在較高pH、酶添加量、酶解溫度或酶解時(shí)間條件下堿性蛋白酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而降低了其生物活性［27］。6個(gè)響應(yīng)面圖均為開(kāi)口向下的凸形曲線(xiàn)，且在-1～1區(qū)間存在最高點(diǎn)，說(shuō)明在所涉及的因素水平范圍內(nèi)響應(yīng)值存在極大值［28］，并且該極值位于響應(yīng)面的最高點(diǎn)，也即等高線(xiàn)中最小橢圓的中心點(diǎn)。除圖10、圖12外，其他等高線(xiàn)均為橢圓形，且橢圓的軸線(xiàn)與坐標(biāo)軸之間有一定的角度，表明pH與酶添加量、pH與酶解溫度、pH與酶解時(shí)間以及酶添加量與酶解時(shí)間的交互作用顯著，而酶添加量與酶解溫度、酶解溫度與酶解時(shí)間交互圖像更接近圓形、交互作用不顯著，該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

2.4.3響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證確定單因素、交互影響及二次多項(xiàng)回歸模型方程后，對(duì)方程進(jìn)行逐步回歸，得到酶解的最優(yōu)條件為：pH9.92、酶添加量5182.77U/g、酶解溫度49.21℃、酶解時(shí)間4.74h，預(yù)測(cè)的還原能力為1.4393/OD700nm。See［29］、Taheri［30］、Benjakul等［31］的研究分別表明，堿性蛋白酶酶解鱈魚(yú)（Gadus）、沙丁魚(yú)（Sardina melamosticta）、大西洋鱈魚(yú)（Gadus morhua）的最佳條件分別為55.3℃、pH8.39，45.62℃、pH8.5，60℃、pH9.5。由于酶添加量及底物蛋白質(zhì)類(lèi)型均會(huì)對(duì)酶解液的組成、肽鏈長(zhǎng)度及生物活性產(chǎn)生影響，因而可能造成同種蛋白酶最適酶解條件的差異［32］。為進(jìn)一步驗(yàn)證模型的有效性和準(zhǔn)確性，考慮到實(shí)際操作的可行性，將最優(yōu)酶解條件修正為pH9.9、酶添加量5183U/g、酶解溫度49℃、酶解時(shí)間4.75h，在該條件下進(jìn)行酶解，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為1.4322、1.4277和1.4326，平均值為1.4308/OD700nm，與預(yù)測(cè)結(jié)果誤差較小。由此可見(jiàn)該模型能較好地用于鰹魚(yú)褐色肉酶解條件的優(yōu)化。

3　結(jié)論

最佳酶解條件為：pH9.9、酶添加量5183U/g、酶解溫度49℃、酶解時(shí)間4.75h，酶解液的實(shí)際還原能力為1.4308/OD700nm，與模型預(yù)測(cè)值1.4393/OD700nm接近。利用響應(yīng)面分析法得到的鰹魚(yú)褐色肉酶解工藝參數(shù)真實(shí)可靠，為鰹魚(yú)褐色肉的開(kāi)發(fā)利用、變廢為寶提供了技術(shù)支持。

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Study on optimization of enzymatic hydrolysis conditions of dark flesh of Skipjack Tuna by response surface methodology

YANG Long-fang1，SANG Wei-guo1，*，DUAN Qing-yuan2
（1.School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Marine and Fisheries Research Institute，Ningbo 315010，China）

Enzymatic hydrolysis conditions of Skipjack tuna dark flesh by Alcalase were investigated in this paper. Taking initial pH，enzyme dosage，hydrolysis temperature，hydrolysis time as factors and reducing power of hydrolysate as response，the enzymatic hydrolysis conditions of dark flesh were optimized based on single factor experiments.It turned out that the optimum hydrolytic conditions were Alcalase with a pH9.9，dosage of 5183U/g，temperature 49℃ and hydrolysis for 4.75h，and result in a reducing power of 1.4308/OD700nmwhich was close to the predicted value 1.4393/OD700nm.The parameters of skipjack dark flesh hydrolysate process by response surface methodology were more reliable，providing technique support for development and utilization of Skipjack dark flesh.

Skipjack tuna；enzymatic hydrolysis；alcalase；reducing power

TS254.1

A

1002-0306（2015）12-0175-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.028

2014－09－09

楊龍方（1987-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物活性提取與應(yīng)用。

桑衛(wèi)國(guó)（1955-），男，碩士，副教授，研究方向：水產(chǎn)品加工與綜合利用。

寧波市農(nóng)村科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)資金項(xiàng)目（2014C91020）；寧波大學(xué)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（E01069138000）。