劉　昕，帥玉英，張　濤，江　波，*，繆　銘，沐萬孟

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.南通勵成生物工程有限公司，江蘇南通226010）

糞腸球菌SK32.001精氨酸脫亞胺酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

劉昕1，帥玉英2，張濤1，江波1，*，繆銘1，沐萬孟1

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.南通勵成生物工程有限公司，江蘇南通226010）

對Enterococcus faecalis SK32.001所產(chǎn)的精氨酸脫亞胺酶（ADI）進(jìn)行分離純化并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過細(xì)胞破碎，硫酸銨沉淀，HiPrep Q FF 16/10陰離子交換層析，Sephadex G-75等純化方法獲得電泳純精氨酸脫亞胺酶，分子量約為42ku，催化最適溫度和pH分別為50℃和6.5，在30～40℃和pH5.5～7.5時較穩(wěn)定。不同濃度的Zn2+對酶活性影響較大。1mmol/L的Zn2+和10mmol/L的Co2+、Ca2+、Mg2+對酶活有較大的促進(jìn)作用，10mmol/L的Cu2+對酶的抑制作用最強(qiáng)。精氨酸脫亞胺酶在最適反應(yīng)條件測定其米氏常數(shù)為1.33mmol/L，最大反應(yīng)速度為2.41μmol/min。

糞腸球菌SK32.001，精氨酸脫亞胺酶（ADI），純化，酶學(xué)性質(zhì)

瓜氨酸的名字來源于拉丁語Citrullus vulgaris，意為西瓜，因?yàn)槲鞴现泻写罅吭摪被幔?］。近年來國內(nèi)外的眾多研究表明，瓜氨酸具有很多重要的生理功能［2-3］，如提高免疫系統(tǒng)功能，含豐富的抗氧化劑吸收有害的自由基，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。因此，瓜氨酸正越來越廣泛地被用于化妝品、保健食品、食品添加劑以及營養(yǎng)強(qiáng)化劑中。目前，L-瓜氨酸的生產(chǎn)方法有化學(xué)法、發(fā)酵法和酶法。酶法生產(chǎn)是指在精氨酸脫亞胺酶的作用下，L-精氨酸被轉(zhuǎn)化為L-瓜氨酸［4-6］。酶法合成瓜氨酸生產(chǎn)條件溫和，產(chǎn)物濃度高，純化步驟少，產(chǎn)品中無D-型旋光對映體［7］。精氨酸脫亞胺酶（Arginine Deiminase，EC3.5.3.6，簡稱ADI）可將精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸和氨，是一種僅發(fā)現(xiàn)于微生物中的精氨酸降解酶［8］。ADI最早是由HORN F等于1933年發(fā)現(xiàn)于綠膿桿菌細(xì)胞中［9］。作為一種精氨酸降解酶，ADI經(jīng)證實(shí)能有效抑制精氨酸缺陷型腫瘤，如黑素瘤和肝細(xì)胞癌的增殖［10-11］，是一種新型的腫瘤細(xì)胞體內(nèi)體外增殖抑制劑［12］。且在抑制人白血病癌細(xì)胞中，ADI比門冬氨酸更具潛力［13］。因此，在國內(nèi)開展精氨酸脫亞胺酶的分離純化方法研究，對藥物開發(fā)具有重要意義［14］。本實(shí)驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)室篩選保藏菌株糞腸球菌SK32.001進(jìn)行分離純化，提取精氨酸脫亞胺酶并初步研究其酶學(xué)性質(zhì)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株SK32.001 Enterococcus faecalis本實(shí)驗(yàn)室從西瓜大棚的土壤中分離所得；種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖10，L-精氨酸5，酵母粉5，魚粉蛋白胨5，NH4Cl 1.5，K2HPO41.0，NaCl 0.1，pH6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖10，L-精氨酸10，酵母粉5，魚粉蛋白胨5，K2HPO41.0，NaCl 0.1，pH6.0；L-精氨酸（L-Arg，純度99%） 浙江寧波科瑞生物工程有限公司；牛血清蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三羥甲基氨基甲烷、硫酸銨、二乙酰一肟、硫代氨基脲、考馬斯亮蘭、濃硫酸、鹽酸、磷酸等國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Centrifuge5804R高速冷凍離心機(jī)德國Eppendorf公司；Alpha-1系紫外可見分光光度計(jì)上海譜元儀器有限公司；pH計(jì)梅特勒-托利多儀器有限公司；細(xì)胞破碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)Pharmacia公司；電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司；SDS-PAGE電泳儀Bio-Rad公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1精氨酸脫亞胺酶的分離純化

1.2.1.1粗酶液的制備發(fā)酵液4℃，10000r/min離心15min，收集菌體后用0.9%的生理鹽水洗滌。將濕菌體重懸于50mmol/L，pH6.0的磷酸鈉緩沖液中，超聲破碎20min（功率22W，破碎1s間歇2s）。經(jīng)4℃，10000r/min離心15min后收集上清液即為粗酶液。

1.2.1.2硫酸銨沉淀將研細(xì)的硫酸銨緩慢加入粗酶液中，先加入飽和度50%的硫酸銨，混勻后4℃靜置4h，10000r/min離心20min，收集上清液。繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為80%，離心后收集沉淀，用50mmol/L，pH6.0的磷酸鈉緩沖液溶解。透析過夜除去硫酸銨。

1.2.1.3HiPrep Q FF 16/10陰離子交換柱層析HiPrep Q FF 16/10陰離子交換柱用緩沖液（50mmol/L，pH6.2的Tris-HCl緩沖液）預(yù)平衡后，上樣2mL，用含有0～1mol/L氯化鈉的緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集流速1.4mL/min。

1.2.1.4Sephadex G-75凝膠柱層析收集離子交換層析后具有酶活力的蛋白，透析降低鹽離子濃度并用聚乙二醇20000進(jìn)行濃縮。將約50mL的酶液濃縮至2mL左右，用于凝膠柱上樣。流動相為含0.2mol/L NaCl的緩沖液（50mmol/L，pH6.2的Tris-HCl緩沖液），收集流速0.5mL/min。

1.2.2精氨酸脫亞胺酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.2.1精氨酸脫亞胺酶反應(yīng)條件100g/L，pH6.0精氨酸溶液0.2mL，酶液0.1mL，50mmol/L，pH6.0磷酸鈉緩沖液0.7mL構(gòu)成1mL酶反應(yīng)體系，于50℃水浴中反應(yīng)1h。煮沸10min滅酶后離心，用高效液相（HPLC）測定上清液中瓜氨酸的含量。HPLC條件：Angilent1200；色譜柱：Hypersil ODS（5μm，4.0mm×250mm）；流動相A：水2L，三水合乙酸鈉15g，三乙胺0.44mL，四氫呋喃10mL，pH7.15～7.2；流動相B：2L，三水合乙酸鈉15g，水/甲醇/乙腈（1∶2∶2 V/V），pH7.12～7.15；流動相A與流動相B梯度洗脫，流速：1.0mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：338nm，發(fā)射波長：360nm。酶活定義：1min時間內(nèi)產(chǎn)生1μmol L-瓜氨酸所需的酶量為一個酶單位（1U）。比酶活定義：1mg的蛋白質(zhì)所含活力單位數(shù)（U/mg）。

1.2.2.2溫度對精氨酸脫亞胺酶活力及穩(wěn)定性的影響將酶反應(yīng)體系分別置于不同溫度30、35、40、45、50、55、60℃中，恒溫水浴1h后立即煮沸10min終止酶反應(yīng)，測酶活力。熱穩(wěn)定性研究：將酶液置于不同溫度30、35、40、45、50、55、60℃中保溫，分別放置10、30、60、120、180、240min后參與酶反應(yīng)，50℃下測其殘余酶活力。

1.2.2.3pH對酶活力及穩(wěn)定性的影響將處于不同pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的酶反應(yīng)體系置于50℃恒溫水浴1h后立即煮沸10min終止酶反應(yīng)，測酶活力。pH穩(wěn)定性研究：取冷凍干燥后的酶粉溶于不同pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸鈉緩沖液中，將不同pH條件下的酶液保存12h后調(diào)至pH6.0，酶反應(yīng)體系置于50℃恒溫水浴1h后立即煮沸10min終止酶反應(yīng)，測酶活力。

1.2.2.4金屬離子對酶活力的影響在酶液中加入不同金屬離子（終濃度分別為0.1、1.0、10、100mmol/L）：Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Co2+、Ca2+。保溫2h后，酶反應(yīng)體系置于50℃恒溫水浴1h后立即煮沸10min終止酶反應(yīng)，測酶活力?？瞻讓φ战M為未添加金屬離子的酶活力。

1.2.2.5精氨酸脫亞胺酶的米氏常數(shù)測定分別配制1、1.25、2、2.5、5、10、20、25、50、100mmol/L的L-精氨酸溶液2mL，加入ADI酶溶液0.1mL，于pH6.5，50℃下測定酶活力。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及圖表制作均使用Excel軟件。

圖1　ADI電泳譜圖Fig.1　Electrophoresis map of the ADI

2　結(jié)果與討論

2.1精氨酸脫亞胺酶的純化結(jié)果及SDS-PAGE電泳鑒定

細(xì)胞破碎后粗酶液經(jīng)過硫酸銨沉淀、HiPrep Q FF 16/10陰離子交換柱層析以及SephadexG-75凝膠柱層析后，將每一步純化后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示?？芍?jīng)凝膠柱層析后的酶液呈現(xiàn)一條蛋白條帶，達(dá)到電泳純，其分子量約為42ku。對精氨酸脫亞胺酶的純化結(jié)果如表1所示，最后得到的電泳純酶液純化倍數(shù)為20.1，回收率僅為1.6%?；厥章瘦^低，說明蛋白損失嚴(yán)重，雜蛋白較多，這步損失較多，可能是純化時溫度控制不當(dāng)造成的。

2.2精氨酸脫亞胺酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1溫度對酶活力及熱穩(wěn)定性的影響溫度通常對酶促反應(yīng)有較大影響。一定范圍內(nèi)的溫度升高有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，但是精氨酸脫亞胺酶作為一種蛋白質(zhì)，溫度過高則會使酶失活。由圖2可知，精氨酸脫亞胺酶的最適反應(yīng)溫度為50℃。這是由于50℃之前酶活力隨著溫度上升而提高，溫度大于50℃以后，酶蛋白的熱變性使酶部分失活，60℃時的酶活力迅速下降到最適溫度時的一半。

表1　糞腸球菌SK32.001精氨酸脫亞胺酶純化基本情況Table 1　Purification of ADI from SK32.001 Enterococcus faecalis

圖2　溫度對糞腸球菌SK32.001精氨酸脫亞胺酶活力的影響Fig.2　Effect of temperature on the enzyme activity of ADI from SK32.001 Enterococcus faecalis

另外研究了不同溫度30、35、40、45、50、55、60℃下精氨酸脫亞胺酶的熱穩(wěn)定性。由圖3可知，精氨酸脫亞胺酶在30、35及40℃條件下穩(wěn)定性較高，保溫4h后仍有大于60%的殘余酶活；而在45℃以上保存30min酶活便會迅速下降，將其置于最適酶反應(yīng)溫度50℃恒溫3h后，殘余酶活僅為25%，60℃下保溫3h后殘余酶活僅剩10%，可見酶的耐熱性較差。

2.2.2pH對酶活力及穩(wěn)定性的影響酶在不同pH體系中，其構(gòu)象、穩(wěn)定性以及與底物分子的解離狀態(tài)會發(fā)生改變，從而會影響酶的催化活性。因此需要測定在最適溫度下，不同pH對精氨酸脫亞胺酶的酶催化活力的影響。由圖4可知，精氨酸脫亞胺酶的最適pH為6.5，在pH為6～6.5之間時，酶促反應(yīng)速率較大，而pH大于6.5時酶活力明顯降低，酶在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下活力較低。

圖3　溫度對糞腸球菌SK32.001精氨酸脫亞胺酶活力的影響Fig.3　Effect of temperature on the enzyme activity of ADI from SK32.001 Enterococcus faecalis

圖4　pH對糞腸球菌SK32.001精氨酸脫亞胺酶活力的影響Fig.4　Effect of pH on the enzyme activity of ADI from SK32.001 Enterococcus faecalis

另外研究了不同pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0時精氨酸脫亞胺酶的穩(wěn)定性。由圖5可知，精氨酸脫亞胺酶在pH5.5～7.5之間相對穩(wěn)定，殘余酶活均可保持90%以上。超過7.5時酶活力受pH影響下降較明顯，但殘余酶活也有原來的80%，說明整體穩(wěn)定性較好。

圖5　pH對糞腸球菌SK32.001精氨酸脫亞胺酶穩(wěn)定性的影響Fig.5　Effect of pH stability on the enzyme activity of ADI from SK32.001 Enterococcus faecalis

2.2.3金屬離子對酶活力的影響金屬離子可以通過改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來影響酶的催化活性。在最適pH和溫度下，考察幾種常見二價金屬離子對酶活力的影響，金屬離子終濃度依次為0.1、1.0、10、100mmol/L。圖6為金屬離子終濃度為0.1mmol/L時精氨酸脫亞胺酶的相對酶活，并對加入金屬離子后精氨酸脫亞胺酶的相對酶活分別與空白組進(jìn)行差異顯著性分析。由圖6可知，0.1mmol/L的Cu2+對酶活有較明顯的抑制作用（p＜0.001），0.1mmol/L的Zn2+對酶活的促進(jìn)作用最強(qiáng)。而加入0.1mmol/L Mg2+時酶活力與空白比較無顯著性差異（p＞0.05）。

圖6　0.1mmol/L金屬離子對糞腸球菌SK32.001精氨酸脫亞胺酶活力的影響Fig.6　Effect of metal ions of 0.1mmol/L on the activity of ADI from SK32.001 Enterococcus faecalis

圖7為金屬離子終濃度為1.0mmol/L時精氨酸脫亞胺酶的相對酶活。Zn2+、Mn2+、Co2+、Ca2+對酶活有較顯著促進(jìn)作用（p＜0.001），但Cu2+會抑制酶的活性。溶液中加入1.0mmol/L Zn2+會對酶活產(chǎn)生強(qiáng)烈的促進(jìn)作用，而加入1.0mmol/L Mg2+時酶活力沒有明顯變化（p＞0.05）。

圖7　1.0mmol/L金屬離子對糞腸球菌SK32.001精氨酸脫亞胺酶活力的影響Fig.7　Effect of metal ions of 1.0mmol/L on the activity of ADI from SK32.001 Enterococcus faecalis

此外，10mmol/L金屬離子的作用效果如圖8所示。10mmol/L Co2+對酶活有最強(qiáng)的促進(jìn)作用，使酶活提高了70%。10mmol/L Mn2+、Ca2+、Mg2+也較顯著的提高了酶活（p＜0.001）。而10mmol/L Cu2+和Zn2+對酶活有明顯抑制作用（p＜0.001），其中Cu2+的抑制作用最明顯，加入10mmol/L Cu2+后的酶活僅為空白對照的60%。

圖8　10mmol/L金屬離子對糞腸球菌SK32.001精氨酸脫亞胺酶活力的影響Fig.8　Effect of metal ions of 10mmol/L on the activity of ADI from SK32.001 Enterococcus faecalis

圖9為金屬離子終濃度為100mmol/L時精氨酸脫亞胺酶的相對酶活。100mmol/L Mg2+對酶活有最強(qiáng)的促進(jìn)作用，使酶活提高到了160%。而Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+和Ca2+對酶活有顯著抑制作用（p＜0.001），其中加入100mmol/L Cu2+后的酶活僅為空白對照的40%。

圖9　100mmol/L金屬離子對糞腸球菌SK32.001精氨酸脫亞胺酶活力的影響Fig.9　Effect of metal ions of 100mmol/L on the activity of ADI from SK32.001 Enterococcus faecalis

圖10　糞腸球菌SK32.001精氨酸脫亞胺酶的酶促反應(yīng)動力學(xué)Fig.10　Kinetic parameters of ADI from SK32.001 Enterococcus faecalis

2.2.4精氨酸脫亞胺酶的米氏常數(shù)測定以精氨酸為底物，分別在不同底物濃度下測定酶活性。以底物濃度和產(chǎn)物瓜氨酸生成量作圖，以1/［S］為橫坐標(biāo)，1/［V］為縱坐標(biāo)，得到精氨酸脫亞胺酶的雙倒數(shù)曲線如圖10所示，經(jīng)米氏方程計(jì)算，得到酶的表觀米氏常數(shù)Km= 1.33mmol/L，Vm=2.41μmol/min。

3　結(jié)論

對實(shí)驗(yàn)室篩選保藏菌株糞腸球菌SK32.001進(jìn)行分離純化，提取精氨酸脫亞胺酶并初步研究其酶學(xué)性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過細(xì)胞破碎，硫酸銨沉淀，HiPrep Q FF 16/10陰離子交換層析，Sephadex G-75等純化方法獲得電泳純ADI，分子量約為42ku，催化最適溫度和pH分別為50℃和6.5，在30～40℃和pH5.5～7.5時較穩(wěn)定。不同濃度的Zn2+對酶活性影響較大。1mmol/L的Zn2+和10mmol/L的Co2+、Ca2+、Mg2+對酶活有較大的促進(jìn)作用，10mmol/L的Cu2+對酶的抑制作用最強(qiáng)。精氨酸脫亞胺酶在最適反應(yīng)條件測定其米氏常數(shù)為1.33mmol/L，最大反應(yīng)速度為2.41μmol/min。

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Purification and characterization of an arginine deiminase from Enterococcus faecalis SK32.001 producing citrulline

LIU Xin1，SHUAI Yu-ying2，ZHANG Tao1，JIANG Bo1，*，MIAO Ming1，MU Wan-meng1
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Nantong Richen Bioengineering Co.，Ltd.，Nantong 226010，China）

The crude enzyme of the arginine deiminase（ADI）from Enterococcus faecalis SK32.001 had been purified and the basic properties of ADI were investigated.The result of SDS-PAGE showed that ADI was purified to homogeneity level by fraction precipitated with ammonium sulfate，HiPrep Q FF 16/10 and Sephadex G-75 gel filtration chromatography.The molecular mass of the purified ADI was estimated to be about 42ku.The optimum temperature and pH of the purified ADI were 50℃ and 6.5，respectively.ADI activity kept stability under the temperature of 30～40℃and at pH range of 5.5～7.5.Among the metal irons，different concentrations of Zn2+could obviously affect the activity.1mmoI/L Zn2+，10mmoI/L Co2+，10mmoI/L Ca2+and 10mmoI/L Mg2+were the effective promoter while 10mmoI/L Cu2+had poor improvement in the activity.The Michaelis constant was 1.33mmoI/L and the maximum velocity was 2.41μmol/min．

Enterococcus faecalis SK32.001；arginine deiminase（ADI）；purification；enzymatic properties

TS201.1

A

1002-0306（2015）12-0165-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.026

2014－09－12

劉昕（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品加工新技術(shù)。

江波（1962-），男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)。