董倩倩，張彥青，李惠萍，李　　紅，房慧婧，杜金華

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018；2.廣州珠江啤酒股份有限公司，廣東廣州510308；3.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027）

工業(yè)化釀造過(guò)程中酵母分泌蛋白酶A的規(guī)律及影響因素的研究

董倩倩1，2，張彥青2，3，李惠萍2，李紅1，3，房慧婧2，杜金華1，*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018；2.廣州珠江啤酒股份有限公司，廣東廣州510308；3.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027）

對(duì)啤酒工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵過(guò)程中酵母分泌蛋白酶A的規(guī)律進(jìn)行了探討，對(duì)酵母代數(shù)及酵母貯存條件等因素對(duì)酵母分泌蛋白酶A的影響進(jìn)行了研究，并對(duì)蛋白酶A活性不同的成品純生啤酒的泡持值、泡沫活性蛋白含量及蛋白酶A活性進(jìn)行了跟蹤分析。結(jié)果表明：發(fā)酵過(guò)程中，蛋白酶A的活性呈上升趨勢(shì)且接種酵母的蛋白酶A活性越高，與其對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液中蛋白酶A的活性越高，成品酒的泡沫穩(wěn)定性越差。另外，隨著酵母代數(shù)及貯存時(shí)間的增加，酵母分泌蛋白酶A的量增加。當(dāng)酵母蛋白酶A活性控制在0.015U/mL以下且成品酒的初始蛋白酶A活性在15×10-5U/mL以下時(shí)，儲(chǔ)存4個(gè)月的成品純生啤酒的泡沫穩(wěn)定性較好。

啤酒，蛋白酶A，泡沫，酵母，釀造

啤酒是一種以麥芽、水為主要原料，加啤酒花（包括酒花制品），經(jīng)酵母發(fā)酵釀制而成的、含有二氧化碳的、起泡的、低酒精度的發(fā)酵酒。純生啤酒則是應(yīng)用微孔膜過(guò)濾及無(wú)菌罐裝技術(shù)得到的新鮮、爽口、口感純正的啤酒。自推出后，以其獨(dú)有的新鮮口感贏得了各國(guó)消費(fèi)者的青睞。隨著純生啤酒產(chǎn)量的迅速增長(zhǎng)，我國(guó)純生啤酒的質(zhì)量在不斷地提高，但作為評(píng)判純生啤酒品質(zhì)之一的泡沫穩(wěn)定性卻一直困擾著啤酒釀造者們，即隨著貨架期的延長(zhǎng)，純生啤酒的泡沫穩(wěn)定性逐漸降低。

國(guó)內(nèi)外研究表明［1-6］，純生啤酒中含有大量有助于泡沫穩(wěn)定性的組分：泡沫活性蛋白或多肽、二氧化碳、非淀粉多糖、金屬離子、異-α-酸等。其中，泡沫活性蛋白和多肽對(duì)泡沫穩(wěn)定性具有重要作用，主要包括蛋白質(zhì)Z和脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LTP1［7］。而酵母在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶A則是作用于蛋白質(zhì)Z和脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（LTP1）的主要蛋白酶類［8］。它在發(fā)酵階段和酒體成熟階段被釋放到酒液中，消化有助于啤酒泡沫穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)，改變蛋白質(zhì)Z和脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LTP1的疏水性能［9-10］。另外，由于純生啤酒未經(jīng)巴氏殺菌，殘留在成品純生啤酒中的蛋白酶A會(huì)繼續(xù)破壞這些蛋白質(zhì)和多肽［11］，使處于貯存或貨架期的純生啤酒的泡沫穩(wěn)定性降低，影響純生啤酒的品質(zhì)。因此，控制好釀造過(guò)程中酵母蛋白酶A的分泌對(duì)提高純生啤酒的品質(zhì)至關(guān)重要。

在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中，影響酵母分泌蛋白酶A的因素主要有酵母活力、酵母接種量、氮源、輔料及原麥汁濃度等。其中輔料的增加［12］、原麥汁濃度的增加［13］、氮源缺乏［14-15］以及過(guò)高酵母接種量［16］均會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中蛋白酶A活性的增加。研究表明：在這些因素中，酵母菌株的活力對(duì)蛋白酶A活性的影響更大一些［17］。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)酵母及純生啤酒生產(chǎn)過(guò)程中的蛋白酶A活性及發(fā)酵過(guò)程和成品純生的泡持值、泡沫活性蛋白含量及蛋白酶A活性進(jìn)行了跟蹤分析。旨在明確酵母分泌蛋白酶A的規(guī)律及影響其分泌的主要因素，為工業(yè)化啤酒生產(chǎn)過(guò)程中的酵母菌種管理及發(fā)酵過(guò)程控制提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

P酵母（啤酒酵母）由國(guó)內(nèi)某大型啤酒集團(tuán)公司提供；考馬斯亮藍(lán)G-250國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白（含氮量≥13.5%） 上海伯奧生物科技有限公司；無(wú)水乙醇安徽安特食品股份有限公司；磷酸廣州市東紅化工廠；Na2HPO4·12H2O、檸檬酸廣州化學(xué)試劑廠；二甲基亞砜（DMSO） FARCO化學(xué)試劑公司；蛋白酶KSigma公司；熒光底物MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys（Dnp）-NH2日本多肽研究所。

Nibem-T Haffman泡沫測(cè)定儀荷蘭Haffmans公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱廣東省醫(yī)療器械廠；V3140型紫外分光光度計(jì)澳大利亞GBC公司；RF-5301PC熒光分光光度計(jì)日本東京島津公司；HHW21-420 XMTB數(shù)顯調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋余姚市東方電工儀器廠；HI8417pH計(jì)Hanna公司；MEDIFRIGERBL型冷凍離心機(jī)西班牙J P SELECTA公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理冷麥汁用單層濾紙過(guò)濾后備用；酵母泥及發(fā)酵液樣品離心（5℃，5000r/min，20min）取上清液備用；成品純生啤酒樣品振蕩（240r/min，30min）除氣備用。

1.2.2蛋白酶A活性檢測(cè)見(jiàn)參考文獻(xiàn)［18-20］。

1.2.3泡沫活性蛋白的檢測(cè)見(jiàn)參考文獻(xiàn)［20-21］。

1.2.4泡持性的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 4928-2008中的儀器法測(cè)定啤酒泡持性。每次各取兩瓶測(cè)定，取其平均值。

1.2.5酵母泥檢測(cè)對(duì)純生啤酒釀造時(shí)常用的1～3代P酵母分泌蛋白酶A的情況進(jìn)行跟蹤分析。實(shí)驗(yàn)取1～3代酵母各5株，并對(duì)各代酵母編號(hào)為1#～5#（即1代酵母1#～5#，2代酵母1#～5#，3代酵母1#～5#），檢測(cè)它們的蛋白酶A活性，探索酵母分泌蛋白酶A的規(guī)律。

1.2.6發(fā)酵過(guò)程及成品純生啤酒分析本實(shí)驗(yàn)跟蹤檢測(cè)了28個(gè)發(fā)酵罐（500t，13°P發(fā)酵液）所用酵母泥及發(fā)酵液的蛋白酶A活性和泡沫活性蛋白含量，并對(duì)其所得成品純生啤酒（10°P）4個(gè)月內(nèi)的泡持值、泡沫活性蛋白含量及蛋白酶A活性進(jìn)行了跟蹤分析。通過(guò)分析，本文選取了6個(gè)具有代表性的發(fā)酵罐（罐號(hào)為09#、14#、28#、29#、45#、45′#），對(duì)其檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以闡明純生啤酒發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶A的分泌規(guī)律及不同蛋白酶A活性對(duì)啤酒泡沫穩(wěn)定性的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1酵母代數(shù)與蛋白酶A分泌量的關(guān)系

酵母菌的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程遵循幼-壯-老-衰-死的生長(zhǎng)規(guī)律，不同代數(shù)的酵母菌株所處的生理狀態(tài)不同，對(duì)啤酒的發(fā)酵也會(huì)有不同的影響［22］。啤酒工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，同一品種的純生啤酒所使用的釀造工藝和酵母菌種是相同的，但是由于酵母代數(shù)不同，會(huì)影響啤酒泡沫穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致不同批次的成品啤酒質(zhì)量千差萬(wàn)別［23］。

圖1　同種酵母不同代數(shù)酵母泥上清液的蛋白酶A活性Fig.1　Proteinase A activity from generations of brewer’s yeast

本實(shí)驗(yàn)對(duì)工業(yè)釀造純生啤酒常用的1～3代P酵母分泌蛋白酶A的情況進(jìn)行了跟蹤分析。圖1為不同代數(shù)酵母泥的上清液蛋白酶A活性。由圖1可以看出：隨著酵母代數(shù)的增加，其分泌的蛋白酶A量增加，5株1代P酵母的蛋白酶A活性均在0.015U/mL以下，5株3代P酵母的蛋白酶A活性均較高，而2代酵母的蛋白酶A活性則有高有低。

通過(guò)對(duì)蛋白酶A活性變化較大的5株2代P酵母的發(fā)酵參數(shù)（表1）分析可知：這5株酵母的存活率及發(fā)酵液的酵母接種量差別不大，因此其中3#的蛋白酶A的活性較高是由于酵母回收時(shí)間及酵母來(lái)源所致。分析原因?yàn)樵谄【漆勗旌笃冢湍缸匀怀两档焦薜?，此時(shí)發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，酵母發(fā)酵結(jié)束，而且發(fā)酵罐底部降溫困難，溫度升高，因此延長(zhǎng)酵母在大罐內(nèi)的貯存時(shí)間將會(huì)導(dǎo)致酵母老化自溶，酵母細(xì)胞膜損傷，蛋白酶A被釋放進(jìn)入酒液［24-25］。另外，2代酵母的4#和5#酵母均來(lái)自高濃發(fā)酵，由于酵母在接種前處于高滲透壓和高酒精度的環(huán)境中，導(dǎo)致酵母褶皺、內(nèi)陷，在接種時(shí)酵母泥本身的蛋白酶A活性較高以至于在后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶A活性始終處于較高水平。因此，在進(jìn)行酵母接種前，除了考慮酵母的存活率外也應(yīng)該檢測(cè)酵母泥的上清液蛋白酶A活性，而且對(duì)于已經(jīng)用于高濃發(fā)酵或回收較晚的酵母（即使為1～3代酵母）以及酵母的蛋白酶A活性超過(guò)0.015U/mL時(shí)應(yīng)不予以考慮進(jìn)行純生啤酒的釀造。

表1　2代酵母的發(fā)酵參數(shù)Table 1　Parameters of fermentation used second-generation yeast

2.2酵母貯存時(shí)間對(duì)其分泌蛋白酶A的影響

酵母的貯存條件，如貯存周期、壓力、溫度都會(huì)對(duì)酵母的活性產(chǎn)生不同程度的影響，特別是蛋白酶A的分泌。本實(shí)驗(yàn)的酵母貯存溫度及壓力基本一致（數(shù)據(jù)未顯示），因此只跟蹤了酵母在貯罐內(nèi)的貯存情況（見(jiàn)圖2）。

圖2　不同酵母貯存時(shí)間下酵母蛋白酶A的分泌增加量Fig.2　Increasing proteinase A activity by yeast in different storage period

由此發(fā)現(xiàn)：隨著酵母貯存周期的延長(zhǎng)，蛋白酶A的分泌量呈上升趨勢(shì)。酵母在貯存2～3d后，其蛋白酶A活性增加量在0.004U/mL以下。但是貯存5d后，酵母蛋白酶A活性急劇增加，達(dá)到0.012U/mL，比剛回收到酵母貯罐的酵母的蛋白酶A活性增加了2倍多。這表明即使在低溫下貯存酵母，酵母分泌蛋白酶A的量仍然會(huì)發(fā)生很大變化。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，要加強(qiáng)對(duì)接種酵母的檢測(cè)和管理，在使用較低代數(shù)酵母的同時(shí)盡可能保證酵母回收后的盡快使用。

2.3發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶A活性及泡沫活性蛋白含量的變化

對(duì)6罐由不同代數(shù)酵母所釀造的純生啤酒各階段（酵母泥上清液、回收酵母后的發(fā)酵液、成熟發(fā)酵液、生啤、成品純生啤酒）蛋白酶A活性及泡沫活性蛋白含量進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)。

表2　各發(fā)酵罐所接種酵母的代數(shù)Table 2　Generation of yeast in fermenter

圖3　啤酒釀造各階段的蛋白酶A活性Fig.3　Proteinase A activity during fermentation

結(jié)合表2和圖3發(fā)現(xiàn)：當(dāng)酵母代數(shù)較高（45′#）或酵母泥的蛋白酶A活性較高（09#）時(shí)，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶A活性呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。另外，即使酵母泥的蛋白酶A活性相差不多（圖3中14#、29#），其發(fā)酵過(guò)程中的蛋白酶A活性變化也會(huì)因酵母代數(shù)的不同而不同。

圖4　釀造過(guò)程中泡沫活性蛋白含量變化Fig.4　Changes of foam protein content during fermentation

圖4則是不同代數(shù)酵母所釀造啤酒的各階段泡沫活性蛋白含量的變化趨勢(shì)，其中45′#、28#和09#發(fā)酵罐的麥汁泡沫活性蛋白含量較高，其次為45#、29#、14#。但是在發(fā)酵結(jié)束后，28#、09#發(fā)酵罐的泡沫活性蛋白含量較低，結(jié)合圖3能夠看出28#和09#發(fā)酵過(guò)程中的蛋白酶A活性較高，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中降解泡沫活性蛋白較多，所以它們的泡沫活性蛋白含量偏低。

2.4蛋白酶A活性與啤酒泡沫穩(wěn)定性的關(guān)系（成品跟蹤情況）

為了探究蛋白酶A活性與啤酒泡沫穩(wěn)定性的關(guān)系，對(duì)蛋白酶A活性不同的成品純生啤酒進(jìn)行室溫貯存并跟蹤它們?cè)?個(gè)月內(nèi)泡持值、泡沫活性蛋白含量及蛋白酶A活性的變化規(guī)律（見(jiàn)表3，圖5～圖7）。

由圖5可知，雖然這些成品啤酒泡持初始值相差不多，均在235S左右，但是常溫貯存半月后，每個(gè)罐的泡持值存在明顯的區(qū)別，且在2個(gè)月后它們的泡持值大部分低于200S。

表3　各罐發(fā)酵參數(shù)Table 3　Parameters of fermentation

圖5　4個(gè)月內(nèi)成品純生啤酒的泡持值Fig.5　Changes of foam stability in 4 months

圖6中成品純生啤酒貯存4個(gè)月后，泡持值低的45′#和28#罐的泡沫活性蛋白含量下降了40%～50%，而泡持值高的29#和14#罐則下降了30%左右，其他發(fā)酵罐下降30%～40%。

圖6　成品貯存過(guò)程中泡沫蛋白的變化Fig.6　Changes of foam protein content during draft beer storage period

圖7中，發(fā)酵罐45′#的成品啤酒蛋白酶A活性最高，在貯存期的前半月呈上升趨勢(shì)，隨后不斷下降；而28#在貯存過(guò)程中始終呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；其他成品蛋白酶A活性則隨著貯存期的延長(zhǎng)而不斷減弱，衰減主要發(fā)生在前2個(gè)月。根據(jù)Kondo等［18］的研究結(jié)果推斷：這一現(xiàn)象與蛋白酶A的動(dòng)力學(xué)特性及蛋白酶A前驅(qū)物有關(guān)，即酵母胞外滲出的蛋白酶A最初在酒液中是以無(wú)活性的蛋白酶A前驅(qū)物存在。由于純生啤酒的酸性環(huán)境［18］及常溫貯存（接近蛋白酶A的最適溫度）非常適宜蛋白酶A由無(wú)活性的前驅(qū)物向有活性的蛋白酶A轉(zhuǎn)化，因此在貯酒階段會(huì)出現(xiàn)蛋白酶A活性升高或泡持性持續(xù)衰減的現(xiàn)象。但是對(duì)于這種轉(zhuǎn)化機(jī)理只處于猜測(cè)階段，目前并無(wú)文獻(xiàn)證明這一推斷，還需要進(jìn)一步探究。

圖7　4個(gè)月內(nèi)成品純生啤酒的蛋白酶A活性Fig.7　Changes of the proteinase A activity of draft beer in 4 months

綜上所述，純生啤酒泡持值的衰減存在一定規(guī)律性：在貯存的前2個(gè)月，泡持衰減的速度最快，而且此階段酒體中蛋白酶A的活性較高；2個(gè)月后，泡沫穩(wěn)定性衰減的速度趨于平緩，甚至消失。另外，每個(gè)發(fā)酵罐所接種酵母的代數(shù)及其蛋白酶A活性不同，其發(fā)酵得到的純生啤酒中蛋白酶A活性也不同。由于蛋白酶A對(duì)泡沫活性蛋白的降解作用，導(dǎo)致了貯存期間泡沫活性蛋白含量的下降，而且蛋白酶A活性越高，成品啤酒的泡沫活性蛋白含量的下降趨勢(shì)越明顯，從而導(dǎo)致其泡持值較快的衰減速率而且在4個(gè)月內(nèi)一直維持這種趨勢(shì)。

圖8　純生啤酒蛋白酶A活性與泡沫穩(wěn)定性的關(guān)系Fig.8　Correlation between the amount of proteinase A in beer and foam stability

根據(jù)上述結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)跟蹤檢測(cè)了不同蛋白酶A酶活（0～50×10-5U/mL）的純生啤酒在室溫貯存2個(gè)月后的泡持值如圖8所示，檢測(cè)結(jié)果表明：泡持值的減少與初始蛋白酶A含量的多少成一定比例。蛋白酶A的酶活越高（當(dāng)超過(guò)15×10-5U/mL時(shí)），這種趨勢(shì)就越明顯。因此，如果降低成熟發(fā)酵液的蛋白酶A酶活（≤25×10-5U/mL），并控制成品初始蛋白酶A活性低于15×10-5U/mL，純生啤酒的泡沫穩(wěn)定性將會(huì)得到改善。

3　結(jié)論

對(duì)酵母分泌蛋白酶A的規(guī)律及其影響因素進(jìn)行了探討，分別從酵母代數(shù)、酵母貯存時(shí)間、發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶A活性變化規(guī)律及蛋白酶A含量不同的純生啤酒貯存期變化趨勢(shì)等四個(gè)方面分析了蛋白酶A對(duì)純生啤酒泡沫穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：使用1～2代的酵母并將接種酵母、成熟發(fā)酵液及成品純生初始的蛋白酶A活性分別控制在0.015、25×10-5、15× 10-5U/mL時(shí)，純生啤酒的泡沫穩(wěn)定性可以得到明顯的改善。

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Study on the rules and influencing factors of yeast proteinase A secretory under industrial scale brewing

DONG Qian-qian1，2，ZHANG Yan-qing2，3，LI Hui-ping2，LI Hong1，3，F(xiàn)ANG Hui-jing2，DU Jin-hua1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China；2.Guangzhou Zhujiang Brewery Co.，Ltd.，Guangzhou 510308，China；3.China National Research Institute of Food&Fermentation Industries，Beijing 100027，China）

The secretory regularity of proteinase A from yeast was investigated in industrial scale fermentation. The factors such as yeast generation and storage conditions were studied to achieve their influencing extent of yeast proteinase A excretory，and the change of proteinase A activity，foam protein and head retention of draft beer with different initial proteinase A level during storage were tested in this study.The results showed that the activity of proteinase A would increase during fermentation，and the tendency was pronounced for fermenting worts while the generation of yeasts was increased.In addition，with the increase of storage period，the concentration of proteinase A excreted from yeast cells also increased.When the activity of proteinase A by yeast was below 0.015U/mL and the initial proteinase A activity in final product was less than 15×10-5U/mL，the foam stability of draft beer would be better than others after 4 months.

beer；proteinase A；foam；yeast；brewing

TS261.1

A

1002-0306（2015）12-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.024

2014－09－10

董倩倩（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

杜金華（1963-），女，博士，教授，研究方向：食品微生物與釀酒技術(shù)。

廣州市海珠區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013-ZD-01）；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)（2014DFG31770）。