許麗賓，鄭凌君，盧　旭，郭　睿，鄭寶東，曾紹校

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

余甘多糖分離純化及其分子結(jié)構(gòu)的研究

許麗賓，鄭凌君，盧旭，郭睿，鄭寶東，曾紹校*

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

分離純化余甘多糖（PePs），并研究其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征。采用熱水浸提法提取余甘粗多糖，經(jīng)DEAESephadex A-25柱層析分離得到兩種不同多糖組分。綜合運(yùn)用硫酸-苯酚、硫酸-咔唑、碘-碘化鉀等化學(xué)分析方法對多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；采用高效液相色譜法鑒定組分的均一性及其分子量（Mw），并用氣相色譜法測定組分的單糖組成；利用紫外光譜、紅外光譜、旋光度研究多糖組分的結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明：余甘粗多糖經(jīng)純化分級(jí)后得到兩種均一的多糖組分：PePsⅠ和PePsⅡ。經(jīng)鑒定，PePsⅠ為含有吡喃的中性還原糖，而PePsⅡ?yàn)楹刑侨┧岬倪拎嵝赃€原糖；兩者對熱穩(wěn)定，不溶于有機(jī)溶劑，不含蛋白質(zhì)和氨基酸；比旋光度［α］D20分別為+68°、+108°；分子量分別為1.49×105、1.51×105u。PePsⅠ主要是由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖等5種單糖構(gòu)成；而PePsⅡ主要是由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖3種單糖構(gòu)成。

余甘，多糖，分離，結(jié)構(gòu)，性質(zhì)

余甘（Phyllanthus emblica L．）又稱“油甘子”、“庵摩勒”，是大戟科（Euphorbiaceae）葉下珠屬（Phyllanthus）植物［1］，1998年被我國衛(wèi)生部確定為藥食兩用植物。余甘主產(chǎn)于印度、馬來西亞等熱帶國家

［2］以及我國的福建、海南、廣東、廣西、云南等地，目前在福建已成規(guī)模化栽培。研究表明，余甘多糖（PePs）具有抑菌［3］、抗氧化［4］和抗腫瘤［5］等生物活性，可抑制癌細(xì)胞生長，值得深入研究和開發(fā)應(yīng)用。多糖的結(jié)構(gòu)是決定多糖類物質(zhì)生理活性的基礎(chǔ)，對多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究有助于了解結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系。多糖結(jié)構(gòu)的研究包括多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的分析［6］。多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)，主要包括單糖組成及比例、分子量分布、單糖殘基間順序、環(huán)狀結(jié)構(gòu)類型和糖苷鍵構(gòu)型等［7］。糖鏈的結(jié)構(gòu)信息，對于了解多糖的生理性質(zhì)和多糖類物質(zhì)在生物體內(nèi)重要的生物活性具有重要的理論意義。然而對余甘多糖的研究主要集中在其藥理活性方面，對于多糖的組成、含量、結(jié)構(gòu)等的研究甚少。且從自然界分離得到的余甘粗多糖是復(fù)雜的混合物，因此需要對其進(jìn)行分離和純化，得到分子量相對均一的組分，再進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析。本文在余甘多糖提?。?］及抗氧化研究的基礎(chǔ)上，對余甘多糖的分離純化工藝、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步了解余甘多糖的構(gòu)效關(guān)系提供必要的理論基礎(chǔ)，以促進(jìn)余甘多糖的這一寶貴資源的開發(fā)利用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

余甘鮮果于10月份采摘自福建惠安縣紫山鎮(zhèn)尾山山脈，品種：南大余甘；單糖標(biāo)樣上海博奧生物科技公司；肌醇六乙酸酯（內(nèi)標(biāo)）上海試劑廠；碘-碘化鉀溶液、茚三酮溶液、95%乙醇、苯酚、硫酸、氯仿、異戊醇、丙酮、乙醚、鹽酸羥胺、吡啶、醋酸酐、肌醇均為分析純。

DEAE-SephadexA-25美國Sigma公司；AVATAR360型傅立葉紅外光譜儀美國尼高力公司；DYY-Ⅲ型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京六一廠；BSZ-160型自動(dòng)部分收集器上海滬西儀器廠；UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)尤尼柯（上海）儀器有限公司；TDL-5型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；pHS-3C型精密pH計(jì)、Wzz-2B型自動(dòng)旋光儀上海精密科學(xué)儀器有限公司；MDF-382E型超低溫冰箱（-85℃） 日本三洋公司；DY 89-1型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；Waters2695型高效液相色譜儀、Waters2420型檢測器、Ultrahydrogel Linear型水相GPC柱Waters公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1余甘多糖水提工藝流程余甘果經(jīng)篩選、清洗等處理后，切取300g果肉研磨成漿，按料液比1∶20加入蒸餾水，100℃浸提4h，冷卻后過100目篩得濾液，反復(fù)浸提2次，濾液合并，3000r/min離心10min，取上清液加入5倍量的95%乙醇，除去單糖、低聚糖和色素等物質(zhì)，3000r/min離心15min，取沉淀用蒸餾水溶解，于60℃真空干燥至水分含量在10%左右，粉碎過100目篩即得粗多糖。稱量后按照式（1）計(jì)算得粗多糖提取率。

式中：m1為余甘多糖粗品的質(zhì)量（mg）；m2為余甘果肉的質(zhì)量（mg）。

1.2.2余甘多糖的分離純化準(zhǔn)確稱取余甘粗多糖1.0g，配成20mg/mL的水溶液，5000r/min離心，棄去沉淀，上清液用Sevage法［9］（氯仿∶正丁醇=5∶1）去除游離蛋白質(zhì)，重復(fù)操作4次，離心10min，上清液用蒸餾水透析48h，60℃減壓濃縮得余甘多糖半純品。半純品經(jīng)DEAE-Sephadex A-25柱層析純化，0.1～1.0mol/L NaCl梯度洗脫，苯酚-硫酸法［10］跟蹤檢測，490nm處測定吸光度值，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作圖，收集含糖組分，旋蒸濃縮，透析脫鹽，冷凍干燥得兩個(gè)純組分PePsⅠ、PePsⅡ（水分含量約為10%）。稱量后按式（2）計(jì)算余甘多糖純品的提取率。

式中：m1為余甘多糖粗品的質(zhì)量（mg）；m3為余甘多糖純品的質(zhì)量（mg）。

1.2.3余甘多糖純度鑒定在紙層析預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）［11］，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度3%，電泳緩沖液為0.0125mol/L硼砂-硼酸緩沖液（pH9.0），電壓100～150V，電泳3h，高碘酸Schiff試劑染色，1%偏重亞硫酸鈉-0.1mol/L于HCl中保存。

1.2.4余甘多糖理化性質(zhì)的測定

1.2.4.1蛋白質(zhì)含量和多糖含量的測定采用CBBG250色素結(jié)合法［10］測定蛋白質(zhì)含量；采用硫酸-苯酚比色法測定多糖含量，以葡萄糖為標(biāo)樣，校正系數(shù)0.9，用硫酸-咔唑法［12］測定糖醛酸含量，以半乳糖醛酸為標(biāo)樣。

1.2.4.2顏色反應(yīng)a.碘-碘化鉀反應(yīng)：配成1mg/mL溶液，加入碘-碘化鉀試劑（含0.02%I2的0.2%KI溶液），觀察其顏色變化。

b.費(fèi)林試劑反應(yīng)：取費(fèi)林試劑A（50μL濃硫酸和3.45g硫酸銅，用蒸餾水定容于500mL的容量瓶）和B（6.85g酒石酸鈉鉀和6.25g氫氧化鈉，用蒸餾水定容于25mL的容量瓶）各0.25mL混勻，分別加入余甘多糖溶液數(shù)滴，沸水浴加熱2～3min，觀察其顏色變化。

c.茚三酮反應(yīng)：取10mL試管，加入余甘多糖溶液1mL，加入茚三酮溶液10滴，將試管放入沸水中加熱10min，觀察現(xiàn)象，有藍(lán)紫色化合物生成為陽性反應(yīng)。

1.2.4.3余甘多糖的熱穩(wěn)定性測定分別稱取PePsⅠ、Ⅱ樣品各5份，每份20mg，加沸蒸餾水1mL溶解后，分別置室溫、40、60、80、100℃烘干，觀察其顏色變化，隨后分別用10mL蒸餾水溶解、離心后取上清液透析后定容至10mL，用硫酸-苯酚法測其含量，設(shè)定室溫條件下樣品含量為100%，其他樣品以相對含量表示。

1.2.5余甘多糖結(jié)構(gòu)性質(zhì)研究

1.2.5.1余甘多糖的光譜性質(zhì)a.紫外光譜性質(zhì)（UV）：將樣品配成0.1%水溶液，用紫外可見分光光度計(jì)在190～400nm區(qū)間進(jìn)行掃描。

b.紅外光譜性質(zhì)（IR）：采用KBr壓片法制樣；檢測器分辨率：4cm-1；掃描次數(shù)：64；測試范圍：4000～400cm-1。稱取1mg干燥的多糖樣品與在紅外干燥箱中干燥的溴化鉀（KBr）粉末，在瑪瑙研缽中充分研磨，用壓片機(jī)壓成薄片進(jìn)行紅外光譜掃描；不添加多糖的KBr薄片作為背景掃描。

1.2.5.2余甘多糖的比旋光度測定準(zhǔn)確稱取PePsⅠ和PePsⅡ樣品各5mg，定容于10mL容量瓶中待測。計(jì)算公式為l為旋光管的長度，dm；ρB為質(zhì)量濃度（100mL溶液中所含樣品的質(zhì)量），g；t為測定時(shí)的溫度，℃；λ為光源的光波長，nm；α為旋光度的測定值；［α］為比旋光度。

1.2.5.3余甘多糖分子量（Mw）的測定采用高效液相色譜（HPLC）分析。色譜柱為Ultrahydrogel Linear，RID-5A示差折射檢測器檢測，流動(dòng)相為蒸餾水，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為25μL，樣品濃度為5mg/mL。

1.2.5.4余甘多糖的單糖組分分析a.氣相色譜分析：將上述水解過的樣品及標(biāo)準(zhǔn)單糖制備成糖腈乙酸酯衍生物后進(jìn)行氣相色譜分析。糖腈乙酸酯衍生物制備方法參照Qiao等［13］的方法。氣相色譜條件為：FID，石英毛細(xì)管柱30m×0.25mm×0.25mm。固定液為SE-54，高純氮?dú)庾鳛檩d氣，總流速為77mL/min，分流比為1∶76，氫氣流速為10mL/min。柱溫箱溫度190℃，汽化室280℃，氫焰280℃。程序升溫起始溫度190℃，以5℃/min升至215℃，保持2min，再以1℃/min升至240℃，保持1min。對照樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰位置判斷多糖組成。

b.組成單糖摩爾比值測定：內(nèi)標(biāo)物為肌朜六乙酸酯，先測定L-鼠李糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖和D-半乳糖等6種標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的出峰時(shí)間，并按公式（m代表單糖質(zhì)量，A代表峰面積）求出上述6個(gè)單糖衍生物的校正因子f。樣品的摩爾比測定條件與校正因子相同。將得到各單糖的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積比，乘以f/M（M代表各個(gè)單糖的分子量），即為各單糖摩爾比。

2　結(jié)果與分析

2.1余甘多糖的分離純化及純度鑒定

DEAE-Sephadex A-25柱層析結(jié)果如圖1所示。

圖1　余甘多糖的DEAE-Sephadex A-25洗脫曲線Fig.1　Elution curve of P.emblica L.polysaccharide by DEAE-Sephadex A-25

余甘多糖半純品經(jīng)DEAE-Sephadex A-25層析柱純化，洗脫得到兩種不同分子量分布的多糖：PePsⅠ和PePsⅡ。洗脫曲線為單一對稱峰，無明顯拖尾，且呈高斯分布，分離效果較佳，樣品較純。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，高碘酸-Schiff試劑染色顯示出單一條帶，表明純化后的PePsⅠ和PePsⅡ是相對均勻的純多糖。

2.2余甘多糖純化組分的理化性質(zhì)分析

熱水浸提得到余甘粗多糖的提取率為1.18%（相對于余甘果肉），再經(jīng)DEAE-Sephadex A-25柱進(jìn)一步層析純化的多糖純組分得率為28.15%。蛋白質(zhì)和多糖的測定實(shí)驗(yàn)表明，PePsⅠ和PePsⅡ中都不含蛋白質(zhì)，總糖含量分別為65.73%和68.55%；PePsⅠ不含糖醛酸，屬中性多糖，而PePsⅡ含有54.91%糖醛酸，是酸性多糖。經(jīng)測定，PePsⅠ、PePsⅡ的旋光度分別為0.034、0.054，比旋光度分別為+68°、+108°。此外，由于大分子物質(zhì)的比旋光度是由單體的不對稱性和大分子整體的空間不對稱性決定的［16］，而PePsⅡ具有較大的比旋光度，說明其整體不對稱性較顯著。

PePsⅠ和PePsⅡ經(jīng)不同溫度（40、60、80、100℃）烘干后，形態(tài)（白色絲狀）與室溫干燥相似，含糖量無顯著變化（數(shù)據(jù)未給出），表明了PePsⅠ和PePsⅡ的熱穩(wěn)定性好；二者均不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機(jī)溶劑，但可溶于水，尤其易溶于熱水；PePsⅠ和PePsⅡ水溶液為透明粘狀液體，pH分別為6.94和6.87。PePsⅠ和PePsⅡ經(jīng)化學(xué)鑒定結(jié)果如下：這兩種多糖純品分別與苯酚-硫酸反應(yīng)溶液顯橙黃色、與費(fèi)林試劑反應(yīng)溶液呈磚紅色（陽性），說明PePsⅠ和PePsⅡ均屬于還原性糖類物質(zhì)；與硫酸-咔唑反應(yīng)分別呈陰性和陽性（紫紅色），表明PePsⅠ不含糖醛酸，而PePsⅡ含有糖醛酸；與茚三酮反應(yīng)溶液未呈藍(lán)紫色，說明兩者的結(jié)構(gòu)中不含氨基酸；與碘-碘化鉀反應(yīng)溶液未變成藍(lán)色，說明這兩種成分不含淀粉。

圖2　PePsⅠ和PePsⅡ的紫外掃描光譜Fig.2　The UV spectra of PePsⅠand PePsⅡ

2.3余甘多糖組成與結(jié)構(gòu)的研究

2.3.1余甘多糖的組成圖2是PePsⅠ、PePsⅡ水溶液在190～400nm的紫外光譜掃描圖譜。紫外光譜分析表明，PePsⅠ和PePsⅡ在紫外掃描范圍內(nèi)均無明顯的特征性吸收峰，說明PePsⅠ、PePsⅡ基本不含有蛋白質(zhì)和核酸。紫外掃描的結(jié)果與2.2理化性質(zhì)的分析結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了余甘多糖分離純化的純度較高。同時(shí)也表明了DEAE-Sephadex A-25層析柱起到了很好的分離作用，有效地去除了殘留的蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)。

2.3.2余甘多糖紅外光譜分析紅外光譜是研究多糖類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的有效途徑，可根據(jù)吸收峰位置推測多糖的特征基團(tuán)和糖苷鍵連接類型［14］。因此紅外光譜分析將進(jìn)一步確定余甘多糖結(jié)構(gòu)的信息。

圖3　PePsⅠ和PePsⅡ的紅外光譜圖（IR）Fig.3　IR Spectrum of PePsⅠand PePsⅡ

圖3是PePsⅠ、PePsⅡ的紅外吸收光譜圖，其結(jié)構(gòu)特征如表1。由圖3可知，兩種樣品在4000～400cm-1區(qū)域具有多糖類物質(zhì)的一般特征，其特征吸收峰分別是3449、2927、1632、1384、1064cm-1和3448、2932、1746、1629、1239、1077cm-1。圖3中3600～3200cm-1（3449、3448cm-1）處的吸收峰是由-OH基官能團(tuán)產(chǎn)生的，峰形尖銳；3000～2800cm-1（2927、2932cm-1）處有中等的糖類C-H伸縮振動(dòng)吸收峰；1650～1600cm-1（1632cm-1）處有較強(qiáng)的酰氨基C=O特征吸收峰；這幾組峰說明樣品有糖醛的存在，可初步判斷該物質(zhì)是糖類化合物。1750cm-1附近的吸收峰是糖醛酸的C=O鍵引起的，1384cm-1的吸收峰代表了C-H鍵的變角振動(dòng)，1239cm-1代表-COOH中O-H變角振動(dòng)。1200～950cm-1附近的吸收峰是由C-O-H和C-O-C的兩種C-O鍵伸縮振動(dòng)引起，由此說明多糖的結(jié)構(gòu)中含有酸性羧基基團(tuán)。1063、1073cm-1的強(qiáng)吸收峰證明其中的單糖以吡喃的形式存在［15］。根據(jù)紅外光譜分析結(jié)果，初步鑒定PePsⅠ是含有吡喃的多糖，PePsⅡ是含有糖醛酸的吡喃酸性多糖。

2.3.3余甘多糖的分子量測定多糖分子量是研究多糖生理活性的一個(gè)重要的參數(shù)，其性質(zhì)往往跟它的分子量大小有關(guān)。一般地，多糖分子量的數(shù)量級(jí)范圍在104～106，屬中等分子物質(zhì)。

表1　PePsⅠ和PePsⅡ的紅外光譜圖分析Tabel 1　Analysis of IR spectrum of PePsⅠand PePsⅡ

圖4　PePsⅠ和PePsⅡ相對分子量的測定Fig.4　The relative molecular weight of PePsⅠand PePsⅡ

由圖4可以看出，PePsⅠ和PePsⅡ兩個(gè)組分經(jīng)高效液相色譜檢測，僅出現(xiàn)單一的、相對對稱的洗脫峰，表明余甘粗多糖經(jīng)分離以后所得到的2個(gè)組分均為相對均一的多糖組分［17-18］，具有較高的純度。

以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量和對應(yīng)的出峰時(shí)間為對照，采用歸一法計(jì)算濃度，定量峰面積。選擇分子量（Mw）范圍與樣品接近的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（分子量為5800、9600、15000、27000、40000、65000、130000、300000、500000、600000u）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=-0.0634x+5.5584（R2=0.9945），式中：y為余甘多糖分子量（Mw）的對數(shù)值，x為余甘多糖的保留時(shí)間（min）。通過測定余甘多糖在色譜柱的保留時(shí)間，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求換算樣品的分子量。結(jié)果見表2、表3。由此可知，PePsⅠ和PePsⅡ兩個(gè)組分的保留時(shí)間分別為6.073、5.971min；通過線性回歸方程計(jì)算，得到PePsⅠ和PePsⅡ的分子量分別為1.49×105、1.51×105u。兩者的分散系數(shù)（Mw/Mn）均小于1，屬于窄分布寬度樣品，且PePsⅡ的分子量分布比PePsⅠ更廣些。

表2　標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量和對應(yīng)出峰時(shí)間Table 2　The distribution map of samples dextran molecular weight

表3　樣品的分子量和對應(yīng)的出峰時(shí)間Table 3　The distribution map of samples molecular weight

2.3.4余甘多糖的單糖組分分析采用糖睛乙酸酯衍生法，對單糖標(biāo)準(zhǔn)品和余甘多糖全水解后的樣品進(jìn)行衍生化處理，通過GC測定多糖樣品的單糖組成，氣相色譜圖如圖5所示。由于樣品中的糖醛酸不能衍生，故不能被氣相色譜檢出，糖醛酸未出峰，因此可結(jié)合咔唑法所測糖醛酸的含量來比較。

將PePsⅠ與PePsⅡ的氣相色譜圖與單糖標(biāo)樣的氣相色譜圖比較可知，PePsⅠ主要是由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖5種單糖構(gòu)成；PePsⅡ主要是由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖3種單糖構(gòu)成。

表4反映了各個(gè)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間以及PePsⅠ、PePsⅡ兩物質(zhì)中含有的單糖的出峰情況。與標(biāo)準(zhǔn)單糖的圖譜進(jìn)行對比，可初步判斷PePsⅠ、PePsⅡ中的單糖組成。

表4　標(biāo)準(zhǔn)單糖以及PePsⅠ和PePsⅡ降解的糖腈乙酸酯衍生物GC結(jié)果Table 4　The GC analysis of monosaccharide components of Phyllanthus emblica L.polysaccharide

由表4可見，由于內(nèi)標(biāo)有所漂移，因此樣品的出峰時(shí)間隨著漂移是正常的。GC的結(jié)果表明PePsⅠ由5種單糖組成，PePsⅡ由3種單糖組成。

2.3.5單糖組成分析表5、表6是PePsⅠ、PePsⅡ經(jīng)水解后各單糖糖腈乙酸酯衍生化后的氣相色譜分析結(jié)果。根據(jù)相應(yīng)單糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的相對保留時(shí)間進(jìn)行定性，以面積歸一化法計(jì)算各種單糖的含量占樣品中總糖量的百分比來定量，峰面積之比=質(zhì)量比。

圖5　單糖標(biāo)準(zhǔn)品（A）、PePsⅠ和PePsⅡ的氣相色譜圖Fig.5　The GC chromatography of standard monosaccharide（A），PePsⅠand PePsⅡ

表5　PePsⅠ的單糖組成Table 5　Monosaccharide composition of PePsⅠ

由表5可見，以木糖的物質(zhì)的量為1，相對摩爾比為n鼠∶n阿∶n木∶n葡∶n半=11.535∶16.349∶1.0∶9.525∶61.63，這5種單糖含量相差較大，半乳糖的含量最高。

表6　PePsⅡ的單糖組成Table 6　Monosaccharide composition of PePs-Ⅱ

由表6可見，以半乳糖的物質(zhì)的量為1，相對摩爾比為n鼠∶n阿∶n半=1.137∶1.867∶1.0，這三種單糖的含量比較接近。

3　結(jié)論與討論

采用DEAE-Sephadex A-25柱層析分離純化余甘粗多糖得到PePsⅠ和PePsⅡ兩個(gè)不同組分。經(jīng)理化性質(zhì)測定，兩者對熱穩(wěn)定，不溶于有機(jī)溶劑，不含蛋白質(zhì)和氨基酸；PePsⅠ是含糖量為65.73%的中性多糖；PePsⅡ?qū)偎嵝远嗵?，含糖量?8.55%、糖醛酸含量為54.91%。由純度鑒定可知，PePsⅠ和PePsⅡ是均勻的純多糖。HPLC測定得到PePsⅠ和PePsⅡ分子量分別為1.49×105、1.51×105u。余甘多糖酸水解物經(jīng)HPLC和GC測定結(jié)果表明：PePsⅠ主要是由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖5種單糖構(gòu)成，摩爾比為n鼠∶n阿∶n木∶n葡∶n半＝11.535∶16.349∶1.0∶9.525∶61.63；PePsⅡ主要由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖3種單糖構(gòu)成，摩爾比為：n鼠∶n阿∶n半＝1.137∶1.867∶1.0。

PePsⅠ和PePsⅡ中的總糖含量低于70%，測量結(jié)果偏低，可能是由于多糖中存留著少量的色素和灰分等引起的，導(dǎo)致測定結(jié)果無法反應(yīng)多糖的真實(shí)含量。苯酚硫酸法最大吸收波長在480～490nm范圍內(nèi)，但在實(shí)際應(yīng)用時(shí)會(huì)因水解出的單糖種類、比例的不同而出現(xiàn)偏差，如PePsⅠ和PePsⅡ?qū)匐s多糖，苯酚硫酸法測定是以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)對照品，而各單糖的顯色靈敏度不同，且葡萄糖的顯色較強(qiáng)，這就會(huì)造成多糖含量測定的誤差。因此，可對苯酚-硫酸法測定余甘多糖含量作進(jìn)一步研究，先用GC測定多糖的組分及相對比例，再按各糖的比例作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣可較好的減小測定誤差。

［1］AnilakumarK，NagarajN，SanthanamK.Reduction ofhexachlorocyclohexane-induced oxidative stress and cytotoxicity in rat liver by Emblica officinalisgaertn［J］.Indian journal of experimental biology，2007，45（5）：450.

［2］王輝.余甘子的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代中藥，2011，13（11）：52-56.

［3］Dhale D，Mogle U.Phytochemical screening and antibacterial activity of Phyllanthus emblica（L.）［J］.Sci Res Report，2011，1（3）：138-142.

［4］Liu X，Cui C，Zhao M，et al.Identification of phenolics in the fruit of emblica（Phyllanthus emblica L.）and their antioxidant activities［J］.Food Chemistry，2008，109（4）：909-915.

［5］Sultana S，Ahmed S，Jahangir T.Emblica officinalis andhepatocarcinogenesis：A chemopreventive study in Wistar rats［J］.Journal of ethnopharmacology，2008，118（1）：1-6.

［6］Sun Y，Wang S，Li T，et al.Purification，structure and immunobiological activity of a new water-soluble polysaccharide from the mycelium of Polyporus albicans（Imaz.） Teng［J］. Bioresource technology，2008，99（4）：900-904.

［7］謝明勇，聶少平.天然產(chǎn)物活性多糖結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2010，10（2）：1-11.

［8］鄭寶東，曾紹校.福建余甘可溶性多糖提取工藝研究［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2003，3（1）：37-40.

［9］Wang X，Yuan Y，Wang K，et al.Deproteinization ofgellangum produced by Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461［J］.Journal of biotechnology，2007，128（2）：403-407.

［10］胡建.牛蒡多糖的提取純化及其抗氧化性研究［D］.揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2011.

［11］Weitzhandler M，Kadlecek D，Avdalovic N，et al. Monosaccharideandoligosaccharideanalysisofproteins transferred to polyvinylidene fluoride membranes after sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis［J］.Journal of Biological Chemistry，1993，268（7）：5121-5130.

［12］楊明康.肝素前體多糖的分離純化研究［D］.杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2013.

［13］Qiao D，hu B，gan D，et al.Extraction optimized by using responsesurfacemethodology，purificationandpreliminary characterization of polysaccharides fromhyriopsis cumingii［J］. Carbohydrate Polymers，2009，76（3）：422-429.

［14］Kacurakova M，Capek P，Sasinkova V，et al.FT-IR study of plantcellwallmodelcompounds：pecticpolysaccharides andhemicelluloses［J］.Carbohydrate Polymers，2000，43（2）：195-203.

［15］Cai W，gu X，Tang J.Extraction，purification，and characterization of the polysaccharides from Opuntia milpa alta［J］.Carbohydrate Polymers，2008，71（3）：403-410.

［16］Di X，Chan K K，Leungh W，et al.Fingerprint profiling of acidhydrolyzates of polysaccharides extracted from the fruiting bodies and spores of Lingzhi byhigh-performance thin-layer chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2003，1018（1）：85-95.

［17］甘聃.鼎湖鱗傘菌絲體多糖的發(fā)酵條件優(yōu)化、分離純化、抗腫瘤活性及其機(jī)制的研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［18］戴艷.駿棗多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)分析及抗氧化活性研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

Study on the separation，purification and molecular structure characterization of Phyllanthus emblica L.polysaccharide

XU Li-bin，ZHENG Ling-jun，LU Xu，GUO Rui，ZHENG Bao-dong，ZENG Shao-xiao*
（College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

The refined polysaccharide fractions were conducted from Phyllanthus emblica L.，then characterized their physiochemical and structural properties.The P.emblica polysaccharide was extracted with hot water，purified sequentially by DEAE-Sephadex A-25 column chromatography then obtained two different polysaccharides.With analyzed for physical and chemical properties by chemical analysis，such as sulphuric acid-phenol，sulphuric acid-carbazole，I-KI.Homogeneity and relative molecular weights（Mw）tested by high performance liquid chromatography（HPLC）and monosaccharide composition which was determined by gas chromatography.Structural characterizations were carried out by ultraviolet spectroscopy and infrared spectroscopy（FT-IR）.The result showed that the fractional purification included PePsⅠand PePsⅡ.PePsⅠwas neutral sugar with pyran，then PePsⅡ was pyran acidic polysaccharide containing uronic acid.Both of them were heat-stable，insoluble in organic solvents and free of proteins and amino acids.The specific rotation of PePsⅠand PePsⅡ were+68°and+108°，relative molecular mass were 1.49×105u and 1.51×105u，respectively.PePsⅠwere constituted mainly by five monosaccharide residues，including L-rhamnose，L-arabinose，D-xylose，then PePsⅡwere constituted mainly by three monosaccharide residues，such as L-rhamnose，L-arabinose，D-galactose.

Phyllanthus emblica L.；polysaccharide；separation；structure；properties

TS201.1

A

1002-0306（2015）12-0127-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.018

2014－09－10

許麗賓（1988-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

曾紹校（1980-），男，博士，副教授，研究方向：淀粉化學(xué)及天然產(chǎn)物活性。

福建省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（閩教科［2012］03號(hào)）；福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（cxtd12009）。