畢淑峰，張迷迷，郜耿玉，盧玉生，徐勝林，姜　航

（黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽黃山245041）

荷花蜂花粉精油化學(xué)成分及生物學(xué)活性研究

畢淑峰，張迷迷，郜耿玉，盧玉生，徐勝林，姜航

（黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽黃山245041）

采用水蒸氣蒸餾法提取荷花蜂花粉精油，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析其化學(xué)成分，并測(cè)定精油的抗菌活性和金屬離子螯合作用。從精油中共鑒定出44個(gè)化合物，占揮發(fā)油總量的82.74%，主要成分有十五烷、棕櫚酸、石竹烯氧化物、1-石竹烯、α-松油醇、二十一烷、8-十七碳烯等。精油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌有一定抑制作用，對(duì)金屬離子有較好的螯合作用，且樣品量與抗菌活性和金屬離子螯合率呈量效關(guān)系。

荷花蜂花粉，精油，化學(xué)成分，抗菌活性，金屬離子螯合作用

花粉是植物雄蕊產(chǎn)生的雄性生殖細(xì)胞，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用成分，被譽(yù)為完全營(yíng)養(yǎng)素、微型營(yíng)養(yǎng)庫(kù)［1］。蜜蜂采集花粉過(guò)程中，混合花粉、花蜜和唾液，形成蜂花粉。蜂花粉是人類(lèi)利用植物花粉資源的主要形式，以蜂花粉為原料研制和開(kāi)發(fā)多種保健食品和藥品。蜂花粉含有蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、脂肪酸、磷脂、多糖、維生素、黃酮、礦質(zhì)元素等生物活性成分［2-4］，具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、增強(qiáng)免疫力、抗病毒、抑制前列腺疾病、抗氧化、美容養(yǎng)顏等功能［3-6］。荷花蜂花粉是常見(jiàn)的蜂花粉，對(duì)荷花蜂花粉的總黃酮、多糖的研究較多［7-8］，對(duì)荷花蜂花粉精油及其生物活性研究較少。本實(shí)驗(yàn)利用水蒸氣蒸餾法提取荷花蜂花粉精油，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析其化學(xué)成分，并測(cè)定其抗菌活性和金屬離子的螯合作用，為荷花蜂花粉的開(kāi)發(fā)利用、藥理研究等提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

荷花蜂花粉購(gòu)于黃山市養(yǎng)生源蜂業(yè)有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌（Escherichiacoli）、變形桿菌（Proteusbacillus vulgaris）由黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；菲洛嗪（Ferrozine） 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；二甲基亞砜（DMSO）、無(wú)水乙醚、無(wú)水硫酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Agilent HP7890-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)Agilent公司；UV754N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；ZHJH-1209B型無(wú)菌操作臺(tái)蘇州凈化有限公司；BB89揮發(fā)油提取器鄭州中天實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2精油的提取粉碎的蜂花粉置于揮發(fā)油提取器的圓底燒瓶中，加300mL蒸餾水，連接揮發(fā)油提取裝置，在中間連接管中加入約10mL蒸餾水和5mL無(wú)水乙醚。按水蒸氣蒸餾法提取6h，收集無(wú)水乙醚層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，揮發(fā)無(wú)水乙醚，得到淡黃色油狀物，稱(chēng)重，得率為0.17%。

［9］的方法，并稍作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取40g

1.3GC-MS分析條件

色譜條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（0.25μm× 30m×0.25mm）；程序升溫的初始溫度為40℃保留3min，以4℃/min升至160℃，保留3min，以5℃/min升至285℃，保留5min；高純氦氣（99.99%）為載氣；體積流量為1.0mL/min；分流比為150∶1；進(jìn)樣量為0.5μL。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70eV；離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃；全掃描采集模式，質(zhì)量范圍m/z 35～450。

1.4體外抗菌活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)［10］的方法，并略作修改。用DMSO配制100%、50%、25%三種濃度梯度精油，使用前用無(wú)菌有機(jī)濾膜過(guò)濾。取100μL約108CFU/mL的菌液（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌）均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，將不同濃度精油浸泡過(guò)的濾紙片等距離置于已接種的平板上，用DMSO浸泡的濾紙片作為陰性對(duì)照。37℃培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.5金屬離子螯合作用測(cè)定

參照文獻(xiàn)［11］的方法。將20、40、60、80、100μL體積分?jǐn)?shù)50%精油置于5支試管中，分別加入80、60、40、20、0μL丙酮。各試管中加入2.8mL蒸餾水、50μL 2mmol/L的FeCl2·4H2O和150μL 5mmol/L的Ferrozine，混勻，靜置10min，在562nm處測(cè)吸光度（At）。以100μL丙酮代替樣品作為空白對(duì)照，測(cè)其吸光度（A0）；以相同體積0.5mg/mL的EDTA代替樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。金屬螯合率（%）=（1－At/A0）×100。

2　結(jié)果與分析

2.1荷花蜂花粉精油化學(xué)成分的GC-MS分析結(jié)果

用GC-MS分析荷花蜂花粉精油的化學(xué)成分，經(jīng)NIST08譜庫(kù)檢索、質(zhì)譜分析等確定精油的化學(xué)成分，并用面積歸一化法分析各組分的相對(duì)含量，總離子流圖和化學(xué)成分分別見(jiàn)圖1和表1。從荷花蜂花粉精油中共分離出66種化學(xué)成分，鑒定出其中44種成分，占精油色譜峰總面積的82.74%。精油中含有2種醇（1.10%）、9種醛（2.81%）、4種酮（3.53%）、5種脂肪酸（16.70%）、2種酯（0.99%）、12種萜類(lèi)及其含氧衍生物（26.89%）、8種烷烴（29.31%）、1種酚（0.14%）、1種醚（1.27%），以烷烴、萜類(lèi)及其含氧衍生物、脂肪酸為主；其中萜類(lèi)成分包括3種單萜及其含氧衍生物（8.64%）、9種倍半萜及其含氧衍生物（18.25%），烷烴包括6種飽和烷烴（24.75%）、2種不飽和烯烴（4.56%）；脂肪酸酸包括4種中鏈脂肪酸（6.67%）、1種長(zhǎng)鏈脂肪酸（10.03%）。精油中高于3.00%的組分有十五烷（13.08%）、棕櫚酸（10.03%）、石竹烯氧化物（7.16%）、1-石竹烯（6.94%）、α-松油醇（5.78%）、二十一烷（4.84%）、8-十七碳烯（3.63%）、辛酸（3.46%）、十七烷（3.43%），9種主要組分占精油總量的58.35%。

表1　荷花蜂花粉精油的化學(xué)成分Table 1　Chemical constituents of the essential oil from lotus bee pollens

續(xù)表

圖1　荷花蜂花粉精油化學(xué)成分的總離子流圖Fig.1　Total ion chromatogram of the essential oil from lotus bee pollens

烷烴是野菊、玫瑰、虞美人等多種蜂花粉揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分，棕櫚酸是12種蜂花粉的揮發(fā)性物質(zhì)的共有成分［12］。十五烷烴是荷花蜂花粉精油中含量最高的成分，也是4種荷花揮發(fā)性成分中含量最高的成分；萜類(lèi)及其含氧衍生物是荷花揮發(fā)性成分的主要成分，也是荷花特征香氣的物質(zhì)基礎(chǔ)；從荷花蜂花粉精油中鑒定出的十五烷烴、十六烷烴、8-十七碳烯、α-萜品醇等是5種荷花揮發(fā)性成分的共有成分［13］。荷花蜂花粉精油化學(xué)成分與荷花揮發(fā)性成分存在較大的相似性。荷花蜂花粉精油中的苯甲醛、苯乙醛、α-萜品醇等可用作食用香料；茉莉酮廣泛應(yīng)用于茉莉系列香精中，己酸可作為調(diào)味品，對(duì)苯二甲醚用作定香劑，壬醛可用作食品添加劑；石竹烯氧化物具有鎮(zhèn)痛和抗炎作用。

2.2荷花蜂花粉精油的抗菌作用

由表2可知，荷花蜂花粉精油對(duì)三種供試菌種均有抑制作用，在測(cè)試的濃度范圍內(nèi)，各種濃度荷花蜂花粉精油對(duì)供試菌抑制作用依次為：變形桿菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌，且抑菌作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，存在濃度依賴(lài)性?；瘜W(xué)成分是決定精油抗菌活性的內(nèi)在因素，荷花蜂花粉精油中含量較高的辛酸可用作防腐劑和殺菌劑，α-萜品醇也可用作防腐劑，芳樟醇、α-蒎烯具有一定抗菌作用，石竹烯氧化物具有顯著抗真菌作用。

表2　荷花蜂花粉精油的抗菌活性Table 2　Antimicrobial activity of the essential oil from lotus bee pollens

2.3荷花蜂花粉精油對(duì)金屬離子的螯合作用

金屬離子在自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中起催化作用，可以縮短自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的誘導(dǎo)期，增大氧化速率；金屬離子螯合劑可以鈍化金屬離子的催化作用，極大地增強(qiáng)自由基受體的抗氧化性質(zhì)［14］。由圖2可知，50%荷花蜂花粉精油對(duì)金屬離子有較好的螯合能力，100μL時(shí)的螯合率為89.42%；在測(cè)定的體積范圍內(nèi)，精油的螯合效果優(yōu)于0.5mg/mL的EDTA。荷花蜂花粉精油對(duì)金屬離子的螯合率與樣品體積呈劑量依賴(lài)關(guān)系，隨著樣品用量的增大，螯合率逐漸增大。精油樣品用量（X）與螯合率（Y）的回歸方程為Y=0.7033X+ 23.8661（R2=0.9717）；當(dāng)螯合率為50%時(shí)，精油和EDTA的用量分別為37.16、51.74μL，EDTA的用量是精油用量的1.39倍。

圖2　荷花蜂花粉精油對(duì)金屬離子的螯合能力Fig.2　Metal chelating ability of the essential oil from lotus bee pollens

3　結(jié)論

從荷花蜂花粉精油中共鑒定出44種化學(xué)成分，占精油總量的82.74%，主要成分為烷烴、萜類(lèi)及其含氧衍生物和脂肪酸，與荷花揮發(fā)性成分存在較大相似性。荷花蜂花粉精油含有多種生物活性成分，在香精香料、食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)有應(yīng)用價(jià)值。荷花蜂花粉精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌均有抑制作用，且存在劑量依賴(lài)關(guān)系。荷花蜂花粉精油對(duì)金屬離子的螯合作用較強(qiáng)，螯合率為50%時(shí)，樣品用量?jī)H為37.16μL。因此，荷花蜂花粉精油在天然殺菌劑、防腐劑和抗氧化劑方面有開(kāi)發(fā)前景。

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Chemical constituents，bioactivities of the essential oil from lotus bee pollens

BI Shu-feng，ZHANG Mi-mi，GAO Geng-yu，LU Yu-sheng，XU Sheng-lin，JIANG Hang
（College of Life and Environment Science，Huangshan University，Huangshan 245041，China）

The essential oil from lotus bee pollens was extracted by water-steam distillation and its chemical constituents were analyzed by GC-MS.The antimicrobial activity and metal chelating ability of the essential oil were determined.Forty-four compounds，which occupied 82.74%of total constituents，were identified from the essential oil.The major constituents were pentadecane，hexadecanoic acid，caryophyllene oxide，l-caryophyllene，α-terpineol，heneicosane，and 8-heptadecene.The essential oil exhibited certain antimicrobial activity against Staphyloccocus aureus，Escherichia coli，and Proteusbacillus vulgaris and significant metal chelating ability in a concentration-dependent fashion.

lotus bee pollens；essential oil；chemical constituents；antimicrobial activity；metal chelating ability

TS201.2

A

1002-0306（2015）12-0083-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.009

2014－11－13

畢淑峰（1975-），男，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金（21302004）；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（AH201310375043）。