帕爾哈提·買買提依明，令狐晨，朱青梅，阿依吐倫·斯馬義*

(1.阿克蘇地區(qū)庫車縣人民醫(yī)院，新疆阿克蘇842000;2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊830011)

雪菊又名“血菊”，為菊科金雞菊屬(Coreopsis)植物，是目前新疆與雪蓮齊名的野生植物［1］。雪菊具有降血壓、降血脂、抗衰老、抗癌、抗炎等生物活性［2］。國內(nèi)關(guān)于雪菊的體外抗腫瘤并未報(bào)道，國外的報(bào)道僅限于雪菊的單體對(duì)小鼠皮膚腫瘤抑制作用［3］。癌癥儼然成為危害了人類健康的頭號(hào)殺手。由于主流的治療癌癥的方法存在諸多缺陷，世界科學(xué)家開始把抗腫瘤藥物研究的目光轉(zhuǎn)移到天然產(chǎn)物上，一些具有抗腫瘤作用的天然活性成分陸續(xù)從中草藥中被分離發(fā)現(xiàn)［4］。筆者在此體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞(7404)及人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)，用不同濃度的雪菊總黃酮純化物、粗提物及總多糖分別對(duì)細(xì)胞作用后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞的凋亡率，探討雪菊總黃酮和總多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖的抑制作用，為雪菊的藥理活性深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);Benchmark PLUS型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國BIORAD公司);流式細(xì)胞儀(美國BECKMAN公司);倒置熒光三目顯微鏡(美國Cool-SNAP);ZHJH-1214C型超凈工作臺(tái)(中國上海智城有限公司);TP114型電子天平(美國丹佛公司);Br4i型低溫離心機(jī)(美國Jouan公司)。

1.1.2 試劑。胚胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)141012);二甲基亞砜(美國MP Biomedicals公司，批號(hào) M5178);培養(yǎng)基(美國 HyClone公司，批號(hào)AZG190856);噻唑藍(lán)MTT(美國sigma公司，批號(hào)M5655);凋亡檢測(cè)試劑盒(美國BD公司，批號(hào)3337788);胰酶(美國Gibco公司，批號(hào)25200)。

1.1.3 腫瘤細(xì)胞。人肝癌細(xì)胞(7404)和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)由新疆第一附屬醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所阿爾孜古麗·吐爾遜老師惠贈(zèng)。

1.1.4 藥材。昆侖雪菊為菊科金雞菊屬(Coreopsis)植物，于2013年6～9月在新疆和田地區(qū)昆侖山采集，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)/生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定為菊科金雞菊品種。

1.1.4.1 昆侖雪菊總黃酮提取物。雪菊于60℃干燥1 h，研磨，過三號(hào)篩，備用。稱取雪菊適量，按1∶20投料比加50%乙醇40 ml，浸泡1 h，利用超聲微波協(xié)同萃取儀萃取30 min，過濾，濾液減壓濃縮得其浸膏，測(cè)定總黃酮含量為22.56%。

1.1.4.2 總黃酮純化物。由雪菊總黃酮粗提物經(jīng)聚酰胺純化工藝獲得，總黃酮含量為68.04%。

1.1.4.3 昆侖雪菊總多糖。雪菊于60℃干燥1 h研磨，過三號(hào)篩，備用。稱取雪菊適量，1∶20投料比，加40 ml蒸餾水，浸泡1 h，利用超聲微波協(xié)同萃取儀，超聲30 min，過濾，濾液減壓濃縮得其浸膏，測(cè)定總多糖含量為24.74%。

1.2 方法

1.2.1 供試液的制備。精密稱定雪菊總黃酮粗提取物、純化物及總多糖浸膏各0.1 g，用二甲基亞砜(DMSO)溶解于10 ml容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為5 g/L的3種供試液，4℃冰箱保存，臨用前用培養(yǎng)液稀釋分別配制成不同濃度的3種供試液，并保證各供試液中 DMSO的體積分?jǐn)?shù)＜0.1%。

1.2.2 MTT法測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，調(diào)整7404和A549細(xì)胞懸浮液密度為3×104個(gè)/ml，將配制好的細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察其貼壁情況，貼壁狀況良好后，將每孔的培養(yǎng)液輕輕取出，將雪菊總黃酮純化物、粗提物及總多糖3個(gè)試驗(yàn)組分別加入最終濃度為50、100、200、400、600 μg/ml提取物的培養(yǎng)液 200 μl，空白對(duì)照組則加入等體積溶劑的培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組則為濃度為20 μg/ml的順鉑，每組4個(gè)孔，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng) 48、72、96 h，培養(yǎng)結(jié)束前 4 h，每孔加 MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，然后每孔加DMSO 150 μl，振蕩混勻后，用Benchmark PLUS型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值，并按公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，生長(zhǎng)抑制率=(1-試驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%［5］。

1.2.3 檢測(cè)細(xì)胞凋亡。取7404和A549的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，觀察其貼壁狀況，狀態(tài)良好時(shí)，分別加入100、200、400 μg/ml不同濃度的雪菊總黃酮純化物，并設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組(不加藥物)，再置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng)，把各孔的細(xì)胞培養(yǎng)液分別吸到15 ml離心管中，PBS洗滌貼壁細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞消化下來，加完全培養(yǎng)液終止后，收集并放入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 ml PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取含有2×105個(gè)細(xì)胞懸浮液，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入100 μl緩沖液，分別加入5 μl Annexin V-FITC 和 PI，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，再加入400 μl的緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT法檢測(cè)雪菊不同提取物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用 用濃度分別為 50、100、200、400、600 μg/ml的雪菊不同提取物的溶液作用于人肝癌細(xì)胞7404，72 h后，觀察不同濃度的樣品對(duì)7404細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)，雪菊總黃酮粗提取物、純化物及雪菊總多糖對(duì)7404細(xì)胞增殖均有抑制作用，其IC50分別為 261.58、52.27、531.21 μg/ml，且抑制率均隨樣品濃度的增大而增大，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，各濃度組與對(duì)照組比較，有顯著性差異(P＜0.01)。通過各提取物的IC50比較，得出雪菊總黃酮純化物比雪菊黃酮粗提取物及其總多糖對(duì)細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)。

表1 雪菊物不同濃度提取物對(duì)7404細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

用濃度分別為 50、100、200、400、600 μg/ml的雪菊不同提取物的溶液作用于人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，觀察不同濃度的樣品對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，雪菊總黃酮粗提取物、總黃酮純化物及總多糖對(duì)A549細(xì)胞增殖均有抑制作用，其IC50分別為 230.45、93.62、454.29 μg/ml，且抑制率均隨樣品濃度的增大而增大，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，各濃度組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。通過各提取物的IC50比較，得出雪菊總黃酮純化物比黃酮粗提取物及其總多糖對(duì)細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)。

表2 雪菊物不同濃度提取物對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 MTT法檢測(cè)相同濃度下雪菊不同提取物對(duì)細(xì)胞作用時(shí)間與抑制率的關(guān)系 從雪菊不同提取物濃度為200 μg/ml時(shí)不同提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞(7404)和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)隨時(shí)間增長(zhǎng)的關(guān)系圖(圖1)可以看出，樣品濃度固定時(shí)，隨著樣品作用時(shí)間的增加，雪菊總黃酮粗提物、純化物及總多糖對(duì)各腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)雪菊總黃酮純化物對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞儀Annexin V-PI雙標(biāo)法進(jìn)行凋亡率的測(cè)定，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，100、200、400 μg/ml的雪菊總黃酮純化物作用7404、A549細(xì)胞72 h后，隨樣品濃度加大，活細(xì)胞比例逐漸減少，細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯增高。

圖1 雪菊不同提取物對(duì)7404(a)和A549(b)細(xì)胞作用時(shí)間與抑制率的關(guān)系

表3 雪菊總黃酮純化物對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

3 結(jié)論

惡性腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病之一。在惡性腫瘤的三大療法中，藥物治療占有重要的地位。合成的化學(xué)類抗腫瘤藥物中絕大多數(shù)都是以天然抗腫瘤活性成分為先導(dǎo)化合物的。我國有豐富的天然藥用動(dòng)物、植物和礦物資源，自20世紀(jì)60年代以來，我國的醫(yī)藥專家根據(jù)各民族運(yùn)用天然抗腫瘤藥物的經(jīng)驗(yàn)，從民族醫(yī)藥中研究和開發(fā)出了一批療效確切、價(jià)格合理的天然抗腫瘤藥物。黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分，具有抗菌抗病毒活性、抗炎、抗腫瘤活性等。因此該試驗(yàn)所研究的雪菊總黃酮的抗腫瘤活性為雪菊藥理活性的研究奠定基礎(chǔ)。

MTT法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，靈敏度高、簡(jiǎn)便快速，最常用于體外抗腫瘤藥物篩選的方法。該試驗(yàn)采用MTT法對(duì)雪菊總黃酮粗提取物、總黃酮純化物及總多糖進(jìn)行體外抗腫瘤活性進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，雪菊總黃酮粗提物、總黃酮純化物及總多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞(7404)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)有一定的抑制作用，其中雪菊總黃酮純化物對(duì)2種腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，從而進(jìn)行雪菊總黃酮純化物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡試驗(yàn)，流式細(xì)胞儀Annexin V-PI雙標(biāo)法測(cè)定凋亡率表明，隨樣品濃度加大，活細(xì)胞比例逐漸減少，細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯增高。

綜上所述，雪菊總黃酮粗提物、純化物及總多糖能抑制7404、A549細(xì)胞的增殖，呈劑量與時(shí)間依賴性，總黃酮純化物抑制作用尤為明顯，其抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。但雪菊總黃酮純化物作為一種天然提取物，其成分復(fù)雜，對(duì)于是否還存在其他途徑，有待進(jìn)一步的探討。

［1］張彥麗，王艷，李新霞，等.高效液相色譜法測(cè)定昆侖雪菊中綠原酸和黃芩苷的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(4):107-109.

［2］李冬明.昆侖雪菊的藥學(xué)研究進(jìn)展［J］.浙江中醫(yī)雜志，2012，47(10):776-777.

［3］YASUKAWA K，AKIHISA T，KASAHARA Y，et al.Inhibitory effect of heliantriol C:a component of edible Chrysanthemum，on tumor promotion by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin［J］.Phytomedicine，1998，5(3):215-218.

［4］杜崇民，劉春宇.黃酮類化合物抗腫瘤研究進(jìn)展［J］.中國野生植物資源，2007，26(3):3-5.

［5］王天山，陸躍鳴，馬國祥，等.鼓槌石斛中化學(xué)成分對(duì)K562腫瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制作用體外實(shí)驗(yàn)［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1997，9(2):1-3.