董永軍，王麗榮，徐銀蘭，賀會(huì)利，趙俊江，孟偉杰

（1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

副豬嗜血桿菌分離株的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

董永軍1，2，王麗榮1，2，徐銀蘭1，賀會(huì)利1，趙俊江1，孟偉杰1

（1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌（Hps）引起的一種細(xì)菌性傳染病.從疑似發(fā)生副豬嗜血桿菌病的河南新鄉(xiāng)某豬場采集病豬呼吸道分泌物和心包積液，并對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)鑒定和動(dòng)物試驗(yàn)。結(jié)果表明，該試驗(yàn)成功分離到了副豬嗜血桿菌，藥敏試驗(yàn)顯示，分離菌株對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和頭抱哌酮高敏，對(duì)復(fù)方新諾明中敏，對(duì)青霉素、鏈霉素、林可霉素耐藥；對(duì)金銀花及其組成的復(fù)方敏感，且復(fù)方作用效果優(yōu)于單方。

副豬嗜血桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)；豬

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是存在于豬上呼吸道的一種常在菌，在特定條件下可以侵入機(jī)體引起以呼吸道癥狀為主的全身性疾病，即副豬嗜血桿菌病，又稱革拉瑟氏病［1-2］。

副豬嗜血桿菌屬革蘭氏染色陰性的細(xì)小桿菌，具有多種不同的形態(tài)，顯微鏡下可見呈球桿狀、長桿狀與長絲狀菌體，無鞭毛、無芽抱，有莢膜，兼性厭氧［3-5］。

目前，副豬嗜血桿菌病已嚴(yán)重危害到養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，分離鑒定副豬嗜血桿菌并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)意義重大，對(duì)該病的預(yù)防、控制有著非常重要的作用［6-8］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料 從疑似發(fā)生副豬嗜血桿菌病的河南省新鄉(xiāng)市某豬場采集發(fā)病豬的呼吸道分泌物、心包積液。

1.1.2 試劑 葡萄糖、半乳糖、蔗糖、脈酶等生化微量鑒定管；營養(yǎng)瓊脂，煙酰胺腺嘌吟二核苷酸（NAD或V因子），金黃色葡萄球菌；生化試驗(yàn)試劑：脈酶、氧化酶、接觸酶、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖和核糖等。

1.1.3 培養(yǎng)基 兔鮮血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板、TSB培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)室按常規(guī)

方法制備。

1.1.4 中藥 板藍(lán)根、大青葉、金銀花、貫眾、魚腥草、野菊花、黃答、連翹。復(fù)方①黃答、金銀花、連翹。復(fù)方②大青葉、魚腥草、貫眾。

1.1.5 西藥 環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭抱哌酮、復(fù)方新諾明、林可霉素、諾氟沙星、青霉素、鏈霉素及慶大霉素藥敏片（河南科技學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室制備）。

1.2 病原菌分離及鑒定

1.2.1 病原菌分離 無菌條件下，用接種環(huán)挑取疑似患豬呼吸道分泌物或心包積液，劃線接種于巧克力瓊脂平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板，置5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)基，挑取疑似副豬嗜血桿菌單個(gè)菌落，進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.2 涂片鏡檢 挑取上述純培養(yǎng)疑似副豬嗜血桿菌單個(gè)菌落，分別涂片、革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)及染色結(jié)果。

1.2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象檢查 無菌條件下，挑取副豬嗜血桿菌疑似菌落，水平劃線于未添加NAD的兔鮮血瓊脂平板，再挑取金黃色葡萄球菌垂直水平劃線接種于平板，置5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后，觀察細(xì)菌生長情況，是否有衛(wèi)星生長現(xiàn)象及溶血現(xiàn)象。

1.2.4 生化試驗(yàn) 挑取具有衛(wèi)星生長現(xiàn)象且不溶血的單個(gè)菌落純培養(yǎng)后接種于添加NAD的含葡萄糖、半乳糖、蔗糖、脈酶等生化微量鑒定管中，置5% CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后，觀察生化反應(yīng)和糖發(fā)酵活性結(jié)果，同時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和接觸酶試驗(yàn)，觀察結(jié)果。

1.2.5 動(dòng)物試驗(yàn) 將疑似副豬嗜血桿菌的平板上菌落用滅菌生理鹽水洗下，經(jīng)二次離心沉淀洗滌后懸浮于3 ml生理鹽水中，各取0.4 m L靜脈接種于3頭哺乳仔豬體內(nèi)，觀察其表現(xiàn)，死后解剖采集呼吸道分泌物，進(jìn)行二次分離鑒定。

1.3 藥敏試驗(yàn)

1.3.1 中藥 按傳統(tǒng)水煎法煎煮，真空抽濾及濃縮，最后濃縮為1 g/mL生藥，置-20℃保存。濾紙打孔直徑為6 mm，121℃高壓滅菌，將紙片放入藥液中浸泡2 h，置37℃烘干，于-20℃保存?zhèn)溆谩⒋_診的副豬嗜血桿菌菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，在超凈臺(tái)中利用滅菌棉簽從TSB中蘸取少量均勻涂布于添加有NAD的兔鮮血瓊脂平板上，稍干后，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別貼于平板上，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察測定抑菌圈直徑。

1.3.2 西藥 將確診的副豬嗜血桿菌菌落接種于TSB培養(yǎng)基，在超凈臺(tái)中利用滅菌棉簽從TSB中蘸取少量均勻涂布于添加有NAD的兔鮮血瓊脂平板上，稍干后，用無菌鑷子將藥敏紙片分別貼于平板上，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察測定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果 將呼吸道分泌物或心包積液分別接種于巧克力瓊脂平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)48 h后，通過實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果如下。

普通營養(yǎng)瓊脂平板上無菌落生長；巧克力瓊脂平板上生長有邊緣整齊、小而透明菌落。

2.2 涂片鏡檢結(jié)果 采集疑似副豬嗜血桿菌單個(gè)菌落抹片、革蘭氏染色后顯微鏡觀察，可見大小不等，短小桿狀、球桿狀、絲狀等多種不同形態(tài)細(xì)菌，革蘭氏染色陰性。

通過細(xì)菌分離培養(yǎng)與形態(tài)、革蘭氏染色觀察，初步判定該細(xì)菌為副豬嗜血桿菌，確診需進(jìn)一步進(jìn)行生化試驗(yàn)。

2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象檢查結(jié)果 通過實(shí)驗(yàn)觀察：在金黃色葡萄球菌周圍可見生長有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落，離金黃色葡萄球菌愈近菌落生長越好，愈遠(yuǎn)菌落越小，呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”，同時(shí)未見溶血現(xiàn)象；未接種金黃色葡萄球菌的另一平板則未見菌落生長。

2.4 生化試驗(yàn)結(jié)果 詳見表1。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、革蘭氏陰性、衛(wèi)星生長現(xiàn)象、不溶血現(xiàn)象，結(jié)合生化試驗(yàn)結(jié)果可以確診，分離細(xì)菌符合副豬嗜血桿菌的生物學(xué)特性。

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)靜脈接種的3頭供試哺乳仔豬均出現(xiàn)精神沉郁，食欲減退，體溫升高至40.5℃～42℃，咳嗽，呼吸困難，皮膚發(fā)紅，皮膚黏膜發(fā)紺，腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)腫脹、跛行、站立困難，疼痛。死前共濟(jì)失調(diào)、抽搐、四肢呈劃水狀。

病理剖檢可見心包積液，呼吸道內(nèi)有大量分泌物。采集分泌物按上述方法進(jìn)行第二次細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果一致，確診該細(xì)菌為副豬嗜血桿菌。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 中藥 37℃培養(yǎng)24 h后，測定藥敏紙片抑菌圈大小，結(jié)果詳見表2。

單味中藥金銀花、魚腥草、野菊花、板藍(lán)根抑菌作用良好，尤以金銀花效果較優(yōu)；2種復(fù)方均有抑菌作用，尤以復(fù)方1最優(yōu)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，金銀花及其復(fù)方對(duì)副豬嗜血桿菌的抑菌作用明顯。黃答、連翹對(duì)副豬嗜血桿菌無明顯抑菌作用，但與金銀花組方效果優(yōu)于單方金銀花，可能與組方各種中藥相須協(xié)同作用有關(guān)。

表2 中藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6.2 西藥 結(jié)果詳見表3。

結(jié)果顯示，慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和頭抱哌酮高敏；復(fù)方新諾明中敏，青霉素、鏈霉素、林可霉素耐藥。

表3 副豬嗜血桿菌西藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Hps血清型較多，目前報(bào)道有15種，不同菌株對(duì)同一種抗生素的敏感性存在很大差異，臨床治療應(yīng)結(jié)合分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，科學(xué)用藥。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過對(duì)疑似發(fā)病豬場采集患豬病料，并進(jìn)行病原菌分離鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)，鑒定為副豬嗜血桿菌。

通過藥敏試驗(yàn)，確診分離菌對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和頭抱哌酮高敏，復(fù)方新諾明中敏，青霉素、鏈霉素、林可霉素耐藥；對(duì)金銀花及其組成的復(fù)方敏感，且復(fù)方作用效果優(yōu)于單方［9］。

副豬嗜血桿菌病臨床治療上中藥建議使用金銀花及其組成復(fù)方，西藥建議使用慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和頭抱哌酮。

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S858.28

A

1005-7307（2015）01-0001-003

2014-12-05

新鄉(xiāng)市重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（ZG13009）；河南科技學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2013CX046）

董永軍，男，碩士，講師，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)的教學(xué)科研工作。