尚延麗，馮霞，靳野，張曉霞，張柳，馬軍武

(中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/國家口蹄疫參考實驗室，甘肅蘭州730046)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒引發(fā)的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，其嚴重危害畜牧業(yè)的發(fā)展和國家的經(jīng)濟貿(mào)易。在我國，口蹄疫的防制主要依賴于以強制免疫為主的綜合免疫措施，但目前使用的滅活疫苗［1］存在著許多缺點，研究、開發(fā)安全、高效的新型疫苗［2-3］是大勢所趨，而表位肽疫苗正是其研究熱點之一。表位肽疫苗是指同時含有多個目標抗原表位和相應的輔助性表位的一種新型疫苗?？乖砦皇侵缚乖肿颖砻嫔嫌刑厥饨Y構與免疫活性的化學基團，它代表抗原分子的一個免疫活性區(qū)，是能夠刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞并且能夠被其識別的部位。免疫細胞不是對完整的抗原分子進行識別，而是僅識別抗原肽上的表位?？乖砦话凑张c不同的抗原受體細胞結合，可分為B細胞抗原表位與 T細胞抗原表位，而T細胞表位可分為CTL表位和輔助性Th表位。

傳統(tǒng)的表位篩選方法(如合成肽庫法、步移重疊多肽法、酸洗脫法等)工作量大、試驗成本高、試驗周期長，也可能遺漏一些細胞表位。目前，細胞表位篩選方法主要是采用計算機預測軟件預測與實驗法鑒定相結合來篩選細胞表位。計算機表位預測是在已知抗原蛋白結構的基礎上或者已知氨基酸序列的基礎上根據(jù)氨基酸的理化數(shù)據(jù)特質(zhì)或者肽片段與MHC分子結合、TAP轉運過程、蛋白酶體裂解等抗原遞呈過程的規(guī)律，將它們編入計算機的算法中，然后用計算機軟件來預測可能含有表位的區(qū)域。筆者通過多種計算機表位預測軟件預測口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株結構蛋白VP1上可能的CTL T細胞表位，綜合分析各軟件的預測結果，篩選出最有可能T細胞表位的候選表位，旨在為鑒定口蹄疫病毒CTL細胞表位、研發(fā)表位肽疫苗提供數(shù)據(jù)和基礎。

1 材料與方法

1.1 FMDV A/GDMM/CHA/2013株結構蛋白 VP1的核苷酸和氨基酸序列 從GenBank中查詢到FMDV A/GDMM/2013株結構蛋白VP1的序列，并與國內(nèi)外口蹄疫參考毒株進行比較分析。

1.2 CTL T細胞表位預測 應用Syfpeithi、IEDB、NetMHC-3.2、IMTECH和BIMAS等多種生物信息學軟件預測FMDV A/GDMM/2013株結構蛋白VP1上的T細胞表位(表1)。將FMDV A/GDMM/2013 VP1的氨基酸序列輸入各個網(wǎng)站，分別預測了其H-2Dd、H-2Kd、H-2Ld限制性T細胞表位。候選表位氨基酸長度參數(shù)為9 mer。選取在各預測軟件上分值在前10位，并且在其他軟件前10位重復率高的肽段做為候選表位。

表1 試驗所用的CTL表位預測軟件

1.3 候選表位穩(wěn)定性預測 使用在線分析軟件ProtParam，分析候選表位的理化性質(zhì)及其穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 VP1基因序列分析 FMDV A/GDMM/2013株結構蛋白VP1基因(KF450794.1)全長636個核苷酸，編碼212個氨基酸(圖1～2)。通過GenBank同源性比對發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV A/GDMM/CHA/2013株結構蛋白 VP1基因與A/HuBWH/CHA/2009 VP1 protein(VP1)gene(JF792355.1)同源性為91%，與 A/VIT/11/2004 VP1(1D)gene(HQ116363.1)、A/TAI/7/2003 VP1(1D)gene(HQ116312.1)、/MAY/3/2003 VP1(1D)gene(HQ116297.1)同源性為94%。

2.2 VP1蛋白CTL細胞表位預測 將FMDV A/GDMM//CHA/2013結構蛋白VP1蛋白序列輸入到預測軟件，選好MHC的類型及候選表位的長度。每個軟件均選取排名的前10位，然后在每個軟件、每種MHC類型的前10中交叉比較選擇排名靠前且重復率高的10個肽段為候選CTL表位(表2～3)。

表2 預測軟件預測的VP1蛋白的CTL表位氨基酸序列

表3 篩選出的候選表位在各個軟件中的排名

2.3 候選表位穩(wěn)定性預測 采用在線分析軟件ProtParam，分析篩選出的10條候選表位。由表4可知，pK1、pK4、pD2、pD4和pD5的不穩(wěn)定指數(shù)分別為44.00、68.57、42.26、51.69和43.31。這5個表位不穩(wěn)定指數(shù)較高，穩(wěn)定性差，可能不是CTL表位。

表4 ProtParam分析結果

3 討論與結論

CTL細胞表面的TCR能夠識別細胞表面展示出的MHC-I-抗原肽(CTL細胞表位)復合物，并與之結合，然后殺傷靶細胞。CTL在抗腫瘤和抗病毒感染的免疫反應中發(fā)揮著重要的作用。當內(nèi)源性抗原通過MHCⅠ類分子展示于細胞表面后，被CD8T細胞受體識別，在共刺激因子作用下CD8T被活化、增殖產(chǎn)生細胞毒T細胞(CTL)。CTL具有強大的殺傷靶細胞的能力。CTL通過殺傷介質(zhì)(Perforin、Granayme、Fasl、TRAIL、TNF、IFN-γ 等)來殺傷靶細胞。CTL 在發(fā)揮效應時(識別靶細胞和攻擊靶細胞)受MHCⅠ類分子的限制，即CTL只殺傷自身MHC遞呈抗原的靶細胞。由于抗體只能直接結合體液中的抗原，不能通過細胞膜進入細胞內(nèi)殺傷病原，因此細胞免疫對清除病毒和胞內(nèi)寄生菌十分重要，CTL通過殺傷靶細胞破壞胞內(nèi)病原賴以生存的環(huán)境，在抗體和吞噬細胞的配合下將病原徹底清除。MHC-Ⅰ類分子僅識別和結合內(nèi)源性抗原表位，而CTL發(fā)揮效應時受MHC-Ⅰ的限制，因此僅由MHC-Ⅰ類分子轉運的抗原表位才能夠誘發(fā)CTL效應，這類抗原表位就是CTL表位。

研究表明，自然宿主抗口蹄疫病毒感染的能力與高水平的中和抗體水平有重要相關性。此外，中和抗體的產(chǎn)生離不開Th細胞的輔助作用，因此以前對口蹄疫病毒抗原表位的研究主要是針對B細胞表位和Th細胞表位。但是，有研究表明細胞免疫在FMDV免疫應答中也扮演著非常重要的角色［4-7］。因此，研究口蹄疫病毒的CTL表位具有重要意義，進一步充實了口蹄疫病毒表位數(shù)據(jù)庫資料，也為深入了解細胞介導的抗口蹄疫病毒免疫鋪墊了基礎。

該研究的口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株是2013年從我國廣東省茂名市分離的豬源毒，由國家參考實驗室保存。該毒株屬于A型ASIA拓撲性(東南亞)-97毒株，其基因與A/HuBWH/CHA/2009(JF792355)同源性小于91.5%，其基因與我國歷史毒株AF/72的同源性小于81.6%，而其基因與2004年越南毒株A/VIT/11/2004大于93.7%。這表明它同我國歷史毒株AF/72無直接遺傳衍化關系，考慮到時間因素，其與2009年流行毒株A/HuB/WH/09應該也無直接遺傳衍化關系，很可能是由境外傳入。初步推測，我國現(xiàn)有疫苗可能對該毒株保護力有限。因此，研究該毒株的細胞表位、發(fā)展相應疫苗具有重要意義。

該研究采用多種在線表位預測軟件來預測CTL表位。其中，BIMAS［8］和 SYFPEITHI正是采用矩陣方法開發(fā)的。IEDB中，MHC-I類結合預測工具則是綜合了ANNS(人工神經(jīng)網(wǎng)絡)［9-12］、SMM(穩(wěn)定矩陣法)［13］、AMMPMBEC(肽段-MHC結合能力與穩(wěn)定矩陣法)［14］、CombLib(組合庫矩陣法)［15］、Consensus(共 識 表 位 預 測 方 法)［16］、NeMHC-pan［17-18］、PickPocket(結合槽選擇法)［19］、NetMHCcons(肽段-MHC結合預測綜合算法)［20］等多種肽段結合預測方法，而NetMHC-3.2則是結合了人工神經(jīng)網(wǎng)絡和權重矩陣2種方法。計算機表位預測在CTL抗原表位預測方面取得了很多成果。Gao等使用SYFPEITHI和GENETXY軟件預測O型FMDV結構蛋白VP1上表位，然后將預測的候選表位同重組、表達SLA-2-(G4S)3-β2m蛋白復合體結合，分析候選表位同SLA-2-(G4S)3-β2m蛋白復合體的結合能力，結果表明表位26–34(RRQHTDVSF)和157-165(RTLPTSFNY)為FMDV CTL表位［21］。Barfoed等用SYFPEITHI和BIMAS軟件預測候選表位，然后構建了可表達2C蛋白和預測出的候選表位的質(zhì)粒的DNA疫苗來免疫小鼠，通過胞內(nèi)細胞因子染色法來檢測免疫后小鼠CD8+細胞IFN-γ的合成，結果表明FMDV C-S8c1株2C蛋白上的第63～71位(KYKDAKEWL)是H-2-Kd限制性CTL表位［22］。Liu等利用BIMAS軟件預測FMDV AF/72結構蛋白VP1的H-2d限制性T細胞候選表位，并且化學合成這些候選表位，然后用表達FMDV AF/72結構蛋白VP1免疫小鼠，將分離的免疫后小鼠脾淋巴細胞與候選表位體外共培養(yǎng)，采用T細胞增殖試驗和IFN-ELISPOT試驗進行驗證，結果表明pK1(AYHKGPFTRL)是H-2Kd限制性T細胞表位pD7(GFIMDRFVKI)是H-2Dd限制性T細胞表位［23］。Gao等使用MetMHCpan-2.0和GENETYX預軟件預測的O型FMDV結構蛋白VP1上的T細胞候選表位化學合成后，用脂質(zhì)體包裹來免疫小鼠，并進行T細胞增殖試驗、流式細胞術、IFN-ELISA、CTL試驗、豚鼠免疫保護力試驗及組織病理學觀察，結果表明肽段VP126–34(RRQHTDVSF)和VP157–165(RTLPTSFNY)是O型FMDV的CTL表位，并且用其免疫動物可在一定程度上抵御口蹄疫病毒的攻擊［24］。

但是，計算機預測表位也有諸多局限性，比如預測蛋白構象及表位遞呈過程等都是極其復雜的問題，需要累積大量的試驗數(shù)據(jù)，并且理論預測和實際情況總有一定差距。這就需要將2種或者多種以上的預測方法結合起來，以提高表位預測的準確率。該研究使用了5種預測軟件，結合多種算法，綜合考慮各個軟件的預測結果，最終選出10條候選表位。

CTL表位主要是由8～11個氨基酸殘基構成的線性表位。CTL表位是由內(nèi)源性抗原在胞漿加工產(chǎn)生。內(nèi)源性抗原是在細胞內(nèi)產(chǎn)生和加工的蛋白，主要是細胞自身產(chǎn)生的蛋白、感染病毒或者細菌的細胞內(nèi)產(chǎn)生的非細胞自身的蛋白和腫瘤蛋白等。蛋白酶體處理經(jīng)泛素化后的內(nèi)源性抗原，將其裂解成8～11個左右氨基酸殘基的肽段，再經(jīng)過轉運蛋白(TAP)的作用進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的MHCⅠ類分子上的抗原結合槽結合形成MHCⅠ-抗原肽復合物。然后，通過高爾基體轉運到細胞膜表面，同CD8+T細胞上的TCR識別與結合，從而誘發(fā)CTL效應。因此CTL表位要有一定的穩(wěn)定性，才能保證在整個加工、結合、遞呈和識別過程的順利進行，起到誘發(fā)細胞免疫的效應。因此，采用ProtParam軟件對候選表位進行穩(wěn)定性分析。結果表明，pK1、pK4、pD2、pD4和pD5的不穩(wěn)定指數(shù)較高，分別為 44.00、68.57、42.26、51.69和43.31。因此，這5個候選表位可能不是CTL表位。

動物機體是一個復雜的、受多因素影響的、不斷變化著的環(huán)境。筆者對候選表位所進行預測是在體外根據(jù)已知的細胞表位的各種理化數(shù)據(jù)、氨基酸殘基出現(xiàn)的頻率等多種因素來進行分析，其穩(wěn)定性則是根據(jù)各個氨基酸殘基理化性質(zhì)來分析。因此，預測分析的候選表位可能與實際情況存在差異，還需要進行體內(nèi)外試驗來鑒定。

該研究借助于計算機表位預測軟件和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析軟件來預測和分析口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株結構蛋白VP1上可能存在的H-2d限制性T表位，結果表明有5條候選表位可能是CTL表位，包括H-2Kd限制性表位2條(第27-35、118-126位)、H-2Ld限制性表位1條(第43-51位)，以及H-2Dd限制性表位2條(第45-53、146-154位)。當然，該研究預測的表位還需要體內(nèi)外試驗來驗證。

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