馬小杰，劉文佳，楊振華，申 琳，李彥澆，金 鈁

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室:1.正畸科;2.組織工程中心，陜西西安 710032)

正畸牙移動(dòng)是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，主要依賴于機(jī)械刺激下牙槽骨的改建，而牙槽骨的應(yīng)力改建則是成骨和破骨動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果。已有研究證實(shí)，牙周組織在正畸牙移動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用［1］。

牙周膜干細(xì)胞(peridotal ligament stem cells，PDLSCs)是來(lái)源于牙周組織的干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新和多向分化能力;在體外刺激下可分化為成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，是牙周組織再生與修復(fù)的種子細(xì)胞［2－3］。有研究證實(shí)，在正畸牙移動(dòng)過(guò)程中，牙周膜干細(xì)胞的分布范圍更廣，且數(shù)量明顯增加;提示PDLSCs與正畸牙移動(dòng)過(guò)程中的牙周組織改建密切相關(guān)［4］。

正畸牙移動(dòng)過(guò)程中破骨細(xì)胞性骨吸收是保證牙齒移動(dòng)的關(guān)鍵，因此應(yīng)力作用下破骨細(xì)胞的分化以及PDLSCs與破骨細(xì)胞之間的關(guān)系一直是研究的熱點(diǎn)［5］。已有研究證明，在正畸牙移動(dòng)過(guò)程中，PDLSCs自身成骨能力發(fā)生變化的同時(shí)還可以誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，其中 OPG/RANKL/RANK軸發(fā)揮了重要的作用［6］。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均已證明，OPG和RANKL是破骨細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，OPG作為RANKL的假受體，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合RANKL而抑制破骨細(xì)胞的分化［7］。

力學(xué)刺激是維持細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的重要細(xì)胞外刺激，在骨骼的發(fā)育、形成、改建中起重要作用［8］。在正畸牙移動(dòng)過(guò)程中，PDLSCs可通過(guò)特定的“機(jī)械－生化”信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)力作出反應(yīng)［9］。大量文獻(xiàn)證實(shí)，體外培養(yǎng)的hPDLSCs在各種機(jī)械刺激作用下，其增殖、分化等一系列生物學(xué)特性均會(huì)發(fā)生改變［10－11］。目前已研制出了多種體外細(xì)胞應(yīng)力加載裝置，按其加載性質(zhì)的不同分為:基底形變加載裝置、流體剪切力加載裝置、離心力加載裝置和空氣液體傳導(dǎo)靜壓力加載裝置［12］。

hPDLSCs是正畸牙移動(dòng)的關(guān)鍵因素，并有文獻(xiàn)報(bào)道，hPDLSCs同時(shí)表達(dá)OPG和RANKL;提示hPDLSCs可能通過(guò)OPG/RANKL/RANK發(fā)揮其調(diào)節(jié)骨改建的作用。故本實(shí)驗(yàn)采用體外靜壓力加載裝置模擬壓力側(cè)hPDLSCs的受壓環(huán)境，并從基因和蛋白水平檢測(cè) hPDLSCs受壓后表達(dá)OPG和RANKL的變化，以探討單純壓力環(huán)境對(duì)hPDLSCs骨向分化能力的影響;進(jìn)而為臨床正畸治療提供一定的參考意見。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

α－MEM(Gibco，美國(guó));胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)有限公司);1000 U/mL青霉素、1000 U/mL 鏈霉素(Invitrogen，Cadsbad，美國(guó));胰蛋白酶(Hyclone，美國(guó));谷氨酰胺(GIBCO，美國(guó));β－甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸(Sigma，美國(guó));茜素紅(上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站);ALP染色試劑盒(上海碧云天);ALP活性檢測(cè)試劑盒(南京建成);Teizol Reagent(Lift Technologes，美國(guó));逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT－PCR試劑盒(TaKaRa，日本);二氧化碳恒溫孵箱(Forma，美國(guó));熒光倒置相差顯微鏡和照相系統(tǒng)(OLYMPUS，日本);酶標(biāo)儀(Tecan，奧地利);FACS Aria流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó));超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);低溫高速離心機(jī)(Heraeus，德國(guó));6 孔培養(yǎng)板(Falcon，美國(guó))。

1.2 hPDLSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 hPDLSCs分離培養(yǎng)

選取因正畸減數(shù)而新鮮拔除的人健康第一前磨牙，立即用PBS沖洗潔凈后，用手術(shù)刀片刮取根中1/3牙周膜組織，加入I型膠原酶，37℃下消化30 min，使用含10 mL/L胎牛血清的α－MEM培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心 6 min，加入少量α－MEM吹打混勻后，接種于6孔板內(nèi);在37℃、50 mL/L CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔3～4 d換液，直至有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，并每天用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

原代培養(yǎng)至細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí)采用有限稀釋法分選hPDLSCs，并進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。然后取第一代細(xì)胞，用α－MEM制成細(xì)胞密度為1000/mL的單細(xì)胞懸液后，取1 mL接種于10 mL的培養(yǎng)皿，常規(guī)條件下進(jìn)行培養(yǎng);3～4 d換液，連續(xù)培養(yǎng)14 d后，甲苯胺藍(lán)染色，并計(jì)算其克隆形成率。

1.2.2 hPDLSCs分化能力鑒定

取第3代hPDLSCs以1×105/mL的密度接種于6孔板，常規(guī)條件下培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%時(shí)，更換為成骨誘導(dǎo)液(含10 mmol/L β－甘油磷酸鈉、50 μg/mL 維生素 C、1 ×10－8mol/L 地塞米松、10 mL/L胎牛血清的α－MEM)和成脂誘導(dǎo)液(含0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L 地塞米松、10 mg/L 胰島素、200 μmol/L吲哚美辛、100 mL/L胎牛血清的α－MEM)繼續(xù)培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14 d后，取成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞進(jìn)行ALP染色和茜素紅染色，于誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，取成脂誘導(dǎo)組細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色;然后一并置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.3 壓力對(duì)hPDLSCs表達(dá)OPG和RANKL的影響

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組和壓力刺激

取第4代hPDLSCs以1×106/mL的密度接種于6孔板，常規(guī)條件下培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿孔板底90%時(shí)，按不同加載力值將細(xì)胞隨機(jī)分為0(對(duì)照組)、20、100、200 kPa組。然后將各組細(xì)胞置于壓力加載裝置內(nèi)分別給予相應(yīng)的靜壓力刺激;持續(xù)加壓6 h后，取各組細(xì)胞進(jìn)行以下檢測(cè)。

1.3.2 RT－PCR 檢測(cè) hPDLSCs中 OPG 和 RANKL mRNA的表達(dá)

根據(jù) GenBank中人來(lái)源的 OPG、RANKL和β－actin的基因序列，采用 Primer Premier 5.0 軟件遵循引物設(shè)計(jì)的一般原則篩選上、下游引物(表1)，并由上海生工生物工程公司進(jìn)行引物合成。取不同壓力連續(xù)刺激6 h后的各組細(xì)胞，用Trizol裂解細(xì)胞并提取總RNA;用酶標(biāo)儀對(duì)各組RNA進(jìn)行定量分析后，以相應(yīng)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后以cDNA為模板、β－actin為內(nèi)參，用RT－PCR儀擴(kuò)增各目的基因(總反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明)。最后根據(jù)儀器所測(cè)得的Ct值，采用2－ΔΔCt法計(jì)算出各組 OPG、RANKL mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.3 West－blots 檢測(cè) hPDLSCs OPG 和 RANKL蛋白的表達(dá)

取不同壓力連續(xù)刺激6 h后的各組細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解細(xì)胞(－20℃反復(fù)凍融3次)后分別轉(zhuǎn)移至1.5 mL的 EP管中;超聲清洗3次(每次5～10 s)后，10000 r/min離心15 min取上清，并采用BCA或G250蛋白定量試劑盒測(cè)定其蛋白濃度，按所測(cè)蛋白濃度計(jì)算樣品與Nacl的體積，并將其混合后，再加入1/5的5×loading buffer置于95℃水中煮5 min。配制聚丙烯酰胺凝膠，并取20 μL蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE(十二烷基硫酸鈉一聚)電泳;在冰浴中將細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(轉(zhuǎn)膜電壓為200 mA，2 h)后，用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h;然后分別滴加 OPG、RANKL一抗(1∶500稀釋)，4℃過(guò)夜;TBST洗膜10 min×3次，滴加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶20000)室溫孵育2 h;再次TBST洗膜10 min×3次后，顯色，用蛋白凝膠成像系統(tǒng)分析樣品中OPG、RANKL蛋白的相對(duì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hPDLSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

2.1.1 hPDLSC 形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察可見，原代培養(yǎng)的hPDLSCs呈短梭形或三角形(圖1a);傳代培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁，呈長(zhǎng)梭形散在分布，3 d后細(xì)胞排列成漩渦狀，大小不一，核圓居中(圖1b)。甲苯胺藍(lán)染色可見有細(xì)胞克隆形成，計(jì)算得出hPDLSCs克隆形成率為20.6%(圖 2)。

圖1 hPDLCs原代及傳代培養(yǎng)3 d(倒置相差顯微鏡，×40)

圖2 hPDLSCs甲苯胺藍(lán)染色觀察(倒置相差顯微鏡，×40)

2.1.2 hPDLSCs成骨、成脂分化能力鑒定

hPDLSCs成骨誘導(dǎo)7 d后，ALP染色可見誘導(dǎo)組的染色明顯加深(圖3a);成骨誘導(dǎo)14 d后，茜素紅染色可見誘導(dǎo)組顏色明顯加深，并有礦化結(jié)節(jié)形成(圖3b);成脂誘導(dǎo)21 d后油紅O染色顯示，細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴(圖3c)。

圖3 hPDLSCs成骨、成脂分化能力鑒定(倒置相差顯微鏡，×200)

2.2 靜壓力對(duì)hPDLSCs表達(dá)OPG/RANKL mRNA和蛋白的影響

hPDLSCs經(jīng)不同壓力連續(xù)刺激6 h后，RT－PCR檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，當(dāng)壓力值為20 kPa時(shí)，RANKLmRNA 的表達(dá)量降低(P＜0.05)，但 OPG mRNA的表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)，從而使RANKL/OPG的比值明顯降低(P＜0.05);當(dāng)壓力值為 100 kPa時(shí)，RANKL mRNA的表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)，但OPG mRNA的表達(dá)量降低(P＜0.05)，從而使 RANKL/OPG的比值明顯升高(P＜0.05);當(dāng)壓力值為200 kPa時(shí)，RANKL、OPG mRNA的表達(dá)量均明顯降低(P＜0.05)，其中以RANKL mRNA的下降程度更加明顯，從而使RANKL/OPG的比值明顯降低(P ＜0.05)(圖 4a、b)。

hPDLSCs經(jīng)不同壓力連續(xù)刺激6 h后，Western－blot檢測(cè)顯示:與對(duì)照組相比，RANK蛋白的表達(dá)量在20 kPa時(shí)變化不明顯(P＞0.05)，在100 kPa時(shí)明顯升高(P＜0.05)，在200 kPa時(shí)明顯下降(P＜0.05);而OPG蛋白的表達(dá)量在20 kPa時(shí)明顯升高(P＜0.05)，在100 kPa和200 kPa時(shí)均明顯下降(P＜0.05)，但在200 kPa時(shí)的下降程度不如RANKL明顯(圖4c)。

圖4 不同大小的壓力刺激6 h后各組OPG、RANKL mRNA和蛋白表達(dá)量的比較

3 討論

正畸牙齒移動(dòng)并不是簡(jiǎn)單的機(jī)械移位，而是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。有文獻(xiàn)報(bào)道，牙周膜是連接牙齒與牙槽骨的重要組成部分，在正畸牙移動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用;當(dāng)矯治力作用于牙齒后，壓力側(cè)的牙周膜受壓緊縮，間隙變窄，血流量減少，從而形成缺氧和無(wú)菌性炎癥環(huán)境;此時(shí)牙槽骨表面出現(xiàn)蠶蝕狀吸收陷窩，并啟動(dòng)牙齒移動(dòng)［1，11］。

hPDLSCs作為牙周膜內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞，在正畸牙移動(dòng)過(guò)程中，不僅其自身成骨能力下降，還可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的生成;提示其在牙周組織的自我更新和牙周炎的修復(fù)與再生以及正畸牙移動(dòng)過(guò)程牙槽骨的重塑中發(fā)揮了重要作用［13－14］。

目前已證明，護(hù)骨素OPG是一種參與骨密度調(diào)節(jié)的分泌性蛋白，可通過(guò)與RANKL結(jié)合阻斷RANKL與RANK的結(jié)合，從而使RANK不能活化，并最終抑制破骨細(xì)胞的生成;提示，RANKL和OPG與正畸牙移動(dòng)過(guò)程中破骨細(xì)胞的分化、形成和功能密切相關(guān)［5－7］。Sampson W 等報(bào)道，OPG 和RANKL參與了牙根吸收過(guò)程［15］;Mustafa等也證實(shí)，壓力刺激可使牙周膜細(xì)胞中RANKL的表達(dá)量明顯升高，并可促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成［16］;以上研究結(jié)果提示，OPG/RANKL/RANK軸在骨改建、正畸牙移動(dòng)以及牙根吸收的過(guò)程中均發(fā)揮了重要作用。

本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞液壓加載裝置在體外模擬hPDLSCs的受壓狀況，并從基因和蛋白水平檢測(cè)了不同壓力刺激對(duì)hPDLSCs表達(dá)OPG、RANKL的影響。結(jié)果顯示:持續(xù)加壓 6 h后，當(dāng)壓力值為20 kPa時(shí)，hPDLSCs表達(dá) RANKL無(wú)明顯變化，但OPG的表達(dá)明顯升高;說(shuō)明在此壓力條件下OPG可作為骨保護(hù)素阻止了RANKL與RANK的結(jié)合，從而抑制了破骨細(xì)胞的活化。當(dāng)壓力值為100 kPa時(shí)，hPDLSCs表達(dá)RANKL量明顯升高，而OPG的表達(dá)量變化不明顯，說(shuō)明在此壓力條件下OPG對(duì)破骨細(xì)胞分化成熟的抑制作用減弱，而RANKL則在牙周組織內(nèi)積聚，并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的生成、啟動(dòng)壓力側(cè)骨吸收。當(dāng)壓力值為200 kPa時(shí)，hPDLSCs表達(dá) OPG和 RANKL的量均明顯降低，其中以RANKL的下降程度更為明顯，從而使 RANKL/OPG的比值降低;提示，壓力過(guò)大可能會(huì)造成hPDLSCs的凋亡增多，細(xì)胞功能喪失，從而使骨改建受到抑制。該結(jié)果與正畸“最適力”原則相符，即壓力過(guò)小時(shí)，牙齒移動(dòng)尚不能啟動(dòng)，而壓力過(guò)大則又會(huì)減緩甚至抑制牙齒的移動(dòng);從而可為臨床矯治提供一定的理論基礎(chǔ)和參考。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還與黃生高等的研究結(jié)果一致，但后者只證明了持續(xù)靜壓力作用下RANKL的表達(dá)具有力值依賴性，而未對(duì)OPG的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)［17］。鑒于牙齒移動(dòng)是成骨/破骨的相互協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，我們認(rèn)為同時(shí)觀察RANKL與OPG比值的變化可能更加合理可信。各體外加力實(shí)驗(yàn)研究中RANKL和OPG的表達(dá)略有不同，這可能與加壓方式以及細(xì)胞培養(yǎng)條件不同有關(guān)。此外，由于干細(xì)胞的自我更新及多向分化能力的研究空間還很大，各種機(jī)制相互聯(lián)系，且錯(cuò)綜復(fù)雜，因此關(guān)于力學(xué)因素對(duì)牙周膜干細(xì)胞的骨向分化能力的影響還有待進(jìn)一步研究。

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