張宏柱，黃 萍，劉興容

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院預(yù)防保健/兒童口腔科，四川瀘州646000;2.瀘州醫(yī)學(xué)院口腔頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州646000;3.綿陽(yáng)市中心醫(yī)院口腔科，四川綿陽(yáng)621000)

毒力因子目前被認(rèn)為是變異鏈球菌致齲的主要因素，不同的毒力因子決定不同的致齲機(jī)理。Gasc首次在肺炎鏈球菌(S.pn)中發(fā)現(xiàn)并檢測(cè)到HtrA，它是一種存在于S.pn表面的熱休克誘導(dǎo)的絲氨酸蛋白酶，也可稱為DO或 De蛋白酶［1-2］。HtrA可存在于許多生物體中，如植物、細(xì)菌、人類等，其作用在于幫助躲避高溫、高濃度、高氧等環(huán)境［3-4］，可通過抑制HtrA的活性減低細(xì)菌毒性。HtrA還有水解蛋白的特性，當(dāng)溫度升高時(shí)，蛋白酶活性增強(qiáng)［5］。有研究表明，細(xì)菌的致病過程可能有HtrA的參與，在應(yīng)激條件下，有助于細(xì)菌在高溫、高氧和高滲透壓環(huán)境中生存［6］。對(duì)于錯(cuò)構(gòu)蛋白的降解，此因子也參與其中，并促使蛋白成熟和正常處理功能的發(fā)揮［7-8］。許多細(xì)菌表面都存在HtrA，變異鏈球菌也如此。前期實(shí)驗(yàn)已篩選出兒童口腔變異鏈球菌HtrA高毒力株，發(fā)現(xiàn)其致齲性高于其他臨床分離株［9］，因此可以推測(cè)，細(xì)菌表面的毒力因子HtrA，對(duì)其他毒力因子有調(diào)控作用，是細(xì)菌致病的重要毒力因子之一，對(duì)細(xì)菌的致病起決定性作用。本實(shí)驗(yàn)旨在利用分子微生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建變異鏈球菌高毒力HtrA缺陷株，分析其轉(zhuǎn)化力的變化，探討HtrA與兒童口腔變異鏈球菌致齲性的關(guān)系，為乳牙齲的預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

變異鏈球菌HtrA標(biāo)準(zhǔn)株(四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供);變異鏈球菌HtrA高毒力株(前期課題組篩選完成);變異鏈球菌HtrA高毒力株同源重組質(zhì)粒載體pUChtrKO(由前期課題組構(gòu)建完成);TPY液體培養(yǎng)基、TSA固體培養(yǎng)基、LB-Eymr液體培養(yǎng)基(由本實(shí)驗(yàn)室按照配方自行配制)、紅霉素，氨芐青霉素粉劑(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司);PCR試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA分子量Marker DL2100、MarkerDL1600、PstI、KpnI、BamhI、EcoRI 限制性內(nèi)切酶、Tenar細(xì)菌DNA提取試劑盒(北京鼎國(guó)生物有限責(zé)任公司);引物 HtrAUR(Bam)、HtrAUF(pst)、HtrADF(KPn)、HtrADR(Eeo)、紅霉素基因抗性引物P1/P2(北京博奧森生物技術(shù)公司);電泳儀及水平電泳槽(鄭州博邦科貿(mào)有限公司);PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(Labnet公司，美國(guó));光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 高毒力變異鏈球菌HtrA缺陷株的構(gòu)建

1.2.1 感受態(tài)變異鏈球菌細(xì)胞的制備

從-70℃冰箱中取出乳牙變異鏈球菌HtrA高毒力株，復(fù)蘇，接種于TSA固體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)48 h，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化鑒定為變異鏈球菌后轉(zhuǎn)接到TPY液體培養(yǎng)基中;厭氧培養(yǎng)增菌24 h，取0.5 mL菌液加入到10 mL液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD650nm=0.65時(shí)，將液體培養(yǎng)基移入離心管內(nèi)置于冰上15 min，4℃ 3 500 r/min離心15 min，棄上清;15 mL 0.06 mol/L CaCl2溶液輕輕沖洗使菌細(xì)胞懸浮后，置于冰上20 min，4℃ 3 500 r/min離心15 min，棄上清;加入6 mL含200 g/L甘油的0.06 mol/L CaCl2溶液使菌細(xì)胞上浮，置冰上10 min即成為感受態(tài)細(xì)胞懸液，分裝成200 μL/份，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入變異鏈球菌細(xì)胞

從-70℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞懸液200 μL，室溫下解凍后置于冰上;加入含有重組質(zhì)粒 DNA 的PBS溶液(重量 ＜60 ng，體積 ＜15 μL)，緩慢搖勻后將其置于冰上40 min;37℃的水浴中迅速升溫5 min后置于冰上5～10 min，向試劑管中加入TPY液體培養(yǎng)基1.0 mL，充分混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1.5 h，使細(xì)菌恢復(fù)到正常的生長(zhǎng)狀態(tài);充分混勻菌液后，取 100 μL涂布在固體培養(yǎng)基TSA-Eymr的平板上，平板的正面朝上放置30 min，待培養(yǎng)基把菌液完全吸收，倒置培養(yǎng)皿37℃厭氧培養(yǎng)48 h，即為已轉(zhuǎn)化的變異鏈球菌HtrA高毒力株。

1.2.3 已轉(zhuǎn)化變異鏈球菌的鑒定

將已轉(zhuǎn)化的高毒力變異鏈球菌菌株劃線接種于含20 μg/mL紅霉素的TSA平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h;取單個(gè)菌落接種至10 mL含20 μg/mL Eymr的TPY液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)，待OD650nm=0.65后取l.0 mL再次接種到10 mL含20 μg/mL Eymr的TPY液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng) 48 h;取20 μL 轉(zhuǎn)種到10 mL 含20 μg/mL Eymr的TPY液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，重復(fù)此步驟1次;使用TPY液體培養(yǎng)基倍比稀釋上述培養(yǎng)物至 10-6，取 100 μL稀釋液均勻涂布在含20 μg/mL紅霉素的TSA平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h;取菌落涂片革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的變異鏈球菌。

1.3 高毒力變異鏈球菌HtrA缺陷株的鑒定

將HtrA缺陷株接種于TPY Eymr液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，革蘭氏染色涂片行形態(tài)學(xué)鑒定。使用BiosPin細(xì)菌基因DNA提取試劑盒將缺陷株基因組DNA提取出來，以高毒力株HtrA基因序列設(shè)計(jì)引物:HtrF5-AGCGTCAAGTTGGAC-3和HtrR5-CCGAAGTCCAATTAGC-3，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增片段大小為500 bp的HtrA基因。以HtrA缺陷株基因組DNA為模板，分別對(duì)紅霉素基因抗性引物Pl、HtrA基因編碼序列引物HtrF/HtrR、紅霉素基因抗性引物合并HtrA基因上游序列P1/HtrSUF及紅霉素基因抗性引物合并HtrA基因下游序列P2/HtrSDR、含有HtrA基因片段的變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以含有HtrA基因片段的變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株DNA作為對(duì)照。以上基因序列的PCR反應(yīng)條件均為:93℃變性5 min，經(jīng)過93℃ 60 s、54℃ 60 s、72℃ 60 s，30個(gè)往復(fù)循環(huán)后，72℃延伸7 min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物置于10 g/L的瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳，在凝膠成像分析系統(tǒng)下成像并觀察結(jié)果。

1.4 高毒力變異鏈球菌HtrA缺陷株轉(zhuǎn)化力的研究

分別將HtrA高毒力株和缺陷株從-70℃冰箱中取出、復(fù)蘇，接種至含20 μg/mL紅霉素的TSA平板上;37℃厭氧培養(yǎng)48 h后，取單個(gè)菌落將其接種于10 mL含20 μg/mL Eymr的TPY液體培養(yǎng)基中;37℃厭氧培養(yǎng)至OD650=0.65后，吸取l.0 mL菌液轉(zhuǎn)種到10 mL含20 μg/mL Eymr的TPY液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h;吸取20 μL菌液轉(zhuǎn)移接種到10 mL含20 μg/mL Eymr的TPY液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，重復(fù)此步驟1次，通過TPY培養(yǎng)基倍比稀釋使培養(yǎng)物達(dá)到10-6。將100 μL菌液稀釋液均勻涂布在含20 ng/mL紅霉素的TSA平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)，以5次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值來表示二者的轉(zhuǎn)化力。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法對(duì)同一時(shí)間段變異鏈球菌HtrA高毒力株和HtrA缺陷株轉(zhuǎn)化力的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 高毒力變異鏈球菌HtrA缺陷株的形態(tài)學(xué)和生化鑒定結(jié)果

涂片、革蘭氏染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察菌株為革蘭氏染色陽(yáng)性，高毒力株的菌體呈長(zhǎng)鏈狀排列且相互纏繞，局部呈團(tuán)塊狀，而缺陷株菌體多呈短鏈狀排列，可見游離的單個(gè)菌體(圖1～2)。常規(guī)生化鑒定，可發(fā)酵甘露醇、山梨醇、棉子糖、密二糖，水解七葉苷，但不水解精氨酸，證實(shí)該菌株為變異鏈球菌血清C型(圖3)。

圖1 變異鏈球菌HtrA高毒力株(×100)

圖2 高毒力變異鏈球菌HtrA缺陷株(×100)

圖3 變異鏈球菌的生化鑒定結(jié)果

2.2 高毒力變異鏈球菌HtrA缺陷株的PCR鑒定結(jié)果

經(jīng)過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，應(yīng)用凝膠自動(dòng)成像分析儀分析圖像(圖4)。其中1～4組為HtrA缺陷株，5～8組為HtrA高毒力株，以分子量為DL2100的變異鏈球菌HtrA標(biāo)準(zhǔn)株DNA作為Marker，圖像顯示第1組在DNA分子量為500 bp處未出現(xiàn)特異性的電泳條帶，而第5組在此處卻出現(xiàn)了一條較明亮的特異性條帶，500 bp為HtrA基因片段的DNA分子量。第2組在DNA分子量為710 bp處出現(xiàn)一條明顯的亮條帶，而第6組在此處卻未出現(xiàn)特異性條帶，710 bp為紅霉素抗性基因片段的DNA分子量。第3、4組分別在DNA分子量為1 200 bp、1 100 bp處各出現(xiàn)一條明亮的條帶。而第7、8組均未出現(xiàn)特異性條帶，1 200 bp和1 100 bp又分別為HtrA基因上游引物序列合并紅霉素抗性基因引物HtrAUF/P1和HtrA基因下游引物序列合并紅霉素抗性基因引物HtrAUR/P2的DNA分子量。由此可見，高毒力變異鏈球菌HtrA缺陷株已檢測(cè)不到HtrA的基因片段，相反卻能夠檢測(cè)到紅霉素抗性基因片段，說明兩者已發(fā)生同源重組的互換，高毒力變異鏈球菌HtrA缺陷株構(gòu)建成功。

圖4 變異鏈球菌HtrA高毒力株和缺陷株各基因的表達(dá)

2.3 變異鏈球菌HtrA高毒力株與HtrA缺陷株轉(zhuǎn)化力的比較

從表1可以看出，第6、9 h，HtrA高毒力株的菌落數(shù)明顯多于HtrA基因缺陷株(P＜0.05);12、24、48 h，HtrA高毒力株菌落數(shù)亦明顯多于HtrA基因缺陷株(P＜0.05)。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)變異鏈球菌HtrA高毒力株與缺陷株菌落生長(zhǎng)數(shù)目的比較(n=5，s)

表1 不同時(shí)間點(diǎn)變異鏈球菌HtrA高毒力株與缺陷株菌落生長(zhǎng)數(shù)目的比較(n=5，s)

*同一時(shí)間組間比較P＜0.05

時(shí)間(h)HtrA高毒力株 HtrA缺陷株2.183 0.035 9 1.832±0.193*1.136±0.716* 2.073 0.039 12 3.468±0.702*1.770±0.366* 4.431 0.000 24 5.298±1.599*2.690±1.218* 3.952 0.003 48 5.294±1.421*2.587±1.113*t P 6 0.334±0.098*0.146±0.114*3.953 0.003

3 討論

3.1 高毒力變異鏈球菌HtrA缺陷株的構(gòu)建和鑒定

變異鏈球菌是主要的致齲菌，長(zhǎng)久以來一直是國(guó)內(nèi)外齲病病因及防治研究的熱點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為了更好地研究某個(gè)齲病相關(guān)酶或者基因，學(xué)者們通常采用生物學(xué)手段突變?cè)摶?，?gòu)建出基因缺陷株，從而精確地分析該基因在致病方面的作用，同源重組技術(shù)是其應(yīng)用的主要手段。同源重組［10］(homologous recombination)即重組發(fā)生在減數(shù)分裂期同源染色體的非姊妹染色單體間，細(xì)菌可發(fā)生在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，只要兩條DNA序列相同或接近，重組可在此序列的任何一點(diǎn)發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)在HtrA缺陷株的構(gòu)建時(shí)，應(yīng)用基本原理為同源重組的基因敲除技術(shù)對(duì)變異鏈球菌HtrA高毒力株的HtrA基因敲除，在前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建完成的同源重組質(zhì)粒載體pUChtrKO的基礎(chǔ)上，采用嵌套式PCR對(duì)HtrA基因上下游序列進(jìn)行克隆，通過插入紅霉素抗性基因的表達(dá)對(duì)突變株進(jìn)行篩選。應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)構(gòu)建的HtrA缺陷株進(jìn)行鑒定，經(jīng)過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，應(yīng)用凝膠自動(dòng)成像分析儀分析圖像，結(jié)果表明所出現(xiàn)的條帶較明亮清晰并未出現(xiàn)涂抹帶或特異性條帶，HtrA缺陷株已檢測(cè)不到HtrA的基因片段，卻能夠檢測(cè)到紅霉素抗性基因片段，說明高毒力變異鏈球菌HtrA缺陷株構(gòu)建成功。

3.2 高毒力變異鏈球菌HtrA基因缺陷株轉(zhuǎn)化力的研究

HtrA是細(xì)菌體內(nèi)一種重要的熱休克蛋白分子，也是一種多功能的伴侶分子和絲氨酸蛋白酶，已證明其在很大程度上有助于折疊錯(cuò)誤的蛋白分子重新折疊或發(fā)生降解。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除HtrA基因后的變異鏈球菌，對(duì)異常溫度、低pH值、氧化劑和DNA損壞劑的耐受能力降低，且降低了生物膜的形成能力［11-12］。HtrA能夠保護(hù)變異鏈球菌適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境變化，在口腔內(nèi)的生長(zhǎng)和致齲中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)將變異鏈球菌HtrA高毒力株和HtrA缺陷株，在TPY液體培養(yǎng)基中增菌，并在含20 ng/mL紅霉素的TSA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)皿中高毒力株組的菌落數(shù)量顯著多于HtrA缺陷株組，表明二者的轉(zhuǎn)化力有明顯的差異。究其原因，可能是HtrA中含有與染色體復(fù)制和細(xì)菌分化有關(guān)的DnaA結(jié)合位點(diǎn)，它與復(fù)制起始點(diǎn)相鄰，其下游基因高度保守并與染色體分隔作用的spoOJ相關(guān)，其編碼的HtrA可以調(diào)節(jié)糖酵解過程中稀醇酶、3-磷酸甘油酸脫氧酶的加工與成熟，因此HtrA缺失影響了變異鏈球菌DNA復(fù)制及代謝過程從而影響了它的生長(zhǎng)過程，與國(guó)外HtrA對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)影響的研究結(jié)果一致［8，12-13］。通過本實(shí)驗(yàn)顯示，高毒力變異鏈球菌HtrA基因的缺失，造成了HtrA缺陷株較高毒力株轉(zhuǎn)化力上的減弱，進(jìn)而使其毒力出現(xiàn)了下降。但HtrA基因缺失對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響的具體機(jī)制目前還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

［1］Gasc AM，Giammarinaro P，Richter S，et al.Organization around the dnaA gene of Streptococcus pneumoniae［J］.Microbiol，1998，144:433-439.

［2］Seol JH，Woo SK，Jung EM，et al.Protease Do is essential for survival of Escherichia coli at high temperature:Its identity with the htrA gene product［J］.Biochem Biophys Res Commun，1991，176:730-736.

［3］Ponting CP.Evidence for PDZ domains in bacteria，yeast，and plants［J］.Protein Sci，1997，6(2):464-468.

［4］Gray CW，Ward RV，Karran E，et al.Characterization of human HtrA2，a novel serine protease involved in the nlanlnlalian cellular stress response［J］.Eur J Biochem，2000，267(18):5699-57l0.

［5］Spiess C，Beil A，Ehrmann M，et al.A temperature-dependent switch from chaperone to protease in a widely conserved heat shock protein［J］.Cell，1999，97(3):339-347.

［6］Wonderling LD，Wilkinson BJ，Bayles DO.The htrA(degP)gene of Listeria monocytogenes 10403S is essential for optimal growth understress conditions ［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70(4):1935-1943.

［7］Poquet IV，Saint E，Seznec N，et al.HtrA is the unique surface housekeeping protease in Lactococcus lactis and is required for natural protein processing［J］.Mol Microbiol，2000，35(5):1042-1051.

［8］Diaz ML，Russell RR.HtrA protease and processing of extracellular proteins of Streptococcus mutans［J］.FEMS Microbiol Lett，2001，204(1):23-28.

［9］楊江華，郭夕源，王光平，等.不同齲敏感兒童口腔變異鏈球菌臨床分離株與HtrA關(guān)系的研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2013，42(24):2834-2836.

［10］Robinson WG，Old LA，Shah DS，et al.Chromosomal insertions and deletions in Streptococcus mutans ［J］.Caries Res，2003，37(2):148-156.

［11］Radford JR，Ballantyne HM，Nugent Z，et al.Caries-associated micro-organisms in infants from different socio-economic backgrounds in Scotland ［J］.J Dent，2008，31(6):457-462.

［12］Ahn SJ，Lemos JA，Burne RA.Role of HtrA in growth and competence of streptococcus mutans UA159 ［J］.J Bacteriol，2005，187(9):3028-3038.

［13］Biswas S，Biswas I.Role of HtrA in surface protein expression and biofilm formation by streptococcus mutans［J］.Infect Immun，2005，73(10):6923-6934.