高緒勝 丁彩紅 熊瑜

噬菌體法對老年復治肺結核合并糖尿病患者抗結核藥物耐藥分析

高緒勝 丁彩紅 熊瑜

目的 探討噬菌體檢測法（PhaB）快速檢測老年復治肺結核合并糖尿病患者結核分支桿菌對異煙肼（H）、利福平（R）、乙胺丁醇（E）和鏈霉素（S）4種一線抗結核藥物的耐藥性，分析其臨床應用價值。 方法 應用PhaB法檢測65例老年復治肺結核合并糖尿病患者結核分枝桿菌對4種一線抗結核藥物的耐藥性。

噬菌體擴增法；復治肺結核；糖尿??；耐藥；老年人

近年來老年結核病患者人數(shù)在全球呈相對上升趨勢，病死率較高［1］，老年人體質差，免疫力低，合并癥多，對抗結核藥物耐受性差等，造成耐藥尤其是耐多藥病例較多。且近30年來，糖尿病患病率顯著增加，流行病學研究顯示≥60歲人群的患病率為20.4%［2］。糖尿病合并肺結核發(fā)病率亦呈上升趨勢，糖尿病患者中肺結核的發(fā)生率是正常人的4～8倍，有報道10%～30%的肺結核患者患有糖尿?。?］。結核病可加重糖尿病，血糖控制欠佳又可使結核病加重，兩者互為因果，造成惡性循環(huán)，加之耐藥，使治療更加困難。噬菌體檢測法（PhaB）檢測結核分枝桿菌耐藥性具有快速、簡便、價廉等特點［4］。本研究利用PhaB法檢測老年復治肺結核及合并糖尿病患者對一線抗結核藥物異煙肼（H）、利福平（R）、乙胺丁醇（E）和鏈霉素（S）的耐藥情況，分析其耐藥性，為臨床治療提供參考，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

1.1.1 標本來源：患者來源于2011年3月至2014年12月在山東省胸科醫(yī)院結核科收住院的采用改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法行痰培養(yǎng)陽性的鑒定為結核分枝桿菌的老年復治肺結核患者65例，年齡60～91歲，中位年齡69歲。

1.1.2 診斷標準：按2000年中華醫(yī)學會結核病學分會制定的《肺結核診斷和治療指南》［5］，有下列情況之一者定義為復治：（1）初治失敗的患者；（2）規(guī)則用藥滿療程后痰菌又復陽的患者；（3）不規(guī)律化療＞1月的患者；（4）慢性排菌患者。耐藥肺結核是指耐≥1種抗結核藥物的肺結核。單耐藥定義為結核病患者感染的結核分枝桿菌在體外被證實對1種抗結核藥物耐藥；多耐藥定義為對＞1種抗結核藥物耐藥，但不包括同時耐異煙肼和利福平；耐多藥：對至少包括異煙肼和利福平≥2種藥物產生耐藥的肺結核病患者。

糖尿病診斷標準按WHO1999年頒布的《糖尿病診斷標準》［6］。

1.1.3 患者納入和排除標準：納入標準：（1）符合上述復治肺結核及復治肺結核合并糖尿病診斷標準；（2）年齡≥60歲。排除標準：（1）痰結核菌培養(yǎng)陰性患者；（2）非結核分枝桿菌患者；（3）合并HIV、乙肝并發(fā)癥患者；（4）年齡＜60歲。

1.1.4 試驗材料：參考噬菌體為分枝桿菌噬菌體D29，購自上海金浩公司，為英國BIOTEC Lab公司產品；分枝桿菌噬菌體按照文獻進行培養(yǎng)、增殖［4］，保存?zhèn)溆?。結核分枝桿菌標準菌株（H37Rv）購自國家菌種保藏中心。液體培養(yǎng)基Middlebrook 7H9培養(yǎng)基干粉（美國Difico公司產品）購自BD公司；指示細胞為快速生長的恥垢分枝桿菌（ATCC607，購自衛(wèi)生部結核病控制中心）。殺毒劑：硫酸亞鐵胺為Sigma公司產品；鏈霉素、異煙肼藥粉購于Sigma公司，利福平、乙胺丁醇藥粉為上海信誼藥廠產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 標本的處理：65株老年復治肺結核患者臨床分離株，經鑒定為結核分枝桿菌（檢測前將待檢菌株轉種至羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2周）。檢測時刮取菌落少許，磨菌后用液體培養(yǎng)基調整濁度至1個麥氏單位，1∶5000稀釋后待檢。

1.2.2 PhaB法檢測耐藥性：應用PhaB法檢測65例痰培養(yǎng)陽性的結核分枝桿菌臨床分離株對H、R、E、S 4種一線抗結核藥物耐藥性。具體操作步驟按照文獻進行［4］。在對照管和試驗管中分別加入1∶5000稀釋的待檢菌液0.5 m l，分別在試驗管中加入0.5 m l的H、R、E、S，對照管加0.5 m l液體培養(yǎng)基，混勻37℃作用48 h，每次檢測時設殺毒劑硫酸亞鐵銨對照管以及液體培養(yǎng)基陰性、恥垢分枝桿菌對照管。分別計算每個菌株的加藥管與對照管的噬菌斑減少百分比。以加藥管與對照管的噬菌斑減少百分比≥99%判為敏感，反之為耐藥；異煙肼以加藥管與對照管的噬菌斑減少百分比＞95%判為敏感，反之為耐藥。

1.3 統(tǒng)計學分析 2人同時采用Excel表格進行錄入數(shù)據(jù)，核對無誤后應用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料采用率（%）表示，2組差異性比較采用χ2檢驗，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義；應用95%可信區(qū)間（95%CI）估計總體參數(shù)范圍。

2 結果

2.1 一般資料 65例患者中，年齡60～91歲，平均（70.30±8.17）歲，男 53例，女 12例，男女比例為4.12∶1。其中單純老年復治肺結核43例，男36例，女7例，平均年齡（69.42±8.01）歲；合并糖尿病22例，男17例，女5例，平均年齡（71.29±8.54）歲。2組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 總耐藥情況 65例老年復治肺結核患者結核分枝桿菌對4種一線抗結核藥物總耐藥率為40.00% （26/65），其中單純老年復治肺結核組耐藥率為34.88%（15/43），合并糖尿病組耐藥率為 50.00% （11/22），2組間耐藥率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.39，P=0.24）。見表1。老年復治肺結核合并糖尿病組耐多藥率、耐S率均高于單純老年復治肺結核組（χ2= 5.25，P=0.02；χ2=5.24，P=0.02）。見表2。

2.3 不同血糖水平對耐藥性影響 空腹血糖≥7.10 mmol/L者較空腹血糖＜7.10 mmol/L者耐藥率高，2組之間差異有統(tǒng)計學意義。見表3。

表1　2組耐藥情況（n，%）

表2　2組耐藥情況比較（n，%）

表3　不同血糖水平耐藥情況比較（n，%）

3 討論

研究結果顯示我院結核科痰培養(yǎng)陽性的住院老年復治肺結核患者對H、R、E、S 4種一線抗結核藥物總耐藥率為40.00%，單耐藥率為15.38%，多耐藥率為7.69%，耐多藥率為16.92%，總耐藥、單耐藥及多耐藥率低于我國2007～2008年全國結核病耐藥性基線調查報告中老年復治肺結核總耐藥率46.39%、單耐藥率22.41%、多耐藥率8.34%；耐多藥率高于2007～2008年全國結核病耐藥性基線調查報告的15.63%［7］。2007～2008年全國結核病耐藥性基線調查耐藥率為上述4種藥物加卡那霉素和氧氟沙星6種抗結核藥物，此次統(tǒng)計HRES 4種抗結核藥物耐藥性，耐藥率較高，尤其是耐多藥情況比較嚴重。

本研究顯示老年復治肺結核合并糖尿病組耐藥率高于單純老年復治肺結核組，其中耐多藥及S率差異有統(tǒng)計學差異?？崭寡恰?.1 mmol/L組耐藥率高于空腹血糖＜7.1 mmol/L組，差異有統(tǒng)計學意義。Duangrithi等［8］研究發(fā)現(xiàn)肺結核合并糖尿病患者耐H、R、吡嗪酰胺率稍高于單純肺結核患者，但均無統(tǒng)計學差異。熊瑜等［9-10］、高緒勝等［11］研究發(fā)現(xiàn)肺結核合并糖尿病組耐藥率稍高于單純肺結核組，差異無統(tǒng)計學意義。分析原因考慮：（1）糖尿病患者肺泡上皮細胞增厚，肺毛細血管基底膜增厚、肺彈性下降導致肺容量下降、彌散功能及順應性低下等，以及自主神經病變可導致氣道反應性、支氣管擴張性下降，從而易于感染肺結核。（2）糖尿病患者由于肝臟轉化維生素A機能降低，導致維生素A缺乏，使呼吸道黏膜上皮對外界抵抗力下降，易被結核菌感染［3］。（3）糖尿病患者常有糖、脂肪、蛋白質代謝紊亂，導致機體的免疫功能減退，有報道血糖＞12 mmol/L患者較血糖＜12 mmol/L者巨噬細胞吞噬指數(shù)顯著降低［12］。隨著血糖升高，免疫功能降低，尤其是老年糖尿病患者體抗力差，CD4/CD8較非糖尿病患者更低［13］。免疫功能降低可能易于結核分枝桿菌尤其耐藥菌的感染。（4）研究證實糖尿病和肺結核患者均存在易感基因［14］，兩者并存還可能造成或促進結核分枝桿菌耐藥基因的突變；膽固醇被確認為結核分枝桿菌存活、感染的重要營養(yǎng)素，丙酮酸也有促進結核分枝桿菌生長作用，尤其是老年糖尿病患者，血糖控制欠佳，體內葡萄糖大量堆積，脂肪分解，三酰甘油增多，為結核分枝桿菌包括耐藥菌提供了一個良好的生存及繁殖環(huán)境，使得結核分枝桿菌快速繁殖，且由于菌量大，易產生耐藥變異菌。有報道菌群越大，耐藥菌存在的概率越高。老年肺結核合并糖尿病患者病情重，病灶以干酪性為主，且多伴有空洞形成，且結核菌容易形成耐藥菌［15］。糖尿病患者病程在5～10年者，易并發(fā)多臟器病變，尤其是老年患者并發(fā)癥更多，如肝腎功能障礙，對抗結核藥物耐受性較中青年差，限制抗結核藥物的正常使用，影響抗結核效果，使結核病變遷延、難治、耐藥增加。

綜上所述，老年復治肺結核合并糖尿病患者耐藥率之高不容忽視，應用PhaB法檢測結核分枝桿菌的耐藥性簡單、快速，大大縮短結核分枝桿菌耐藥性檢出周期，根據(jù)結果及時調整用藥方案，為臨床治療提供參考。但此次PhaB法檢測藥敏試驗藥物僅限于4種一線抗結核藥物，有待增加其他一線和二線抗結核藥物藥敏試驗進一步完善。本研究發(fā)現(xiàn)老年復治肺結核合并糖尿病患者耐藥率高于單純復治肺結核患者耐藥率，尤其是耐多藥率及耐S率；血糖控制差，耐藥率高，故應積極控制血糖，合理制定化療方案。由于本研究的樣本量有限，有待于擴大樣本進一步研究。

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Analysis of the drug resistance in the elderly patientsw ith retreatment tuberculosis com plicated with diabetes using phage biological amp lification

GAO Xu-sheng，DINGCai-hong，XIONGYu.Department ofTuberculosis，Shandong Provincial Chest Hospital，Jinan 250013，China

Objective To explore the drug resistance of mycobacterium tuberculosis to the four first-line anti-TB drugs，including isoniazid（H），rifampicin（R）and ethambutol（E），streptomycin（S），in the elderly patients with retreatment tuberculosis complicated with diabetes，by using phage biological amplification（PhaB）. Methods PhaB was used to detect the drug resistance of the mycobacterium tuberculosis to the four first-line anti-TB drugs in 65 elderly cases of retreatment tuberculosis complicated with diabetes. Results The total drug resistance rate of the elderly patients with retreatment of pulmonary tuberculosis complicated with diabeteswas 50.00%，compared with 34.88%in the elderly patients retreatment pulmonary tuberculosis without diabetes（χ2=1.39，P=0.24）；There were significant differences inmulti-drug resistance ratio and streptomycin resistance between two groups（χ2=5.25，P=0.02；χ2=5.24，P= 0.02）.The resistant rate was 69.23%in the elderly patients with retreatment pulmonary tuberculosis with a blood glucose level≥7.10mmol/L，compared with 22.22%in the patients with a blood glucose level less than 7.10mmol/L（χ2=4.70，P=0.03）. Conclusions Multi-drug resistance ratio and streptomycin resistance is high in the elderly patients with retreatment pulmonary tuberculosis，especially in the patientswith a blood glucose level≥7.10mmol/L.PhaB method can rapidly detect the drug resistance ofmycobacterium tuberculosis，and can guide the clinicalmedication.

phage biological amplification；retreatment tuberculosis；diabetes；drug resistance；aged

R 521

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.12.016

2015-06-10）

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（2013WS0146）

250013山東省濟南市，山東省胸科醫(yī)院結核內科

丁彩紅，Email：dingdding_64@163.com

結果 老年復治肺結核合并糖尿病患者總耐藥率為50.00%，單純老年復治肺結核患者的總耐藥率為34.88%，2組差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.39，P=0.24）；2組耐多藥率和耐S率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.25，P= 0.02；χ2=5.24，P=0.02）。老年復治肺結核合并糖尿病患者空腹血糖≥7.10 mmol/L組耐藥率為69.23%，高于空腹血糖＜7.1mmol/L組的22.22%，2組差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.70，P=0.03）。 結論 老年復治肺結核合并糖尿病患者耐多藥率和耐S率高，尤其是血糖≥7.10 mmol/L者。PhaB法能快速檢測結核分枝桿菌耐藥性，指導臨床用藥。