姚樂申 袁毅路 李燕 張保國

PinX1基因的真核表達載體構建及其在乳腺癌細胞中的表達

姚樂申 袁毅路 李燕 張保國

目的 進一步研究端粒結合蛋白PinX1基因在乳腺癌細胞中對端粒酶活性的調控作用，構建PinX1基因的真核表達載體，轉染乳腺癌MDA-MB-231細胞，表達并鑒定其編碼蛋白PinX1。 方法 采用RT-PCR法擴增PinX1基因的編碼序列，將其克隆至pMD18-T載體中構建T-PinX1質粒，NOT1和Xhol1雙酶切T-PinX1質粒與PUB6/V5-HISA載體后，連接并構建真核表達載體PUB6/V5-HIS A-PinX1，采用序列分析鑒定陽性質粒轉染乳腺癌MDA-MB-231細胞，采用Western blot鑒定PinX1蛋白的表達。 結果 經酶切、序列分析鑒定證實成功構建PinX1基因的真核表達載體；Western blot檢測結果證實，成功完成了該表達載體在乳腺癌MDA-MB-231細胞內的特性外源性表達。 結論 本研究成功構建了PinX1基因的真核表達載體，并完成了該表達載體在乳腺癌MDAMB-231細胞內的特性外源性表達。為后期進一步研究PinX1基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及PinX1蛋白表達與乳腺癌預后的關系奠定了基礎。

乳腺癌；PinX1基因；真核表達；MDA-MB-231細胞

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤。流行病學資料顯示，近年來，乳腺癌的新增病例數(shù)逐年上升，現(xiàn)已成為老年女性最常見的一種惡性腫瘤之一，嚴重影響老年婦女身心健康甚至危及生命［1］。雖然近年來對乳腺癌的病因學研究不斷深入，但由于其病因及發(fā)病機制復雜，故至今仍未真正探明［2-4］。研究認為遺傳易感性、內分泌以及生活、飲食習慣等因素都可能與乳腺癌的發(fā)生相關。

研究已證實腫瘤細胞中端粒酶活性顯著增高［5］，已知端粒酶活性受多種途徑調控，其中端粒結合蛋白PinX1是研究者近年來發(fā)現(xiàn)的一個重要的調控蛋白［6］。PinX1可直接與端粒酶逆轉錄酶hTERT結合，發(fā)揮其端粒酶活性的抑制因子作用。同時，實驗證實抑制PinX1蛋白的表達可顯著促進細胞的癌變，由此推測PinX1可能是一個重要的抑癌因子［7］。

然而，端粒結合蛋白PinX1基因在乳腺癌細胞中對端粒酶活性的調控作用，及其在乳腺上皮細胞癌變過程中的作用機制目前尚不明確。為進一步探討PinX1對乳腺癌細胞活性的調節(jié)及其分子機制，進而研究PinX1基因在乳腺細胞癌變過程中的作用機制，本研究構建了PinX1基因的原核表達載體，并在乳腺癌MDA-MB-231細胞系進行了表達和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌DH5α、乳腺癌MDA-MB-231細胞系、肝癌細胞系HepG2、pMD18-T載體以及pUB6/ V5-His A細胞工程重組質粒（HIS-tag）均由中國藥科大學藥學實驗室惠贈。

1.2 實驗試劑 一步法逆轉錄聚合酶鏈式反應（RTPCR）試劑盒、總RNA抽提試劑盒、Lipofectamine2000脂質體轉染試劑盒、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基購自Invitrogen公司（美國）；pMD18-T Simple Vector試劑盒、限制性內切酶NOT 1及Xhol1、PCR產物凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒及T4連接酶試劑盒購自Takara公司（日本）；高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司（美國）；兔抗HIS一抗購自Abcam公司（英國）；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔二抗購自中杉金橋公司；其余實驗用試劑均為分析純。

1.3 肝癌細胞系HepG2總RNA的提取 參照Invitrogen公司 RNA抽提試劑盒使用說明方法提取HepG2細胞總RNA，并將其稀釋到1μg/μl質量濃度，待下一步實驗用。

1.4 引物設計 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中PinX1基因的核酸序列（GI：547235253）設計擴增用上、下游引物，為便于將擴增序列插入表達載體，分別引入NOT1 和Xhol1酶切位點。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。序列如下：

上游引物：5′-TTGCGGCCGCAA ATGTCTATGCTGGCTGAACG-3′

下游引物：5′-CCCTCGAGGG TTGGAATCTTTCTTCTTCTTCT-3′

斜體部分分別為NOT1和Xhol1酶切位點。預期PCR擴增產物為 PinX1基因全長，片段長度約為926 bp。

1.5 RT-PCR法擴增PinX1基因 以提取的HepG2細胞總RNA為模板，采用逆轉錄一步法擴增PinX1基因全長，擴增體系參照Invitrogen公司RT-PCR試劑盒說明書。反應條件：52℃ 20 min，95℃ 5 min，95℃30 s，54℃ 30 s，70℃ 30 s，40個循環(huán)；70℃延伸10 min，25℃ 1min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、分離PCR擴增產物。

1.6 T-PinX1重組質粒構建 參照Takara公司凝膠回收試劑盒說明書，回收陽性PinX1基因PCR產物，按照T-A連接原理將其連接pMD18-T載體，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌，利用氨芐霉素抗性進行篩選，挑取單個菌落擴增后抽提質粒，分別進行PinX1引物PCR及NOT1和Xhol1雙酶切鑒定，鑒定均為陽性的重組質粒命名為T-PinX1質粒。

1.7 PUB6/V5-HIS A-PinX1真核表達載體的構建采用限制性內切酶NOT1和Xhol1雙酶切法，對重組質粒T-PinX1進行消化，同時采用NOT1和Xhol1雙酶切HIS-tag PUB6/V5-HIS A真核表達載體質粒，純化酶切產物。并用T4DNA連接酶，連接酶切產物與表達載體，16℃連接4 h，連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細菌DH5α，在氨芐青霉素抗性的平板上篩選生長，涂板后挑取單菌落擴增。抽提質粒分別進行PinX1引物PCR及NOT1和Xhol1雙酶切鑒定，鑒定陽性的重組質粒進行基因序列分析，正確的質粒命名為PUB6/ V5-HISA-PinX1。

1.8 轉染乳腺癌 MDA-MB-231細胞 采用高糖DMEM，體外培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細胞，將構建的重組PUB6/V5-HIS A-PinX1質粒轉染細胞，轉染體系：200μl的無血清 Opti-MEM培養(yǎng)基、10μl Lipofectamine-2000轉染試劑及10μg重組質粒DNA，混勻靜置5 min后加至MDA-MB-231細胞無血清培養(yǎng)體系中，37℃孵育6 h，以含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)體系替換轉染混合物。培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集細胞。同時設空白對照組及空載體轉染對照組。

1.9 PinX1蛋白鑒定 采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測轉染后MDA-MB-231細胞內PinX1蛋白的表達情況。SDS-PAGE蛋白電泳后，將蛋白從凝膠轉移至PVDF膜，5%的脫脂牛奶過夜封閉。抗體孵育：一抗采用1∶500的兔抗HIS，4℃ 過夜孵育，二抗采用1∶5000辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，室溫2 h。用化學發(fā)光蛋白免疫印跡（ECL）法顯色分析。

2 結果

2.1 RT-PCR法擴增PinX1基因全長 采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT-PCR擴增產物片段，鑒定結果顯示，在約900 bp處可見特異性目的條帶，其大小與PinX1基因預期相一致（圖1）。

圖1　PinX1基因RT-PCR產物片段瓊脂糖電泳圖

2.2 T-PinX1質粒鑒定 分別采用PinX1特異性引物PCR及NOT1和Xhol1雙酶切的方法鑒定T-PinX1質粒。在含氨芐青霉素的LB平板上，挑取了5個單克隆進行PinX1特異性引物PCR鑒定，結果5個單克隆均為陽性（圖2），隨機取其中一個單克隆搖菌擴增后進行雙酶切鑒定，產物條帶在900 bp左右（圖3）。結果表明PinX1基因片段成功克隆到pMD18-T載體上。

圖2　PinX1特異性引物PCR鑒定

圖3　T-PinX1雙酶切PCR鑒定

2.3 PUB6/V5-HIS A-PinX1真核表達載體的鑒定分別采用PinX1特異性引物PCR及NOT1和Xhol1雙酶切的方法鑒定PUB6/V5-HIS A-PinX1質粒。在氨芐青霉素抗性的LB平板中，挑取10個單克隆進行TPinX1引物PCR鑒定，結果其中8個單克隆為陽性（2，3，5-10）（圖4）。隨機選取其中1個陽性克隆搖菌擴增后提取質粒用NOT1和Xhol1雙酶切，有約900 bp目的條帶（圖5）。將質粒進行DNA序列分析，測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中PinX1基因（GI：547235253）的核酸序列完全一致。結果證實已將PinX1基因成功克隆至 PUB6/V5-HIS A載體中，真核表達質粒PUB6/V5-HISA-PinX1構建成功。

圖4　PUB6/V5-HISA-PinX1質粒PCR鑒定

圖5　PUB6/V5-HISA-PinX1質粒NOT1和Xhol1雙酶切鑒定

2.4 免疫印跡法鑒定PinX1蛋白表達 本研究中選用的 PUB6/V5-HIS A載體帶有 HIS-tag，故乳腺癌MDA-MB-231細胞轉染PUB6/V5-HIS A-PinX1后，表達的重組PinX1蛋白可被抗His特異性抗體所識別。經Western blot檢測，轉染后MDA-MB-231細胞表達的PinX1蛋白大小與預期相一致（35kD），而空載體與空白對照組均無條帶，表明PinX1蛋白在乳腺癌MDAMB-231細胞中得到有效表達（圖6）。

圖6　免疫印跡法法檢測PUB6/V5-HISA-PinX1在乳腺癌MDA-MB-231細胞中的表達

3 討論

全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)（GLOBOCAN）認為乳腺癌是中國女性最常見的癌癥，年齡標化率（ASR）為每10萬人 21.6例［8］。根據(jù)中國國家腫瘤登記中心的數(shù)據(jù)，乳腺癌是城市女性最常見的癌癥，是農村女性第四大常見癌癥。乳腺癌的發(fā)病機制至今仍不明確，相關病因學研究已引起研究者們的高度重視。大量研究結果表明端粒酶在惡性腫瘤的演變過程中有重要作用，且其表達水平與腫瘤的預后密切相關［9］。PinX1基因作為端粒酶的抑制基因，定位于8p23，近年來被認為是一種細胞內在的端粒酶抑制因子，其表達可能與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。已有研究證實在腸癌、胃癌等腫瘤患者中PinX1表達顯著下降，端粒酶活性顯著增強［10］。因此，PinX1被認為是潛在抑癌因子。

本研究選用表達真核載體PUB6/V5-HIS A，通過基因重組方法，采用NOT1和Xhol1對PinX1片段的PCR產物及PUB6/V5-HISA表達載體分別雙酶切，使核酸片段和表達載體具有互補的黏性末端，可保證PinX1目的片段定向插入至PUB6/V5-HIS A表達載體。本研究成功構建了PinX1基因的真核表達載體，并通過脂質體將AVI-PUB6/V5-HIS A-PinX1重組質粒轉染乳腺癌MDA-MB-231細胞，實現(xiàn)了PinX1蛋白在乳腺癌細胞中的特異性外源表達，為進一步研究PinX1蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及PinX1蛋白與乳腺癌預后關系的研究奠定了基礎。

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Construction of recombinant eukaryotic expression and identification of PinX1 in human breast cancer cell line

YAO Le-shen，YUAN Yi-lu.Department ofGeneral Surgery，Nanjing Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School，Nanjing 210008，China；LI Yan.Jiangsu Provinicial Center for Disease Control and Prevention，Nanjing 210009，China；ZHANG Bao-guo.Department of Oncology，Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210006，China

Objective To observe the effect of PinX1 gene on the regulation of telomerase activity of breast carcinoma cell line by constructing the full-length PinX1 gene into an eukaryotic expression vector，and to identify the coding protein expression in human breast cancer MDA-MB-231 cell line. M ethods The coding sequence of PinX1 was amplified by one step RT-PCR and cloned into pMD18-T vector to construct T-PinX1 plasmid.NOT1 and Xhol1 digested TPinX1 plasmid and the vector of PUB6/V5-HIS A，then the recombinant eukaryotic expression vector PUB6/V5-HIS APinX1 was constructed，and transfected into breast cancer MDA-MB-231 cells.The expression of the PinX1 gene in MDAMB-231 cellswas identified by Western blot. Results The recombinant eukaryotic expression vector PUB6/V5-HISAPinX1 was successfully constructed.The expression of PinX1 gene was detected by Western blot. Conclusions The PinX1 gene recombinant eukaryotic expression vector has been successfully constructed and expressed in human breast cancer cells.This work would lay a foundation for further study on the function of PinX1 protein and its interaction with other proteins in breast cancer.

breast cancer；PinX1 gene；eukaryotic expression；MDA-MB-231 cell line

R 655.8

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.12.010

2015-05-20）

210008 江蘇省南京市，南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院普外科（姚樂申，袁毅路）；210009江蘇省南京市，江蘇省疾病預防控制中心（李燕）；210006江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）腫瘤科

張保國，Email：emily88127@126.com