姚樂申 袁毅路 李燕 張保國

PinX1基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建及其在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

姚樂申 袁毅路 李燕 張保國

目的 進(jìn)一步研究端粒結(jié)合蛋白PinX1基因在乳腺癌細(xì)胞中對端粒酶活性的調(diào)控作用，構(gòu)建PinX1基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，表達(dá)并鑒定其編碼蛋白PinX1。 方法 采用RT-PCR法擴(kuò)增PinX1基因的編碼序列，將其克隆至pMD18-T載體中構(gòu)建T-PinX1質(zhì)粒，NOT1和Xhol1雙酶切T-PinX1質(zhì)粒與PUB6/V5-HISA載體后，連接并構(gòu)建真核表達(dá)載體PUB6/V5-HIS A-PinX1，采用序列分析鑒定陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，采用Western blot鑒定PinX1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 經(jīng)酶切、序列分析鑒定證實(shí)成功構(gòu)建PinX1基因的真核表達(dá)載體；Western blot檢測結(jié)果證實(shí)，成功完成了該表達(dá)載體在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)的特性外源性表達(dá)。 結(jié)論 本研究成功構(gòu)建了PinX1基因的真核表達(dá)載體，并完成了該表達(dá)載體在乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞內(nèi)的特性外源性表達(dá)。為后期進(jìn)一步研究PinX1基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及PinX1蛋白表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

乳腺癌；PinX1基因；真核表達(dá)；MDA-MB-231細(xì)胞

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤。流行病學(xué)資料顯示，近年來，乳腺癌的新增病例數(shù)逐年上升，現(xiàn)已成為老年女性最常見的一種惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響老年婦女身心健康甚至危及生命［1］。雖然近年來對乳腺癌的病因?qū)W研究不斷深入，但由于其病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，故至今仍未真正探明［2-4］。研究認(rèn)為遺傳易感性、內(nèi)分泌以及生活、飲食習(xí)慣等因素都可能與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。

研究已證實(shí)腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性顯著增高［5］，已知端粒酶活性受多種途徑調(diào)控，其中端粒結(jié)合蛋白PinX1是研究者近年來發(fā)現(xiàn)的一個重要的調(diào)控蛋白［6］。PinX1可直接與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT結(jié)合，發(fā)揮其端粒酶活性的抑制因子作用。同時，實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制PinX1蛋白的表達(dá)可顯著促進(jìn)細(xì)胞的癌變，由此推測PinX1可能是一個重要的抑癌因子［7］。

然而，端粒結(jié)合蛋白PinX1基因在乳腺癌細(xì)胞中對端粒酶活性的調(diào)控作用，及其在乳腺上皮細(xì)胞癌變過程中的作用機(jī)制目前尚不明確。為進(jìn)一步探討PinX1對乳腺癌細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)及其分子機(jī)制，進(jìn)而研究PinX1基因在乳腺細(xì)胞癌變過程中的作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了PinX1基因的原核表達(dá)載體，并在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系進(jìn)行了表達(dá)和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌DH5α、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系、肝癌細(xì)胞系HepG2、pMD18-T載體以及pUB6/ V5-His A細(xì)胞工程重組質(zhì)粒（HIS-tag）均由中國藥科大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）試劑盒、總RNA抽提試劑盒、Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基購自Invitrogen公司（美國）；pMD18-T Simple Vector試劑盒、限制性內(nèi)切酶NOT 1及Xhol1、PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒及T4連接酶試劑盒購自Takara公司（日本）；高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司（美國）；兔抗HIS一抗購自Abcam公司（英國）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗購自中杉金橋公司；其余實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純。

1.3 肝癌細(xì)胞系HepG2總RNA的提取 參照Invitrogen公司 RNA抽提試劑盒使用說明方法提取HepG2細(xì)胞總RNA，并將其稀釋到1μg/μl質(zhì)量濃度，待下一步實(shí)驗(yàn)用。

1.4 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中PinX1基因的核酸序列（GI：547235253）設(shè)計擴(kuò)增用上、下游引物，為便于將擴(kuò)增序列插入表達(dá)載體，分別引入NOT1 和Xhol1酶切位點(diǎn)。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。序列如下：

上游引物：5′-TTGCGGCCGCAA ATGTCTATGCTGGCTGAACG-3′

下游引物：5′-CCCTCGAGGG TTGGAATCTTTCTTCTTCTTCT-3′

斜體部分分別為NOT1和Xhol1酶切位點(diǎn)。預(yù)期PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為 PinX1基因全長，片段長度約為926 bp。

1.5 RT-PCR法擴(kuò)增PinX1基因 以提取的HepG2細(xì)胞總RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄一步法擴(kuò)增PinX1基因全長，擴(kuò)增體系參照Invitrogen公司RT-PCR試劑盒說明書。反應(yīng)條件：52℃ 20 min，95℃ 5 min，95℃30 s，54℃ 30 s，70℃ 30 s，40個循環(huán)；70℃延伸10 min，25℃ 1min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6 T-PinX1重組質(zhì)粒構(gòu)建 參照Takara公司凝膠回收試劑盒說明書，回收陽性PinX1基因PCR產(chǎn)物，按照T-A連接原理將其連接pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌，利用氨芐霉素抗性進(jìn)行篩選，挑取單個菌落擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，分別進(jìn)行PinX1引物PCR及NOT1和Xhol1雙酶切鑒定，鑒定均為陽性的重組質(zhì)粒命名為T-PinX1質(zhì)粒。

1.7 PUB6/V5-HIS A-PinX1真核表達(dá)載體的構(gòu)建采用限制性內(nèi)切酶NOT1和Xhol1雙酶切法，對重組質(zhì)粒T-PinX1進(jìn)行消化，同時采用NOT1和Xhol1雙酶切HIS-tag PUB6/V5-HIS A真核表達(dá)載體質(zhì)粒，純化酶切產(chǎn)物。并用T4DNA連接酶，連接酶切產(chǎn)物與表達(dá)載體，16℃連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌DH5α，在氨芐青霉素抗性的平板上篩選生長，涂板后挑取單菌落擴(kuò)增。抽提質(zhì)粒分別進(jìn)行PinX1引物PCR及NOT1和Xhol1雙酶切鑒定，鑒定陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行基因序列分析，正確的質(zhì)粒命名為PUB6/ V5-HISA-PinX1。

1.8 轉(zhuǎn)染乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞 采用高糖DMEM，體外培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，將構(gòu)建的重組PUB6/V5-HIS A-PinX1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染體系：200μl的無血清 Opti-MEM培養(yǎng)基、10μl Lipofectamine-2000轉(zhuǎn)染試劑及10μg重組質(zhì)粒DNA，混勻靜置5 min后加至MDA-MB-231細(xì)胞無血清培養(yǎng)體系中，37℃孵育6 h，以含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)體系替換轉(zhuǎn)染混合物。培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。同時設(shè)空白對照組及空載體轉(zhuǎn)染對照組。

1.9 PinX1蛋白鑒定 采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)PinX1蛋白的表達(dá)情況。SDS-PAGE蛋白電泳后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的脫脂牛奶過夜封閉?？贵w孵育：一抗采用1∶500的兔抗HIS，4℃ 過夜孵育，二抗采用1∶5000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫2 h。用化學(xué)發(fā)光蛋白免疫印跡（ECL）法顯色分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法擴(kuò)增PinX1基因全長 采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段，鑒定結(jié)果顯示，在約900 bp處可見特異性目的條帶，其大小與PinX1基因預(yù)期相一致（圖1）。

圖1　PinX1基因RT-PCR產(chǎn)物片段瓊脂糖電泳圖

2.2 T-PinX1質(zhì)粒鑒定 分別采用PinX1特異性引物PCR及NOT1和Xhol1雙酶切的方法鑒定T-PinX1質(zhì)粒。在含氨芐青霉素的LB平板上，挑取了5個單克隆進(jìn)行PinX1特異性引物PCR鑒定，結(jié)果5個單克隆均為陽性（圖2），隨機(jī)取其中一個單克隆搖菌擴(kuò)增后進(jìn)行雙酶切鑒定，產(chǎn)物條帶在900 bp左右（圖3）。結(jié)果表明PinX1基因片段成功克隆到pMD18-T載體上。

圖2　PinX1特異性引物PCR鑒定

圖3　T-PinX1雙酶切PCR鑒定

2.3 PUB6/V5-HIS A-PinX1真核表達(dá)載體的鑒定分別采用PinX1特異性引物PCR及NOT1和Xhol1雙酶切的方法鑒定PUB6/V5-HIS A-PinX1質(zhì)粒。在氨芐青霉素抗性的LB平板中，挑取10個單克隆進(jìn)行TPinX1引物PCR鑒定，結(jié)果其中8個單克隆為陽性（2，3，5-10）（圖4）。隨機(jī)選取其中1個陽性克隆搖菌擴(kuò)增后提取質(zhì)粒用NOT1和Xhol1雙酶切，有約900 bp目的條帶（圖5）。將質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中PinX1基因（GI：547235253）的核酸序列完全一致。結(jié)果證實(shí)已將PinX1基因成功克隆至 PUB6/V5-HIS A載體中，真核表達(dá)質(zhì)粒PUB6/V5-HISA-PinX1構(gòu)建成功。

圖4　PUB6/V5-HISA-PinX1質(zhì)粒PCR鑒定

圖5　PUB6/V5-HISA-PinX1質(zhì)粒NOT1和Xhol1雙酶切鑒定

2.4 免疫印跡法鑒定PinX1蛋白表達(dá) 本研究中選用的 PUB6/V5-HIS A載體帶有 HIS-tag，故乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染PUB6/V5-HIS A-PinX1后，表達(dá)的重組PinX1蛋白可被抗His特異性抗體所識別。經(jīng)Western blot檢測，轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)的PinX1蛋白大小與預(yù)期相一致（35kD），而空載體與空白對照組均無條帶，表明PinX1蛋白在乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞中得到有效表達(dá)（圖6）。

圖6　免疫印跡法法檢測PUB6/V5-HISA-PinX1在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)（GLOBOCAN）認(rèn)為乳腺癌是中國女性最常見的癌癥，年齡標(biāo)化率（ASR）為每10萬人 21.6例［8］。根據(jù)中國國家腫瘤登記中心的數(shù)據(jù)，乳腺癌是城市女性最常見的癌癥，是農(nóng)村女性第四大常見癌癥。乳腺癌的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確，相關(guān)病因?qū)W研究已引起研究者們的高度重視。大量研究結(jié)果表明端粒酶在惡性腫瘤的演變過程中有重要作用，且其表達(dá)水平與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)［9］。PinX1基因作為端粒酶的抑制基因，定位于8p23，近年來被認(rèn)為是一種細(xì)胞內(nèi)在的端粒酶抑制因子，其表達(dá)可能與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。已有研究證實(shí)在腸癌、胃癌等腫瘤患者中PinX1表達(dá)顯著下降，端粒酶活性顯著增強(qiáng)［10］。因此，PinX1被認(rèn)為是潛在抑癌因子。

本研究選用表達(dá)真核載體PUB6/V5-HIS A，通過基因重組方法，采用NOT1和Xhol1對PinX1片段的PCR產(chǎn)物及PUB6/V5-HISA表達(dá)載體分別雙酶切，使核酸片段和表達(dá)載體具有互補(bǔ)的黏性末端，可保證PinX1目的片段定向插入至PUB6/V5-HIS A表達(dá)載體。本研究成功構(gòu)建了PinX1基因的真核表達(dá)載體，并通過脂質(zhì)體將AVI-PUB6/V5-HIS A-PinX1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了PinX1蛋白在乳腺癌細(xì)胞中的特異性外源表達(dá)，為進(jìn)一步研究PinX1蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及PinX1蛋白與乳腺癌預(yù)后關(guān)系的研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Fan L，Strasser-Weippl K，Li JJ，et al.Breast cancer in China［J］.TheLancet Oncology，2014，15（7）：e279-e289.

［2］ Fresco R，Spera G，Meyer C，et al.Imaging radiation doses and associated risks and benefits in subjects participating in breast cancer clinical trials［J］.Oncologist，2015，20（7）：702-712.

［3］ Kaushal N，DurmazYY，BaoL，et al.“Smart”nanoparticles enhance the cytoplasmic delivery of anti-rhoc silencing rna and inhibit the migration and invasion of aggressive breast cancer cells［J］.Mol Pharm，2015，12（7）：2406-2417.

［4］ Koh CH，Bhoo-Pathy N，Ng KL，et al.Utility of pre-treatment neutrophil-lymphocyte ratio and platelet-lymphocyte ratio as prognostic factors in breast cancer［J］.Br JCancer，2015，113（1）：150-158.

［5］ Rana C，Piplani H，Vaish V，et al.Downregulation of telomerase activity by diclofenac and curcumin is associated with cell cycle arrest and induction of apoptosis in colon cancer［J］.Tumour Biol，2015，36（8）：5999-6010.

［6］ Tian XP，Qian D，He LR，et al.The telomere/telomerase bindingfactorPinX1regulatespaclitaxelsensitivity depending on spindle assembly checkpoint in human cervical squamous cell carcinomas［J］.Cancer Letters，2014，353 （1）：104-114.

［7］ Mei PJ，Chen YS，Du Y，et al.PinX1 inhibits cell proliferation，migration and invasion in glioma cells［J］.Med Oncol，2015，32（3）：73.

［8］ Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［9］ Zuo J，Wang DH，Zhang YJ，et al.Expression and mechanism of PinX1 and telomerase activity in the carcinogenesis of esophageal epithelial cells［J］.Oncol Rep，2013，30 （4）：1823-1831.

［10］Wang HB，WangWQ，Wang XW，et al.PinX1 gene transfection enhances the sensitivity of gastric carcinoma cell line to 5-fluorouracil［J］.Hepatogastroenterology，2011，58 （106）：682-686.

Construction of recombinant eukaryotic expression and identification of PinX1 in human breast cancer cell line

YAO Le-shen，YUAN Yi-lu.Department ofGeneral Surgery，Nanjing Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School，Nanjing 210008，China；LI Yan.Jiangsu Provinicial Center for Disease Control and Prevention，Nanjing 210009，China；ZHANG Bao-guo.Department of Oncology，Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210006，China

Objective To observe the effect of PinX1 gene on the regulation of telomerase activity of breast carcinoma cell line by constructing the full-length PinX1 gene into an eukaryotic expression vector，and to identify the coding protein expression in human breast cancer MDA-MB-231 cell line. M ethods The coding sequence of PinX1 was amplified by one step RT-PCR and cloned into pMD18-T vector to construct T-PinX1 plasmid.NOT1 and Xhol1 digested TPinX1 plasmid and the vector of PUB6/V5-HIS A，then the recombinant eukaryotic expression vector PUB6/V5-HIS APinX1 was constructed，and transfected into breast cancer MDA-MB-231 cells.The expression of the PinX1 gene in MDAMB-231 cellswas identified by Western blot. Results The recombinant eukaryotic expression vector PUB6/V5-HISAPinX1 was successfully constructed.The expression of PinX1 gene was detected by Western blot. Conclusions The PinX1 gene recombinant eukaryotic expression vector has been successfully constructed and expressed in human breast cancer cells.This work would lay a foundation for further study on the function of PinX1 protein and its interaction with other proteins in breast cancer.

breast cancer；PinX1 gene；eukaryotic expression；MDA-MB-231 cell line

R 655.8

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.12.010

2015-05-20）

210008 江蘇省南京市，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院普外科（姚樂申，袁毅路）；210009江蘇省南京市，江蘇省疾病預(yù)防控制中心（李燕）；210006江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）腫瘤科

張保國，Email：emily88127@126.com