王開萍，李紅衛(wèi)，吳　娛，唐正江，湯　飛，劉國慶（合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽合肥230009）

米曲霉As-W6脂肪酶的分離純化及酶學性質研究

王開萍，李紅衛(wèi)，吳娛，唐正江，湯飛，劉國慶*
（合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽合肥230009）

米曲霉As-W6的脂肪酶發(fā)酵上清液經硫酸銨分級沉淀、透析、DEAE-52纖維素離子交換層析和Sephadex G-75葡聚糖凝膠過濾層析純化后得到電泳純的脂肪酶，純化倍數(shù)為86.7倍，回收率為23.2%，相對分子質量為40.8 ku，酶學性質研究結果表明，該脂肪酶最適反應溫度和最適pH分別為40℃和7，在40℃以下和pH6～8之間有較好的穩(wěn)定性；Ca2+、Mg2+和丙酮能夠明顯促進提高脂肪酶的活性，而Cu2+、Fe2+、Mn2+和SDS對其有顯著抑制作用；當大豆油作為底物時該脂肪酶的酶活力最高，表明其對大豆油具有顯著的特異性。

米曲霉，脂肪酶，分離純化，酶學性質

脂肪酶（acylglycerol hydrolases，EC 3.1.1.3）是一類能催化水解脂肪酸和油脂為甘油和游離脂肪酸的生物催化劑，廣泛存于動物、植物各種組織和微生物中［1］。脂肪酶因具有巨大的生理意義和工業(yè)應用范圍而受到廣泛關注，近年來，脂肪酶已廣泛應用于食品、藥品、化妝品、洗滌劑、制革、有機合成等行業(yè)［2］。生物來源的脂肪酶具有比動植物更廣的作用pH、作用溫度范圍，以及底物專一性，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源［3］。最常用的脂肪酶生產菌有曲霉、根霉、毛霉、青霉菌屬等［4-6］。米曲霉是脂肪酶生產者之一，且米曲霉脂肪酶具有良好的生物安全性，因而被廣泛應用在脂肪酶生產行業(yè)或其他相關行業(yè)［7-8］。Aspergillus oryzae As-W6是本實驗室篩選保存的一株產脂肪酶菌，產酶量高，培養(yǎng)要求簡單，可進行大批量生產，國內外有關米曲霉產脂肪酶的研究相對較少，文獻報道的米曲霉所產脂肪酶的溫度、pH作用范圍不大，穩(wěn)定性不高［9-10］。本文對該米曲霉脂肪酶的分離純化進行研究，提供了一種有關脂肪酶分離純化的方法，該脂肪酶具有良好的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定范圍，其具有良好的工業(yè)應用前景。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

Aspergillus oryzae As-W6本實驗室選育保存菌種；DEAE纖維素、Sephadex G-75葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺Marker Sigma公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒上海碧云天生物技術有限公司；硫酸銨、甲醇、乙醇、丙醇、聚乙烯醇、橄欖油國藥化學試劑有限公司，分析純。

SW-CJ-1D型超凈工作臺蘇州凈化有限公司；SPX-150B型生化恒溫培養(yǎng)箱上海博泰實驗設備有限公司；752型紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；SYQ-DSX-280B型高壓滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-92B型搖床上海博泰實驗設備有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市杰瑞爾電氣有限公司；TDL-50B型臺式離心機上海安亭科學儀器廠；SBE-6003型電泳儀上海博彩生物技術有限公司；GmbH紫外凝膠成像系統(tǒng)美國Biostep公司。

1.2脂肪酶的發(fā)酵生產與制備

脂肪酶的發(fā)酵生產參照陳林林等［11］的報道。菌種在PDA培養(yǎng)基上活化后，用無菌水制成孢子懸浮液，每毫升含105～106個孢子。按2%的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基（酵母浸膏1%，葡萄糖1%，（NH4）2SO40.1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，KCl 0.05%，NaNO30.05%，橄欖油乳化液4%）中，在32℃，180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)72 h。

1.3脂肪酶酶活的測定

脂肪酶酶活的測定采用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解滴定法［12］。酶活力單位定義：在40℃，pH7.0條件下水解橄欖油乳化液，每分鐘產生1 μmol游離脂肪酸所需要的酶量，即為1個脂肪酶活力單位（1U）。

1.4蛋白質含量的測定

蛋白質含量的測定采用Bradford法［13］測定，用牛血清蛋白（BSA）作為標準蛋白。

1.5脂肪酶的分離純化

1.5.1硫酸銨沉淀參考舒正玉等［14］的方法加以改進，將發(fā)酵液用雙層紗布過濾后，4℃，12000 r/min離心20 min得到發(fā)酵上清液，用0.45 mm的微孔濾膜過濾上清液除去橄欖油。收集濾液，將其作為酶液的粗提取，酶活被定義為100%，用來計算純化過程中的回收率，回收率=每步總活力/原液總活力，比活力=總活力/總蛋白。先將粗酶液中加入硫酸銨細粉末至30%飽和度，去除雜蛋白沉淀，再向上清液中加入硫酸銨細粉末至80%飽和度，離心收集沉淀，透析脫鹽后冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

就在族長即將暴怒時，一個聲音從后方天葬院中傳了出來：“我以天葬師之名，接受你的訴求，為了云浮的未來，敬祈天神！”

1.5.2離子交換層析將上述保存的酶溶解于0.05 mol/L，pH=7的Tris-HCl緩沖液中，然后上樣于裝有DEAE-52纖維素的層析柱中（1.8 cm×100 cm），以0～1.0 mol/L NaCl線性梯度洗脫，洗脫液流速為1.0 mL/min。在280 nm波長下，測定每管洗脫液的酶活力，收集合并有活性部分，真空冷凍干燥。

1.5.3凝膠過濾層析將上一步冷凍干燥的酶粉溶解于0.05 mol/L、pH=7的Tris-HCl緩沖液中，然后上樣于裝有Sephadex G-75葡聚糖凝膠的層析柱中（2.6 cm× 10 cm），以0～1.0 mol/L NaCl線性梯度洗脫，洗脫液流速為1.0 mL/min。按上述方法測定每管洗脫液的酶活性，收集合并有活性部分，真空冷凍干燥。

1.5.4脂肪酶分子量的測定采用聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳法（SDS-PAGE）測定純化酶的分子量，參照1970年Laemmli的方法［15］，根據膠濃度與最佳分離分子量范圍的關系，選取分離膠的濃度為12%，濃縮膠的濃度為5%，用考馬斯亮藍G-250染色。蛋白質標準Marker的分子質量為19～117 ku。

1.6酶學性質研究

1.6.1不同溫度對脂肪酶活性及其穩(wěn)定性的影響將反應體系分別置于在20、30、40、50、60℃的水浴中，分別測定脂肪酶的酶活力，確定最適反應溫度。取同樣濃度的脂肪酶分別置于20、25、30、35、40、45、50、55、60℃的水浴中保溫4 h，每隔1 h取樣測定殘留酶活，用未經處理的酶液的酶活為100%。

1.6.2不同pH對脂肪酶活性及其穩(wěn)定性的影響將酶液分別與等量的pH4～10的系列緩沖液混合，測定脂肪酶的酶活。系列緩沖液為：50 mmol/L醋酸鹽緩沖液（pH4～5），50 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH5～6），50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH6～8），50 mmol/L Tris緩沖液（pH8～9），50 mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9～10）。脂肪酶在pH4～10條件下分別在40℃保溫1 h后，測定脂肪酶殘留酶活，以最適條件下的酶活為100%。

1.6.3不同金屬離子對脂肪酶活性的影響在測酶活反應體系中，分別加入終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L的Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Mn2金屬鹽離子，陰離子均為氯離子，30℃下放置30 min，分別測定脂肪酶的殘留酶活，以不加金屬離子的酶液作對照（100%）。

1.6.4不同有機溶劑對脂肪酶活性的影響將甲醇、乙醇、丙酮、EDTA、SDS、Tween-80 6種有機溶劑分別按1%、5%的量加入酶反應體系，然后反應30 min，分別測定脂肪酶的殘留酶活，以未加入有機溶劑的酶液作為對照組（100%）。

1.6.5脂肪酶對不同底物的水解特異性參照Rigo等［16］的方法測定脂肪酶對不同底物的水解特異性，將橄欖油、大豆油、棕櫚油、丁酸甲酯、辛酸甲酯、月桂酸甲酯、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯作為脂肪酶水解反應的底物，分別測定脂肪酶的酶活，以橄欖油為底物測得的酶活為100%。

2　結果與分析

2.1脂肪酶的純化

牛血清蛋白標準曲線如圖1所示，y=5.93x-0.01，R2=0.9978，蛋白質濃度和吸光度呈良好的線性相關，根據標準曲線計算樣品蛋白的含量。經硫酸銨分級沉淀、DEAE-52纖維素陰離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過濾層析純化后，脂肪酶蛋白純化了86.7倍，回收率為23.2%，比活力為528.7。其中Sephadex G-75凝膠過濾層析效果最佳，這一步純化了6.9倍，純化結果見表1。采用聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳法（SDS-PAGE）測定純化酶的分子量，結果見圖2，圖中第1列為蛋白質標準Marker，第2列為粗酶液；第3列為純酶。從圖2中可以看出，第2列的粗酶液電泳所得的條帶不止一條，除目標酶外還有三條顏色和清晰度均比較暗的條帶，而純化后的酶的條帶如第3列所示，呈現(xiàn)明亮清晰的單一條帶，目標蛋白位于34～49 ku之間，這說明目標脂肪酶得到了較好的純化，回收率較高。通過Quantity One軟件對凝膠圖像分析計算，得出目標脂肪酶蛋白的分子量約為40.8 ku。

表1　米曲霉脂肪酶的純化Table 1　Purification of lipase from Aspergillus oryzae As-W.6

圖1　牛血清蛋白標準曲線Fig.1　The standard curve of BSA

圖2　米曲霉脂肪酶的SDS-PAGE凝膠電泳分析圖Fig.2　SDS-PAGE analysis of lipase

2.2米曲霉脂肪酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

在20～60℃下分別測定脂肪酶的酶活力，結果見圖3，酶的最適反應溫度為40℃，在溫度不高于40℃時，酶活力隨溫度的升高而增加，當溫度高于40℃時，酶活力會隨著溫度的升高而降低，當溫度達到60℃時，酶活力僅為最適反應溫度酶活力的8.6%。從圖4中可以看出，該酶在35℃下保溫4 h后還有83.2%的殘余酶活，所以該酶在25～35℃具有較好的穩(wěn)定性。

圖3　溫度對脂肪酶酶活力的影響Fig.3　Effect of temperature on enzyme activity

圖4　脂肪酶的溫度穩(wěn)定性Fig.4　Heat stability of lipase

2.3脂肪酶的最適pH和pH穩(wěn)定性

由圖5可知，脂肪酶作用的最適pH為7，且在pH在6～7.5范圍內，酶活力均在80%以上。將脂肪酶酶液加入上述不同pH的緩沖液中，在40℃下保溫1 h后測定脂肪酶酶活，結果見圖5。觀察酶的pH穩(wěn)定性曲線可知，在1 h的保溫時間內，在pH＜7時，pH的穩(wěn)定性會隨著pH的增大而增強；在pH＞7時，pH的穩(wěn)定性會隨著pH的增大而減弱。在pH=4時保溫1 h后，酶活力為保溫前的酶活力的32.5%，但是在pH=10時保溫1 h后，酶活力僅為保溫前的酶活力的28.7%。由以上可知，該脂肪酶的最適反應pH為7，在pH 6～8時有較高的活力且在保溫1 h后能保存70%以上的酶活。

圖5　pH對脂肪酶的酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.5　Effect of pH on enzyme activity and stability

2.4金屬離子對脂肪酶活性的影響

如圖6所示，在常見的幾種二價金屬離子中，濃度為1 mmol/L的Ca2+、Mg2+和Zn2+均能夠激活酶的活性，金屬離子濃度增加為5 mmol/L時，Ca2+、Mg2+對酶活性的激活性降低，而Zn2+則抑制酶的活性，Cu2+、Fe2+、Mn2+對酶活性的抑制作用增強，這可能是由于金屬離子濃度升高對酶活性起抑制作用。不同金屬離子對酶活力的影響不同，其中Cu2+、Fe2+對酶活力的抑制作用極強，Mn2+對酶活力也有抑制作用。此外，酶活力會隨著幾種金屬離子濃度的增加均有所降低。因此，可以選擇適當濃度的Ca2+、Mg2+作為該酶的活化劑，提高該脂肪酶的活力。

圖6　不同金屬離子對脂肪酶活性的影響Fig.6　Effect of various metal ions on enzyme activity

2.5有機溶劑對脂肪酶活性的影響

如圖7所示，在常見的幾種有機溶劑中，甲醇（1%）、丙醇（1%）和Tween-80（1%）能夠進一步激活酶的活性，而乙醇、SDS和EDTA則抑制酶的活性。不同濃度的有機溶劑對酶活力的影響不同，但當濃度為5%時，這6種有機溶劑均對酶的活性起抑制作用。和金屬離子相比，有機溶劑對酶活力的影響較小。由此可知，該脂肪酶是一種金屬酶，金屬離子對酶活的影響非常明顯。

圖7　不同有機溶劑對酶活的影響Fig.7　Effect of various organic solvents on enzyme activity

2.6脂肪酶對不同底物的水解特異性

從圖8中可以看出，該脂肪酶對植物油的水解酶活力明顯高于幾種甲酯酸，其中大豆油表現(xiàn)最為明顯的特異性。在5種甲酯酸中，該脂肪酶對C12、C16、C18顯現(xiàn)出較高的酶活力，其中在C12時達到最高酶活力，這表明該脂肪酶對于長鏈甲酯酸表現(xiàn)出較好的水解酶活力，這與Rigo報道的從青霉菌（Penicillium crustosum）中純化得到的脂肪酶的性質相似［16］。

圖8　脂肪酶水解不同底物的特異性Fig.8　Substrate specificity of enzyme

3　結論

Aspergillus oryzae As-W6的脂肪酶發(fā)酵上清液經硫酸銨分級沉淀、透析、DEAE-52纖維素離子交換層析和Sephadex G-75葡聚糖凝膠過濾層析純化后得到電泳純的脂肪酶，SDS-PAGE電泳結果分析計算出其相對分子質量為40.8 ku，該脂肪酶的最適反應溫度和最適反應pH分別為40℃和7，在40℃以下和pH6～8之間具有較好的穩(wěn)定性。該脂肪酶的酶學性質研究結果表明，Ca2+、Mg2+和丙酮能夠明顯促進提高脂肪酶的活性，其中Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%，而Cu2+、Fe2+、Mn2+和SDS對其具有明顯的抑制作用；此外該脂肪酶對大豆油表現(xiàn)出顯著的特異性。

［1］王穎，陳吉祥，王冰，等.熱穩(wěn)定性脂肪酶生產菌的篩選及其酶學性質研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（19）：156-161.

［2］Treichel H，Oliveira D，Marcio A，et al.A Review on Microbial Lipases Production［J］.Food Bioprocess Tech，2010，3（2）：182-196.

［3］徐巖，李建波，王棟.解脂假絲酵母脂肪酶的純化及性質研究［J］.無錫輕工大學學報，2001，20（6）：257-260.

［4］Godtfredsen SE.Microbial lipases［M］.Microbial Enzymes and Biotechnology，1990：255-274.

［5］Ghosh PK，Saxena RK，Gupta R，et al.Microbial lipases：production and applications［J］.Sci Prog，1996，79：119-157.

［6］Rubin B，Dennis EA.Methods in Enzymology：Lipases，Part B：Enzyme Characterization and Utilization［M］.Maryland Heights：Academic Press，1997：509-519.

［7］El-Atta H A，Aref I M，Khalil S A.Increased gum Arabic production after infestation of Acacia Senegal with Aspergillus flavus and Pseudomon pseudoalcaligenes Transmitted by Agrilus nubeculosus［J］.Biotechnol，2011，10：159-166.

［8］Elbashiti T，F(xiàn)ayyad A，Elkichaoui A.Isolation and identification of Aspergillus oryzae and the production of soy sauce with new aroma［J］.Pak J Nutr，2010，9：1171-1175.

［9］Contesini FJ，Lopes DB，Macedo GA，et al.Aspergillus sp.［10］Jing Zhou，Wen-Wei Chen，Zheng-Bao Jia，et al.Purification and Characterization of Lipase Produced by Aspergillus oryzae CJLU-31 Isolated from Waste Cooking Oily Soil［J］.Am J Food Technol，2012，7（10）：596-608.

lipase：Potential biocatalyst for industrial use［J］.J Mol Catal B：Enzym，2010，67：163-171.

［11］陳林林，辛嘉英，張穎鑫，等.粗狀假絲酵母產脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2010（1）：183-185.

［12］何耀強，王炳武，譚天偉.假絲酵母99-125脂肪酶的發(fā)酵工藝研究［J］.生物工程學報，2004，20（6）：918-921.

［13］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72：248-254.

［14］舒正玉，楊江科，閆云君.黑曲霉F044脂肪酶的分離純化及酶學性質研究［J］.生物工程學報，2007，23（1）：96-100.

［15］Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nat，1970，227：680-685.

［16］Rigo E，Ninow JL，Tsai SM，et al.Preliminary characterization of novel extra-cellular lipase from Penicillium crustosum under solid-statefermentationanditspotentialapplicationfor triglycerides hydrolysis［J］.Food Bioprocess Technol，2012，5：1592-1600.

Study on purification and characterization of a lipase from Aspergillus oryzae As-W6

WANG Kai-ping，LI Hong-wei，WU Yu，TANG Zheng-jiang，TANG Fei，LIU Guo-qing*
（College of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

A lipase from Aspergillus oryzae As-W6 was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation，dialysis，DEAE-52 cellulose column anion exchange chromatography and Sephadex G-75 gel filtration chromatography.The purification protocol resulted in a 86.7-fold purification with a yield of 23.2%，the relative molecular weight of the purified lipase was 40.8 ku.The optimum temperature and pH of the purified lipase was 40℃and 7，respectively.The lipase was stable over ranges of pH（6～8）and under the temperature 40℃. The lipase activity was enhanced by Ca2+，Mg2+and Acetone，while inhibited by Cu2+，F(xiàn)e2+，Mn2+and SDS.It achieved maximum values when soybean oil used as substrate，which indicated that the lipase showed a significant specificity toward soybean oil.

Aspergillus oryzae；lipase；purification；properties

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0229-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.037

2014－11－14

王開萍（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail：paigewang0919@163.com。

劉國慶（1963-），男，博士，教授，研究方向：食品質量與安全，動物營養(yǎng)研究，E-mail：liugq_168@163.com。

安徽省皖江禽產業(yè)研究院基金項目（1401c063015）。