劉　　艷，段振華，2，*，羅　　偉，胡冰洋（.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228；2.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70228）

無花果蛋白酶酶解牡蠣肉的工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

劉艷1，段振華1，2，*，羅偉1，胡冰洋1
（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228；2.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70228）

研究無花果蛋白酶酶解牡蠣肉的工藝優(yōu)化及其抗氧化活性，以氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率為指標(biāo)進(jìn)行單因素和正交實(shí)驗(yàn)，研究酶解時(shí)間、酶解溫度、酶量、pH對(duì)氨基酸態(tài)氮含量和抗氧化活性的影響。正交實(shí)驗(yàn)確定牡蠣酶解的最佳工藝條件為：酶量5.5%，酶解溫度50℃，pH6.0，酶解時(shí)間3.5 h。此工藝條件下，牡蠣酶解液氨基酸態(tài)氮的含量為0.181 g/100 mL，DPPH·清除率達(dá)71.80%，還原力為0.813，·OH清除率為16.19%，牡蠣酶解液具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

牡蠣肉，抗氧化性，無花果蛋白酶，酶解

牡蠣（Oyster）在我國(guó)粵、閩稱蠔或蚵，江、浙稱蠣黃，山東以北稱蠣子或海蠣子。世界上已發(fā)現(xiàn)牡蠣有100種左右，是世界上第一大養(yǎng)殖貝類，也是我國(guó)四大養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一。在我國(guó)沿海分布的牡蠣約有20多種，主要有近江牡蠣（Crassostrea rivularis）、褶牡蠣（Crossostrea plicatula）、太平洋牡蠣/長(zhǎng)牡蠣（Crassostreagigas）、大連灣牡蠣（Crassostrea talienwhanensis）及密鱗牡蠣（Ostrea denselamellosa）［1］。牡蠣軟體含有豐富的糖原、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、微量元素和維生素等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為牡蠣具有如下功效：抑菌［2］、抗氧化［3］、抗腫瘤［4］、抗病毒［5］、抗高血壓［6］等作用。

牡蠣蛋白質(zhì)水解后生成許多小分子肽和氨基酸，不僅有利于人體吸收，提高蛋白質(zhì)的利用率，而且還能提取出豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和功能活性物質(zhì)。目前主要集中在牡蠣蛋白酶解制備ACE抑制肽［7］、抗腫瘤活性肽［8］、呈味肽［9］、抗菌肽［10］、抗氧化肽［11］、營(yíng)養(yǎng)口服液［12］等方面的研究。文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用于牡蠣加工的蛋白酶主要有：胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶［13］、枯草桿菌蛋白酶［14］等。無花果蛋白酶作為一種酶制劑，具有巰基蛋白酶的特性，有較強(qiáng)的蛋白水解能力，能作用于各種蛋白的純天然物質(zhì)，對(duì)豬肉、鯽魚肉、雞蛋白等食用蛋白都具有水解能力［15］。而無花果蛋白酶用于牡蠣肉酶解方面還未曾有過報(bào)道。本文用無花果蛋白酶酶解牡蠣肉，以酶解液的抗氧化性和氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，研究牡蠣肉酶解的最佳工藝，以求獲得具有較高氨基酸態(tài)氮含量和抗氧化活性的牡蠣酶解液，為牡蠣抗氧化肽的開發(fā)利用和無花果蛋白酶的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）?？谑醒亟髀忿r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，去殼后高速勻漿，并分裝置于-20℃冰箱中備用；無花果蛋白酶（8.0× 105U/g）河南百盛化工產(chǎn)品有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、鐵氰化鉀、H2O2、三氯乙酸、三氯化鐵國(guó)產(chǎn)分析純。

HH-S26S電熱恒溫水浴鍋金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；85-1型恒溫磁力攪拌器金壇市富華儀器有限公司；EL204型電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)上海偉業(yè)儀器廠；TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；722型可見分光光度計(jì)上海奧譜勒儀器有限公司；JJ-2型組織搗碎機(jī)常州澳華儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酶解方法稱取10.0 g牡蠣肉漿置于100 mL錐形瓶中，按比例1∶2（m/V）加入20.0 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH，加入無花果蛋白酶后在一定溫度下對(duì)牡蠣肉漿進(jìn)行酶解，并每隔20 min攪拌一次，酶解一段時(shí)間后，沸水浴滅酶10 min后冷卻，再以4000 r/min離心25 min后取上清液，測(cè)其氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)用無花果蛋白酶酶解牡蠣肉制備牡蠣酶解液，分別以酶解溫度、酶解時(shí)間、酶量、pH為因素，每個(gè)因素取5個(gè)水平，單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為：酶量（3%、4%、5%、6%、7%）、溫度（45、50、55、60、65℃）、酶解時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0），以氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率作為牡蠣酶解液的考察指標(biāo)，以酶解時(shí)間3.0 h、pH6.0、酶解溫度55℃加酶量5%為基本條件，每次以一個(gè)因子為變量，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3正交實(shí)驗(yàn)以氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率為指標(biāo)，以酶量、酶解溫度、pH、酶解時(shí)間為因素，采用四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)L9（34），見表1。在正交實(shí)驗(yàn)中，牡蠣酶解液稀釋10倍后進(jìn)行DPPH·清除率測(cè)定，牡蠣酶解液稀釋5倍后進(jìn)行·OH清除率和還原力測(cè)定。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 1　Orthogonal test factors and levels table

1.2.4氨基酸態(tài)氮測(cè)定采用中性甲醛電位滴定法［16-17］。

1.2.5DPPH·清除率的測(cè)定取牡蠣酶解液2 mL，加入2×10-4mol/L DPPH溶液2 mL，混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm下測(cè)定吸光度Ai，空白組以等體積無水乙醇溶液代替DPPH溶液，對(duì)照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調(diào)零［18］，平行測(cè)3次取平均值。

清除率計(jì)算公式：

式中：A0為對(duì)照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度。

1.2.6 ·OH清除率的測(cè)定采用Fenton反應(yīng)后遇水楊酸可生成有色物質(zhì)的特點(diǎn)來研究酶解液對(duì)·OH的清除能力。向不同試管中加入樣液和4.5 mmol/L水楊酸、4.5 mmol/L FeSO4、4.4 mmol/L H2O2各1.0 mL，37℃下恒溫反應(yīng)30 min后，在510 nm處測(cè)其吸光度［19］，平行測(cè)3次取平均值。

清除率計(jì)算公式：

其中，A0為空白對(duì)照；Ai為含水楊酸時(shí)樣品液的吸光度值；Aj為不含水楊酸時(shí)樣品液的吸光度值。

1.2.7還原力的測(cè)定取酶解液1.0 mL，然后加入0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH6.6）溶液1.0 mL和1%的鐵氰化鉀溶液1.0 mL于試管中混勻?；旌衔镌?0℃水浴中反應(yīng)20 min后急速冷卻，并加入10%的三氯乙酸（TCA）1.0 mL，混勻后以4000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.0 mL及0.1%的三氯化鐵溶液0.5 mL混勻靜置10 min，以蒸餾水為空白調(diào)零，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［20-21］，以吸光度表示還原能力大小，吸光度越大，樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.2.8數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)定三個(gè)平行，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示，并運(yùn)用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ和Origin 8.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。

2　結(jié)果與分析

2.1不同酶量對(duì)牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響

不同酶量下無花果蛋白酶酶解牡蠣肉的效果見圖1。從圖1可知，隨著酶量的增加，氨基酸態(tài)氮含量增加較快，酶用量低于5%時(shí)，底物能被酶作用的位點(diǎn)過量，氨基態(tài)氮含量隨酶用量的增加而逐漸升高；而當(dāng)酶量超過5%時(shí)，由于無花果蛋白酶與底物逐漸達(dá)到飽和，導(dǎo)致氨基態(tài)氮含量增幅很小。隨著酶量的增加，DPPH·清除率呈先升后降再趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。酶量在3%～5%的范圍內(nèi)，牡蠣肉酶解產(chǎn)生較多的抗氧化肽，DPPH·清除率增加最快；當(dāng)加酶量大于5%，酶濃度已逐漸被底物飽和，DPPH·清除率稍有下降后趨于平穩(wěn)，清除率下降可能是水解過度導(dǎo)致肽的進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成游離氨基酸導(dǎo)致的。因此無花果蛋白酶添加量取5%為宜。

圖1　酶量對(duì)牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響Fig.1　The effect of enzyme dosage on amino acid-nitrogen and DPPH radical scavenging activity

2.2酶解溫度對(duì)牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響

采用無花果蛋白酶在不同溫度下酶解牡蠣肉，溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著溫度升高，氨基態(tài)氮含量呈先升后降的趨勢(shì)。溫度過低，不利于無花果蛋白酶的作用，溫度過高，無花果蛋白酶的活力下降甚至失活。在45～55℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶對(duì)底物的水解能力增加，氨基酸態(tài)氮含量不斷增加；55℃時(shí)氨基態(tài)氮含量達(dá)到最大值；但酶是一種活性蛋白，當(dāng)超過55℃時(shí)，無花果蛋白酶的活力不斷下降，致使水解能力下降，從而氨基酸態(tài)氮含量急劇下降。DPPH·清除率也呈先升后降的趨勢(shì)，45～55℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶解產(chǎn)生更多的抗氧化肽；在55℃時(shí)產(chǎn)生的抗氧化肽最多，從而DPPH·清除率達(dá)到最大；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，無花果蛋白酶活力下降，酶解產(chǎn)生抗氧化肽的量有限，且溫度較高，會(huì)降低抗氧化肽的活性，從而導(dǎo)致DPPH·清除率下降。因此，無花果蛋白酶的酶解最適溫度在55℃左右。

圖2　酶解溫度對(duì)牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響Fig.2　The effect of temperature on amino acid-nitrogen and DPPH radical scavenging activity

2.3pH對(duì)牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響

pH對(duì)無花果蛋白酶水解效果的影響見圖3。圖3表明，隨著酶解pH升高，氨基態(tài)氮含量呈先增后降的趨勢(shì)，當(dāng)pH達(dá)到6.0左右時(shí)，酶解液中氨基態(tài)氮含量達(dá)到最大值，這是因?yàn)閜H會(huì)直接影響酶及蛋白質(zhì)分子的某些解離基團(tuán)的解離狀態(tài)。只有在特定pH條件下，酶及底物蛋白質(zhì)的解離基團(tuán)才能處于易于結(jié)合并轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的解離狀態(tài)［22］。隨著pH的增加，DPPH·清除率呈先升后降的趨勢(shì)，pH影響酶的生物活性，pH也會(huì)直接影響蛋白質(zhì)分子的某些解離基團(tuán)的解離狀態(tài)，酶解液中的抗氧化肽可能受pH影響，解離狀態(tài)發(fā)生變化，從而使其抗氧化活性降低。因此選擇pH6.0為單因素最適pH。

圖3　pH對(duì)牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響Fig.3　The effect of pH on amino acid-nitrogen and DPPH radical scavenging activity

2.4酶解時(shí)間對(duì)牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響

酶解時(shí)間對(duì)牡蠣肉無花果蛋白酶水解效果的影響見圖4。由圖4可看出，在初期的3 h內(nèi)酶解反應(yīng)迅速，當(dāng)水解進(jìn)行3 h左右時(shí)氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大值；隨著時(shí)間的增加，無花果蛋白酶逐漸消耗，酶解能力有限，氨基態(tài)氮含量變化不明顯。隨著時(shí)間的增加，DPPH·清除率呈先升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間為1～3 h時(shí)，DPPH·清除率上升最快；當(dāng)酶解時(shí)間大于3 h，DPPH·清除率上升較少，酶解時(shí)間過長(zhǎng)將增加多肽水解成氨基酸的可能，失去了清除自由基的能力［23］。因而酶解時(shí)間3 h最適宜。

圖4　酶解時(shí)間對(duì)牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響Fig.4　The effect of time on amino acid-nitrogen and DPPH radical scavenging activity

2.5正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及其分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平值，以氨基酸態(tài)氮和DPPH·的清除率為檢測(cè)指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化各因素組合。正交實(shí)驗(yàn)因素水平與直觀分析表，見表2。

表2　正交實(shí)驗(yàn)因素水平與直觀分析表Table 2　The orthogonal factors，level and intuitive analysis table

運(yùn)用極差分析法對(duì)正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析。由表2極差R1和R2可知，酶量、酶解溫度、時(shí)間、pH對(duì)牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮和DPPH·清除率都有影響，但是影響程度不同。其中酶解時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響最大，其次是酶解溫度、酶量，pH影響最小，以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)的最佳酶解工藝為A3B1C1D3。酶解溫度對(duì)DPPH·清除率的影響最大，其次是pH、酶解時(shí)間，酶量影響最小，以DPPH·清除率為指標(biāo)的最佳工藝為A3B1C2D2?？紤]氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率對(duì)牡蠣肉酶解效果的影響，根據(jù)各因素對(duì)各個(gè)指標(biāo)的影響大小，pH對(duì)DPPH·清除率影響較大，而對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響最小，所以選擇pH為6.0；酶解時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響最大，而對(duì)DPPH·清除率影響較小，故選擇3.5 h。

因此，為達(dá)到具有較高氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的牡蠣酶解液這一目標(biāo)，綜合考慮這兩項(xiàng)指標(biāo)，無花果蛋白酶酶解牡蠣肉的最佳工藝為：A3B1C2D3，即酶量為5.5%，酶解溫度50℃，pH6.0，酶解時(shí)間3.5 h。

2.6牡蠣肉酶解最佳條件驗(yàn)證

按照正交實(shí)驗(yàn)所得的最佳因素水平組合A3B1C2D3進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)定酶解液的氨基酸態(tài)氮含量、DPPH·清除率、·OH清除率和還原力，結(jié)果見表3。

表3　牡蠣肉酶解液的各項(xiàng)指標(biāo)Table 3　The indicators of oyster meat hydrolysates

由表3可知，所得酶解液氨基酸態(tài)氮的含量為0.181 g/100 mL、DPPH·清除率為71.80%，都明顯地高于正交組合所得到的數(shù)據(jù)，說明該正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)具有可行性，能夠有效提高牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率。羥自由基是最活潑的一種活性分子，是已知最強(qiáng)的氧化劑，進(jìn)攻性極強(qiáng)，它幾乎可以和所有細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，對(duì)機(jī)體危害極大［24］，牡蠣酶解液能夠清除羥自由基，證明其具有抗氧化活性。牡蠣酶解液顯示出較強(qiáng)的還原能力，而還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)，也證明酶解液的抗氧化活性。

3　結(jié)論

無花果蛋白酶酶解牡蠣肉的最佳工藝條件為酶量5.5%，酶解溫度50℃，pH6.0，酶解時(shí)間3.5 h。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到在此條件下制備的酶解液，其氨基酸態(tài)氮的含量為0.181 g/100 mL、DPPH·清除率達(dá)到71.80%，·OH清除率為16.19%，還原力達(dá)0.813。對(duì)牡蠣酶解液的DPPH·清除率、·OH清除率和還原力的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，牡蠣酶解液對(duì)DPPH·和·OH均有較好的清除能力，且還原性較強(qiáng)，具有良好的體外抗氧化活性，但由于酶解液成分較復(fù)雜，抗氧化肽的分離、提純及抗氧化肽的分子量大小和結(jié)構(gòu)對(duì)抗氧化活性的影響還需要進(jìn)一步研究。

運(yùn)用無花果蛋白酶酶解牡蠣肉，制備牡蠣酶解液具有重要的意義，該酶解液呈亮黃色，澄清透明，味道鮮美，具有較高的抗氧化活性，這對(duì)無花果蛋白酶的應(yīng)用、牡蠣抗氧化肽精深加工和功能性產(chǎn)品開發(fā)都具有重要的實(shí)際意義。

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Study on enzymatic hydrolysis technology of oyster meat by ficus and its antioxidant activity

LIU Yan1，DUAN Zhen-hua1，2，*，LUO Wei1，HU Bing-yang1
（1.College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China；2.Key Laboratory of Tropical Biological Resources，Ministry of Education，Hainan University，Haikou 570228，China）

The enzymatic hydrolysis technology of oyster meat by ficus and its antioxidant activity were studied in this paper.The effects of pH，temperature，time and enzyme dosage on the hydrolysis were investigated by single-factor and orthogonal tests.The hydrolyzate indicators of single-factor tests and orthogonal tests were DPPH radical scavenging activity and the amino acid-nitrogen content.The optimal hydrolysis conditions of oyster meat by ficus were enzyme dosage 5.5%，hydrolysis temperature 50℃，pH6.0 and time 3.5 h.Under such conditions，the content of amino acid-nitrogen reached 0.181 g/100 mL，DPPH radical scavenging rate up to 71.80%，reducing power was 0.813 and hydroxyl radical scavenging rate reached 16.19%.The hydrolysates exhibited higher antioxidant activities.

oyster meat；antioxidant activity；ficus；enzymatic hydrolysis

TS254.4

A

1002-0306（2015）18-0182-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.028

2014－12－01

劉艷（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品食品科學(xué)技術(shù)，E-mail：liuyan130832@126.com。

段振華（1965-），男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品食品科學(xué)技術(shù)，E-mail：dzh65@163.com。

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃（2013BAB01B04）；海南省科技興海專項(xiàng)（XH201308）。