薛榮濤，李翠芹，何臘平，4，*，陳昌勇，宋小娟，王　　猛（.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽550025；4.貴州省豬肉制品工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽550025）

產(chǎn)米渣蛋白水解酶菌株的篩選及鑒定

薛榮濤1，2，李翠芹3，何臘平1，2，4，*，陳昌勇1，2，宋小娟1，2，王猛1
（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；3.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽550025；4.貴州省豬肉制品工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽550025）

篩選產(chǎn)米渣蛋白水解酶菌株以促進(jìn)米渣的綠色開發(fā)及充分利用。采用酪蛋白平板法從富含蛋白的樣品初篩到115株產(chǎn)蛋白酶菌株。初篩菌株以米渣為唯一碳、氮源經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，通過復(fù)篩以分析其所產(chǎn)的蛋白酶，從豆豉中獲得一株產(chǎn)米渣蛋白水解酶的目標(biāo)菌株HP60。該菌株的粗酶活和對(duì)米渣蛋白的水解度分別達(dá)（263±7）U/mL和15.63%± 0.30%。通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征（API 20 NE，Biolog GP）及16S rRNA序列分析，鑒定HP60為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），并已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)：CCTCC NO.M 2014200。本研究篩選的Bacillus amyloliquefaciens HP60對(duì)米渣蛋白的微生物開發(fā)奠定了一定基礎(chǔ)。

米渣蛋白，產(chǎn)蛋白酶，篩選，鑒定，解淀粉芽孢桿菌

米渣是以早秈米、陳化米等為原料生產(chǎn)糖漿、藥品等過程中過濾掉米漿剩下的殘?jiān)瑑r(jià)格低廉，在淀粉糖的生產(chǎn)中每消耗7噸大米就產(chǎn)生1噸米渣［1］。這些米渣主要以干粉形式作為動(dòng)物飼料［2］。而米渣中蛋白含量約40%～70%，且被公認(rèn)為糧食蛋白中的最佳者［2-3］。若將這些蛋白轉(zhuǎn)化成高附加值的多肽和氨基酸，對(duì)提高其生物效價(jià)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和我國稻谷深加工的技術(shù)含量都有重要意義。米渣轉(zhuǎn)化成多肽和氨基酸常用酸或商品蛋白酶。酸法水解迅速、徹底，但其在極端溫度和pH下進(jìn)行，對(duì)氨基酸、蛋白質(zhì)破壞嚴(yán)重，能與原料中油脂生成有毒和致癌的氯丙醇類物質(zhì)，污染環(huán)境［4］。相比之下，蛋白酶避免了上述缺點(diǎn)，還能提高其理化功能和感官特性，綠色安全，并廣泛用于食品、洗滌劑、藥物及皮革業(yè)等，占酶市場60%左右［5-6］?？墒?，就酶得來源而言，與植物和動(dòng)物源的蛋白酶相比，微生物蛋白酶具有多樣的催化活性、較大的pH作用范圍和很好的溫度穩(wěn)定性［7］，并且在工業(yè)用蛋白酶中約2/3源于微生物［8］。能產(chǎn)生蛋白酶的微生物種類繁多，如細(xì)菌、真菌、酵母及放線菌［9］。但目前米渣的利用主要用于商品蛋白酶，其不足有以下幾點(diǎn)：a由于酶的專一性，須使用多種蛋白酶結(jié)合作用于米渣，而不同酶的作用條件又不一樣，導(dǎo)致其活性受環(huán)境影響很大；b由于原料中一些蛋白被淀粉等包裹起來，還需加入糖化酶等釋放出蛋白質(zhì)，使得工藝流程復(fù)雜化；c因酶本身成本和回收成本較高，工業(yè)化應(yīng)用于米渣成本高。相反，產(chǎn)酶菌株直接應(yīng)用于蛋白質(zhì)，因其酶系豐富可充分利用底物；可擴(kuò)大培養(yǎng)制成種子液或凍干菌粉大規(guī)模使用成本較低；在發(fā)酵過程中其酶活較商品酶穩(wěn)定；此外，產(chǎn)蛋白酶菌株直接應(yīng)用于米渣還未見報(bào)道。為此，本文以米渣為底物篩選產(chǎn)米渣蛋白水解酶菌株，以期為微生物代替商品酶利用米渣資源提供理論依據(jù)。此法不僅兼有酶法的優(yōu)點(diǎn)，而且可降低生產(chǎn)成本，可循環(huán)利用，簡單方便。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

23個(gè)分離樣品分別采集于富含蛋白的貴州傳統(tǒng)臘肉、酸肉、發(fā)酵豆制品、酒醅和土壤等；米渣購于山東博興縣曉旭飼料貿(mào)易有限公司；福林酚試劑北京索萊寶科技有限公司；L-tyrosine、Casein、溴化乙錠等美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；富集培養(yǎng)基（g/L） 牛肉膏5，蛋白胨5，米渣5，（NH4）2SO42，K2HPO45，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.1，NaCl 5，pH7；初篩分離培養(yǎng)基（g/L） 牛肉膏5，酪蛋白5，（NH4）2SO42，K2HPO45，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.1，NaCl 5，瓊脂粉20，pH7；細(xì)菌培養(yǎng)基（g/L） 牛肉膏5，蛋白胨1，NaCl 5，瓊脂粉20；種子培養(yǎng)基同細(xì)菌培養(yǎng)基（不加瓊脂粉）；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 米渣15，NaCl 5，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.1，K2HPO45，pH7。

TU-1810PC紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司；HT4-ZDDN-2全自動(dòng)凱氏定氮儀中西遠(yuǎn)大科技有限公司；MB35快速水分測定儀上海奧豪斯儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)上海鴻蓋儀器有限公司；CX21SF1生物顯微鏡奧林巴斯（中國）有限公司；S1000TM Cycler PCR儀等美國Bio-Rad公司。

1.2原料分析

米渣中蛋白質(zhì)、水分、粗脂肪、灰分含量測定參照文獻(xiàn)［10］。

1.3分離樣品處理及富集

稱取5.0 g樣品剪碎后加入到50 mL無菌生理鹽水中，再放入4顆小玻璃珠，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，取5 mL加入富集培養(yǎng)基（250 mL三角瓶裝液量50 mL）中，30℃、180 r/min搖床富集培養(yǎng)24 h。

1.4初篩

取0.2 mL稀釋適當(dāng)梯度的富集懸浮液涂布于初篩分離培養(yǎng)基平板30℃培養(yǎng)。挑取形成透明圈較大的單一菌落，純化后斜面保藏（細(xì)菌培養(yǎng)基）。

1.5復(fù)篩

1.5.1平板孔實(shí)驗(yàn)用打孔器在初篩分離培養(yǎng)基上打孔，每平板均勻打3孔，孔徑為0.40 cm。挑取2環(huán)初篩斜面菌接入種子培養(yǎng)基（250 mL三角瓶裝液量50 mL）中，以30℃、180 r/min培養(yǎng)18 h后，取3 mL種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基（250 mL三角瓶裝液量50 mL），在同樣條件下培養(yǎng)24 h，結(jié)束后4℃、10000×g離心10 min，上清液即粗酶液。取25 μL粗酶液注入平板孔（三孔為一組平行），平板于30℃恒溫培養(yǎng)12 h后，測量水解透明圈直徑（d）。同時(shí)設(shè)置不接菌培養(yǎng)基的離心液注平板孔作為空白對(duì)照，以排除培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。

1.5.2蛋白酶活測定選取d較大的菌株，采用Folin-酚試劑顯色法［11］測定其粗酶液（粗酶液制備同平板孔實(shí)驗(yàn)中粗酶液制備）蛋白酶活力，測定前粗酶液先稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)。酶活力定義為1 mL粗酶液在40℃條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.5.3發(fā)酵液中氨態(tài)氮（amino nitrogen）及米渣蛋白水解度（degree of hydrolysis）測定選取蛋白酶活力較高菌株，按照平板孔實(shí)驗(yàn)中的方法得粗酶液，粗酶液于100℃水浴滅酶5 min后，氨態(tài)氮測定采用甲醛滴定法［12］，米渣蛋白水解度參照pH-stat法［13］。同時(shí)測定不接菌培養(yǎng)基和種子液中的氨態(tài)氮作為空白，通過實(shí)驗(yàn)組扣除原料本身和種子液中含有的氨態(tài)氮即為菌株水解米渣的發(fā)酵液氨態(tài)氮含量。

1.6目標(biāo)菌株鑒定

1.6.1初步鑒定觀察菌落、細(xì)胞形態(tài)和生理生化（API 20NE、Biolog GP）特征，對(duì)菌株進(jìn)行初步分類鑒定［14］。

1.6.2分子鑒定菌株DNA的提取參照Marmur［15］的方法，16S rRNA序列擴(kuò)增引物為細(xì)菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），方法參考Christner B C［16］。純化產(chǎn)物由中國典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）測定其16S rRNA基因序列。測序后獲得的序列登陸http：// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網(wǎng)站與Genbank中已知序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.7數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Origin 8.6，MEGA 5.0作圖分析。

2　結(jié)果與討論

2.1原料組分分析

米渣中水分、粗脂肪、粗蛋白和灰分含量分別為6.46%、2.50%、44.37%、4.10%。

2.2初篩結(jié)果

蛋白酶是水解酶，它可以使酪蛋白分解而在平板上形成水解透明圈來判斷菌株是否產(chǎn)酶。本實(shí)驗(yàn)采用酪蛋白平板法共初篩到115株產(chǎn)蛋白酶菌株，并編號(hào)為HP1～HP115。由于實(shí)驗(yàn)過程平板較多，以篩選的目標(biāo)菌株HP60（篩于豆豉）為例說明實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，圖1是HP60培養(yǎng)18 h后形成的水解圈。

圖1　HP60在酪蛋白平板上的水解圈Fig.1　Hydrolytic zones formed on casein medium of the HP60

2.3復(fù)篩結(jié)果

初篩的115株菌株粗酶液注平板孔培養(yǎng)12 h后，都產(chǎn)生了水解圈且d從1.00～2.80 cm不等，以HP60的平板孔為例，見圖2（A）?？瞻捉M無水解圈見圖2（B），證明水解圈的形成是菌株發(fā)酵米渣所產(chǎn)蛋白酶作用的結(jié)果。選取水解圈d≥2.40 cm的25株產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株測其蛋白酶活。平板孔水解圈d、酶活測定結(jié)果見表1。

圖2　HP60和空白組的平板孔實(shí)驗(yàn)Fig.2　Plate hole tests of the HP60 and control

表1　25株產(chǎn)蛋白酶菌株平板孔實(shí)驗(yàn)及酶活篩選結(jié)果Table 1　The screening results of plate hole tests and protease activities of the 25 protease-producing strains

由表1可知，在選取的25株水解圈d≥2.40 cm的菌株中，菌株HP29、HP34、HP47、HP50、HP60、HP97、HP104、HP105、HP107的d在2.60 cm以上，說明這9株具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力；結(jié)合酶活測定結(jié)果上述9株菌株顯示出高的酶活力，且酶活與水解圈d基本呈正相關(guān)，而HP34、HP47、HP50、HP60、HP104、HP105、HP107，這7株酶活均在190 U/mL以上，其中HP60酶活最高，達(dá)263 U/mL。在相同酶活定義條件下，Ahmed F等［17］采用化學(xué)和物理誘變產(chǎn)蛋白酶菌株并優(yōu)化后最高酶活為120.0 U/mL；也高于Yang等［18］篩選的B.pumilus 156.90 U/mL，B.amyloliquefaciens 198.50 U/mL和B.subtilis 243.60 U/mL，Nisha［19］研究了B.subtilis利用不同的碳源，其中葡萄糖作碳源產(chǎn)酶量最大為199.01 U/mL。因此，菌株HP60具有較高的酶活力。

圖3　上清液氨態(tài)氮及米渣蛋白水解度篩選結(jié)果Fig.3　The screening results of amino nitrogen（AN）in supernatants and degree of hydrolysis（DH）of RDP

酶活在190 U/mL以上的7株菌株AN含量及米渣DH的結(jié)果見圖3?？芍?，菌株HP60對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液中AN及米渣蛋白DH都明顯高于其他菌株，分別為（17.50± 0.35）mg/100mL和15.63%±0.30%，其次為菌株HP47、HP104，而HP34、HP50、HP105和HP107，這4株差別不明顯，其中HP34最低為（10.50±0.50）mg/100mL和9.38%±0.55%。雖然國內(nèi)外有關(guān)商品蛋白酶水解米渣的研究報(bào)道很多，如陳升軍［20］利用商品蛋白酶水解米渣DH為8.97%，郭艷［21］利用木瓜、中性、堿性蛋白酶分別水解米渣，對(duì)應(yīng)DH分別為4.47%、4.61%和16.75%，Li等［22］采用胰蛋白酶水解米渣DH小于9%。但它們對(duì)米渣的DH都不高，并且商品酶工業(yè)化應(yīng)用成本較高。相應(yīng)地，產(chǎn)蛋白酶菌株直接用于米渣的水解報(bào)道非常少，而本文篩選的HP60在未優(yōu)化的條件下，菌株直接水解米渣蛋白DH高于多數(shù)商品蛋白酶，達(dá)到15.63%，這為菌株HP60代替商品蛋白酶用于米渣蛋白的有效利用提供了理論依據(jù)。當(dāng)然，對(duì)HP60菌株水解米渣的條件和產(chǎn)物的研究還有待進(jìn)一步深入。薛榮濤等［23］提出如果利用幾株產(chǎn)酶菌株共同或者分階段發(fā)酵底物，那么底物的水解程度將有望進(jìn)一步提高。因此，研究HP60結(jié)合其他幾株產(chǎn)酶菌株共同或者分階段發(fā)酵米渣也很有必要。

2.4菌株HP60的鑒定

2.4.1初步鑒定結(jié)果HP60菌落呈淡黃色，半透明，圓形或近圓形，邊緣齊整，光滑半濕潤，稍隆起，菌落直徑1.5~3.5 mm，不產(chǎn)生色素（圖4）；菌株呈革蘭氏陽性桿菌（圖5）。

圖4　HP60的菌落形態(tài)Fig.4　Colonial morphology of the HP60

圖5　HP60的顯微鏡觀察照（1600×）Fig.5　Microscope photographs of the HP60（1600×）

經(jīng)API 20 NE，Biolog GP全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，HP60生理生化特征結(jié)果見表2和表3，可知該菌株能夠液化明膠，還原硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚等，經(jīng)軟件比對(duì)，該菌株與芽孢桿菌屬特征接近。根據(jù)以上形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果，菌株HP60初步鑒定屬芽孢桿菌屬。

表2　HP60生理生化特征-碳源利用Table 2　Physiological and biochemical characteristics（utilization of carbon sources）of the HP60

續(xù)表

表3　HP60生理生化特性-酶活、產(chǎn)酸Table 3　Physiological and biochemical characteristics（enzyme activity and acid production）of the HP60

2.4.2分子鑒定結(jié)果菌株HP60基因組DNA的純度和完整性較好適合作PCR擴(kuò)增模板，16S rRNA基因擴(kuò)增片段的長度為1427 bp。將HP60的16S rRNA基因序列登陸NCBI數(shù)據(jù)庫，通過BLAST程序從Genbank中檢索同源性較高的細(xì)菌基因序列，該菌株與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.）FZB42（NC 009725.1）的16S rRNA序列同源性最高，為99%。從中選取24個(gè)與所測細(xì)菌同源性較高的序列，采用Clustral X 2.0進(jìn)行多序列匹配排列（Multiple Alignments），用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用Neighbor-joining法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，自舉分析（Bootstrap）1000次重復(fù)檢測系統(tǒng)樹的置信度，系統(tǒng)樹見圖6?？芍?，HP60與Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum str.FZB42（NC 009725.1）同屬于一個(gè)最小分支中，表明它們之間的親緣性最近，該結(jié)果與序列同源性比較結(jié)果一致。因此，通過分子鑒定HP60為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖6　基于HP60 16S rRNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6　Phylogenetic tree based on the homology of 16S rRNA sequence of the HP60

綜合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，結(jié)合16S rRNA分子鑒定結(jié)果，將HP60鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》中芽孢桿菌屬的分類概況，屬芽孢桿菌綱（Bacilli），芽孢桿菌目（Bacillales），芽孢桿菌科（Bacillaceae），芽孢桿菌屬（Bacillus），解淀粉芽孢桿菌種（Bacillus amyloliquefaciens）。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一類廣泛分布革蘭氏陽性桿狀好養(yǎng)型細(xì)菌，環(huán)境兼容性好，不易產(chǎn)生抗藥性等，是一類安全、無害的微生物［24］。Bacillus amyloliquefaciens能夠產(chǎn)生多種酶，如蛋白酶、淀粉酶，多種代謝產(chǎn)物如抗菌肽、活性肽、抗生素等，使其具有防止蔬菜和水果軟腐、殺蟲、處理污水、作為基因工程受體菌、飼料添加益生菌及食品功能成分等作用，并在農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)療業(yè)、科研實(shí)驗(yàn)、畜牧業(yè)及食品工業(yè)中得到應(yīng)用［24-30］。

3　結(jié)論

從貴州23個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出115株產(chǎn)蛋白酶菌株。以米渣作唯一碳、氮源發(fā)酵培養(yǎng)，通過3次復(fù)篩獲得一株酶活最高的產(chǎn)米渣蛋白水解酶菌株HP60，在未優(yōu)化的條件下粗酶活為263 U/mL，對(duì)應(yīng)米渣蛋白水解度達(dá)15.63%。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)（API 20 NE，Biolog GP）及16S rRNA序列同源性分析，將HP60鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），且為一株潛在的新菌株。該菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)：CCTCC NO.M 2014200。同許多關(guān)于篩選產(chǎn)蛋白酶菌株的報(bào)道相比，該菌株表現(xiàn)出較高的酶活力。另外，同一些以商品蛋白酶水解米渣的報(bào)道相比，該菌株表現(xiàn)出對(duì)米渣蛋白較高的水解程度。本研究篩選的Bacillus amyloliquefaciens HP60對(duì)米渣蛋白的微生物開發(fā)奠定了一定基礎(chǔ)。

后續(xù)研究的重點(diǎn)方向有三點(diǎn)：一是對(duì)HP60發(fā)酵米渣的條件、產(chǎn)物及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行深入研究，以期為米渣資源的微生物開發(fā)提供更充足的支撐依據(jù)；二是HP60是從傳統(tǒng)豆豉中分離的一株野生菌，對(duì)其進(jìn)行誘變或基因工程改造，以期獲得更高的產(chǎn)酶菌株，更好的應(yīng)用于米渣蛋白；三是研究其水解其他蛋白質(zhì)及其他方面的特性如產(chǎn)淀粉酶、活性肽、抗菌肽等，以期促使Bacillus amyloliquefaciens HP60潛在性能的開發(fā)，以便更廣更深的應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。

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Screening and identification of protease-producing strain for hydrolysis of rice dreg protein

XUE Rong-tao1，2，LI Cui-qin3，HE La-ping1，2，4，*，CHEN Chang-yong1，2，SONG Xiao-juan1，2，WANG Meng1
（1.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store&Processing of Guizhou Province，Guizhou University，Guiyang 550025，China；3.School of Chemistry and Chemical Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China；4.Guizhou Pork Products Research Center of Engineering Technology，Guiyang 550025，China）

Screening of protease-producing strains（PPS）was used for hydrolysis of rice dreg protein（RDP），which could promote green development and make full use of RDP.A total of 115 PPS were isolated from samples protein-rich by casein plate method.These PPS were cultured with RDP as sole carbon and nitrogen source.Then，one target strain HP60 was obtained from fermented soybean by analysis of proteases of the fermentation broth via further screenings.Enzyme activity of HP60 and degree of hydrolysis of RDP were reached（263±7）U/mL and 15.63%±0.30%，respectively.The HP60 was identified as Bacillus amyloliquefaciens by morphological，physiological and biochemical characteristics（API 20 NE，Biolog GP）and 16S rRNA sequence analysis and collected in China Center for Type Culture Collection（CCTCC），collection number：CCTCC NO.M 2014200.In this study，Bacillus amyloliquefaciens HP60 have laied a preliminary foundation for microbial utilization of rice dreg protein.

rice dreg protein；protease-producing；screening；identification；Bacillus amyloliquefaciens

TS209

A

1002-0306（2015）18-0170-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.026

2014－11－14

薛榮濤（1990-），男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：rongtaoxue@126.com。

何臘平（1972-），男，博士，教授，研究方向：發(fā)酵工程，生物催化與生物轉(zhuǎn)化，E-mail：helaping@163.com。

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合J字［2010］2064號(hào)）；貴州省豬肉制品工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目（黔科合農(nóng)G字［2013］4001號(hào)）。