吳　偉，蔡勇建，吳曉娟，李　彤，林親錄，楊滔滔（.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙40004；.湖南糧食集團(tuán)有限責(zé)任公司，湖南長沙40008）

丙二醛氧化對大米蛋白功能性質(zhì)的影響

吳偉1，蔡勇建1，吳曉娟2，李彤1，林親錄1，楊滔滔1
（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410004；2.湖南糧食集團(tuán)有限責(zé)任公司，湖南長沙410008）

以新收獲秈米為原料制備大米蛋白，采用不同濃度丙二醛氧化大米蛋白，研究丙二醛氧化對大米蛋白功能性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：隨著丙二醛濃度的增加，氧化大米蛋白的羰基和二硫鍵含量增加，游離巰基含量下降，表明大米蛋白發(fā)生了氧化。當(dāng)丙二醛濃度從0增加到100 mmol/L時(shí)，氧化大米蛋白溶解性從28.88%降低至12.20%，持水性從353.67%降低至132.33%，持油性從89.40%上升至189.40%，起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分別從74.27%和54.06%降低至57.56%和38.01%，乳化性和乳化穩(wěn)定性分別從55.32 m2/g和97.59 min降低至45.13 m2/g和75.29 min，表明丙二醛氧化對大米蛋白功能性質(zhì)有負(fù)面影響。這一結(jié)果為進(jìn)一步改善大米蛋白功能性質(zhì)提供了有效基礎(chǔ)。

大米蛋白，丙二醛，蛋白質(zhì)氧化，功能性質(zhì)

大米作為我國居民膳食中最重要的主食，約含8%～10%大米蛋白。大米蛋白具有過敏性低、生物效價(jià)高和氨基酸組成平衡合理等特點(diǎn)，是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，一直備受食品科學(xué)家高度關(guān)注。國內(nèi)外大米蛋白類產(chǎn)品的主要形式包括食品添加劑、蛋白質(zhì)營養(yǎng)補(bǔ)充劑和生物活性肽等［1-2］。大米蛋白類食品添加劑主要受大米蛋白功能性質(zhì)的影響，而大米蛋白功能性質(zhì)又與其結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)。影響大米蛋白結(jié)構(gòu)的因素很多，稻谷貯藏過程中的陳化可導(dǎo)致大米蛋白氧化，進(jìn)而改變大米蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)［3］。李彤等［4］在研究陳化對米谷蛋白功能性質(zhì)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)隨秈米貯藏時(shí)間的延長，米谷蛋白提取率、溶解性、持水性、乳化性和乳化穩(wěn)定性逐漸減小，米谷蛋白持油性呈上升趨勢，而米谷蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性呈先上升、后下降趨勢，由此可見稻谷陳化導(dǎo)致的大米蛋白氧化可改變大米蛋白功能性質(zhì)。稻谷貯藏過程中導(dǎo)致大米蛋白氧化的活性氧主要源于脂質(zhì)自由基和活性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，目前對于稻谷貯藏過程中脂質(zhì)自由基和活性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物分別在多大程度上導(dǎo)致大米蛋白氧化還不甚明晰。丙二醛作為一種活性醛類，其含量常用來衡量脂質(zhì)氧化的程度［5］，本文以丙二醛代表脂質(zhì)次生活性氧化產(chǎn)物，以不同貯藏期秈稻制備大米蛋白羰基含量為參照確定丙二醛添加濃度范圍，研究丙二醛氧化對秈米蛋白功能性質(zhì)的影響，為深入研究稻谷陳化機(jī)理以及稻谷陳化過程中大米蛋白氧化對大米蛋白功能性質(zhì)的影響奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新收獲金優(yōu)207（秈米） 湖南糧食集團(tuán)有限責(zé)任公司；1，1，3，3-四甲氧基丙烷、5，5’-二硫代二硝基苯甲酸分析純，美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

Sorvall LYNX 6000高速落地離心機(jī)美國Thermo Fisher公司；FD5-4冷凍干燥機(jī)美國GOLD-SIM公司；SHA-2A冷凍水浴恒溫振蕩器北京中興偉業(yè)儀器有限公司；FA25高速分散均質(zhì)機(jī)上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大米蛋白的制備以新收獲金優(yōu)207秈米為原料，磨粉過80目，將米粉以1∶7（w/v）料液比與0.05 mol/L氫氧化鈉溶液混合，在40℃條件下攪拌4 h后將懸浮液在4℃條件下8000 r/min離心20 min，取上清液用2 mol/L HCl調(diào)pH至4.0，靜置20 min后在4℃條件下8000 r/min離心15 min，水洗沉淀三次，取蛋白沉淀分散于去離子水中并用2 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0。最后在4℃條件下8000 r/min離心30 min除去少量雜質(zhì)，冷凍干燥得到大米蛋白。在此條件下大米蛋白提取率為83.34%，純度為85.02%。

1.2.2丙二醛氧化大米蛋白的制備參照Wu等［5］制備丙二醛氧化大豆蛋白的方法制備丙二醛氧化大米蛋白，以常溫條件下不同貯藏期（0～18個(gè)月）金優(yōu)207秈稻制備大米蛋白羰基含量為參照，確定丙二醛添加濃度范圍。將水解1，1，3，3-四甲氧基丙烷制備的丙二醛儲液與10 mg/mL大米蛋白溶液（溶于0.01 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，其中含有0.5 mg/mL NaN3）混合，使得丙二醛濃度分別為0、0.01、0.1、1、10、100 mmol/L，25℃密封避光條件下振蕩反應(yīng)24 h，隨后將反應(yīng)液置于冰浴中使溫度迅速下降至4℃以下，隨后在4℃超純水中透析72 h去除未反應(yīng)的丙二醛，透析過程中每隔6 h更換一次超純水，最后冷凍干燥得到丙二醛氧化大米蛋白。

1.2.3羰基含量的測定參考Wu等［5］的方法采用2，4-二硝基苯肼比色法測定大米蛋白羰基含量，以22000（mol/L）-1·cm-1消光系數(shù)計(jì)算每克蛋白質(zhì)羰基衍生物的摩爾數(shù)。

1.2.4游離巰基與二硫鍵含量的測定參考Wu等［5］的方法采用5，5’-二硫代二硝基苯甲酸比色法測定氧化大米蛋白游離巰基和總巰基含量，以13600（mol/L）-1cm-1消光系數(shù)計(jì)算每毫克蛋白質(zhì)巰基摩爾數(shù)，總巰基與游離巰基差值的一半即為二硫鍵含量。

1.2.5溶解性的測定將氧化大米蛋白分散于去離子水中，磁力攪拌2 h后室溫條件10000 r/min離心20 min收集上清液。隨后采用微量凱氏定氮法測定上清液中可溶解氮含量，蛋白質(zhì)溶解性表示為可溶解氮與樣品中總氮的百分比。

1.2.6持水性的測定參考Mohamed等［6］方法，并作適當(dāng)?shù)男薷?，具體操作如下：預(yù)先稱取離心管的質(zhì)量m1，再準(zhǔn)確稱取0.2 g左右氧化大米蛋白（m2）置于預(yù)先稱重過的離心管中。逐步向離心管中加去離子水（共計(jì)6～8 mL），每加一次水就用玻璃棒將樣品攪勻，并在管壁上擦干玻璃棒，于3000 r/min離心20 min，倒去上清液，稱重質(zhì)量m3。若無上清液，則應(yīng)再加水?dāng)嚢桦x心，至離心后有少量上清液為止。按式（1）計(jì)算大米蛋白持水性：

1.2.7持油性的測定參考Mohamed等［6］方法，并作適當(dāng)?shù)男薷模唧w操作如下：預(yù)先稱取離心管的質(zhì)量M1，再準(zhǔn)確稱取0.2 g左右氧化大米蛋白（M2）置于預(yù)先稱重過的離心管中。逐步向離心管中加大豆油4 mL，用玻棒輕輕攪拌，分散至無明顯顆粒，再用吸管取2 mL油沖洗玻棒和管壁，3000 r/min離心20 min，吸去上層未吸附油，稱重質(zhì)量M3。按式（2）計(jì)算大米蛋白持油性：

1.2.8起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的測定參考Mohamed等［6］方法，并作適當(dāng)?shù)男薷?，具體操作如下：準(zhǔn)確稱量0.2 g左右氧化大米蛋白置于已加入20 mL 0.05 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液的50 mL燒杯中。使用高速分散均質(zhì)機(jī)以10000 r/min的速度均質(zhì)30 s，連續(xù)3次共計(jì)2 min，記錄均質(zhì)后的泡沫體積，記為V0，靜置30 min后再次記錄泡沫體積，記為V30。按式（3）和（4）分別計(jì)算大米蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性：

1.2.9乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定參考Molina等［7］方法，并作適當(dāng)?shù)男薷?，具體操作如下：將氧化大米蛋白溶解于去離子水中，調(diào)整蛋白濃度為1 mg/mL。取1 mg/mL蛋白溶液15 mL與5 mL大豆油混合放入100 mL燒杯中，于10000 r/min均質(zhì)2 min后立即開始取樣。取20 μL大米蛋白-大豆油乳狀液與5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉均勻混合，以0.1%十二烷基硫酸鈉為空白，在500 nm處測定吸光值（記為A0）。乳狀液靜置30 min后采用相同的方法測定乳狀液吸光值（記為A30）。按式（5）和（6）分別計(jì)算大米蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性：

式中：N：稀釋倍數(shù)，250；C：樣品溶解液中蛋白質(zhì)濃度，0.001 g/mL；φ：油相所占的分?jǐn)?shù)，0.25。1.2.10數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均重復(fù)三次，采用Origin Pro 7.5對各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1丙二醛氧化對大米蛋白氧化程度的影響

目前衡量蛋白質(zhì)氧化程度最直接的指標(biāo)是蛋白質(zhì)羰基含量，氧化大米蛋白羰基含量如表1所示，隨著丙二醛濃度的增加，大米蛋白羰基含量逐漸增加，并且當(dāng)大米蛋白被濃度大于等于0.1 mmol/L丙二醛氧化時(shí)，氧化大米蛋白羰基含量顯著（p＜0.05）增加，表明當(dāng)丙二醛濃度大于等于0.1 mmol/L時(shí)，氧化大米蛋白氧化程度隨著丙二醛濃度的增加不斷增大。Wu等［5］研究丙二醛-大豆蛋白模擬氧化體系發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白氧化程度隨著丙二醛濃度的增加而增大。丙二醛分子含有兩個(gè)羰基，當(dāng)其中一個(gè)羰基與蛋白質(zhì)反應(yīng)時(shí)，就會為蛋白質(zhì)引入一個(gè)新的羰基；此外，丙二醛還可通過親核側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)形成西佛堿，使得蛋白質(zhì)羰基化［8］。

蛋白質(zhì)巰基是對氧化最敏感的蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)，蛋白質(zhì)游離巰基和二硫鍵含量可表征蛋白質(zhì)巰基的氧化程度，丙二醛氧化大米蛋白巰基和二硫鍵含量如表1所示。隨著丙二醛濃度的增加，氧化大米蛋白游離巰基逐漸下降，并且濃度大于等于0.1 mmol/L的丙二醛氧化使得大米蛋白游離巰基含量顯著（p＜0.05）下降；氧化大米蛋白二硫鍵含量隨著丙二醛濃度的增加而增加，并且濃度大于等于10 mmol/L的丙二醛氧化使得大米蛋白二硫鍵含量顯著（p＜0.05）增加，表明隨著丙二醛濃度的增加，氧化大米蛋白游離巰基逐漸氧化形成二硫鍵。

表1　丙二醛氧化大米蛋白羰基、游離巰基和二硫鍵含量Table 1　Protein carbonyl，free sulphydryl，and disulfide content of rice protein which oxidatively modified by malondialdehyde

2.2丙二醛氧化對大米蛋白溶解性的影響

溶解性是蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的前提和基礎(chǔ)，氧化大米蛋白溶解性如圖1所示。隨著丙二醛濃度的增加，大米蛋白溶解性逐漸下降，并且濃度大于等于0.1 mmol/L的丙二醛氧化修飾使得大米蛋白溶解性顯著（p＜0.05）下降，表明氧化大米蛋白溶解性隨大米蛋白氧化程度的增加而逐漸下降。天然大米蛋白（丙二醛濃度為0 mmol/L）溶解性低于30%，這是由于大米蛋白中70%～80%左右的蛋白質(zhì)是溶解性較差的谷蛋白［1］。Ye等［9］發(fā)現(xiàn)花生分離蛋白溶解性隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加而降低，并認(rèn)為形成不溶性蛋白質(zhì)氧化聚集體是造成花生分離蛋白溶解性下降的原因。大米蛋白溶解性下降的原因可能是丙二醛氧化導(dǎo)致大米蛋白二硫鍵增加，同時(shí)丙二醛通過與蛋白質(zhì)中的親核側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)形成西佛堿，進(jìn)而導(dǎo)致大米蛋白發(fā)生共價(jià)交聯(lián)形成不可溶性聚集體。

圖1　丙二醛氧化對大米蛋白溶解性的影響Fig.1　Effect of oxidative modification by malondialdehyde on solubility of rice protein

2.3丙二醛氧化對大米蛋白持水性的影響

丙二醛氧化對大米蛋白持水性的影響如圖2所示，隨著丙二醛濃度的增加，氧化大米蛋白持水性逐漸顯著（p＜0.05）下降，表明氧化大米蛋白持水性隨蛋白質(zhì)氧化程度的增加而逐漸降低。李彤等［4］研究發(fā)現(xiàn)秈米米谷蛋白持水性隨著秈米貯藏時(shí)間的延長而下降，并認(rèn)為米谷蛋白游離巰基氧化形成二硫鍵和形成不可溶性蛋白質(zhì)氧化聚集體是導(dǎo)致米谷蛋白持水性下降的重要原因。Zhao等［10］認(rèn)為氧化大米蛋白中一些顆粒較大的不可溶性氧化聚集體也可能影響大米蛋白的持水性。因此，丙二醛氧化導(dǎo)致大米蛋白持水性下降可能是氧化大米蛋白巰基轉(zhuǎn)化形成二硫鍵和大量形成不可溶性蛋白質(zhì)氧化聚集體。

圖2　丙二醛氧化對大米蛋白持水性的影響Fig.2　Effect of oxidative modification by malondialdehyde on water holding capacity of rice protein

2.4丙二醛氧化對大米蛋白持油性的影響

丙二醛氧化對大米蛋白持油性的影響如圖3所示，隨著丙二醛濃度的增加，大米蛋白持油性逐漸增加，并且高濃度丙二醛（≥0.1 mmol/L）氧化使得大米蛋白持油性顯著（p＜0.05）增加，表明氧化大米蛋白持油性隨大米蛋白氧化程度的增加而增加。李彤等［4］研究發(fā)現(xiàn)米谷蛋白持油性隨著秈米貯藏時(shí)間的延長而增加，并認(rèn)為持油性上升可能是秈米貯藏過程中米谷蛋白疏水基團(tuán)暴露，疏水性增強(qiáng)，利于蛋白質(zhì)對油滴的吸附；Wu等［5］研究發(fā)現(xiàn)丙二醛可與大豆蛋白內(nèi)部氨基酸殘基接觸、反應(yīng)，使蛋白部分去折疊，疏水基團(tuán)外露。因而，氧化大米蛋白持油性增加可能是丙二醛氧化導(dǎo)致大米蛋白疏水基團(tuán)暴露，使得大米蛋白對油脂的吸附能力增加的原因。

圖3　丙二醛氧化對大米蛋白持油性的影響Fig.3　Effect of oxidative modification by malondialdehyde on oil-absorbing capacity of rice protein

2.5丙二醛氧化對大米蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的影響

丙二醛氧化大米蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性如圖4所示。隨著丙二醛濃度的增加，大米蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均逐漸顯著（p＜0.05）下降，表明氧化大米蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加而降低。Wu等［5］發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化可導(dǎo)致大豆蛋白溶解性和穩(wěn)定性下降，使得大豆蛋白不能在氣-液界面充分展開，無法形成具有良好黏彈性且能阻隔空氣滲透的連續(xù)蛋白膜，導(dǎo)致大豆蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性降低。氧化大米蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性降低可能是由于丙二醛氧化導(dǎo)致大米蛋白巰基轉(zhuǎn)化形成二硫鍵，共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)生不可溶性聚集體，使大米蛋白溶解性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降。

圖4　丙二醛氧化對大米蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.4　Effect of oxidative modification by malondialdehyde on foaming capacity and foam stability of rice protein

2.6丙二醛氧化對大米蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

丙二醛氧化對大米蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖5所示，隨著丙二醛濃度的增加，大米蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均逐漸下降，其中不同濃度丙二醛氧化大米蛋白乳化性彼此間差異性顯著（p＜0.05），高濃度丙二醛（≥0.1 mmol/L）氧化使得大米蛋白乳化穩(wěn)定性顯著下降，表明大米蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加而降低。Chen等［11］采用2，2’-鹽酸脒基丙烷氧化體系模擬花生儲藏過程中蛋白質(zhì)氧化對花生分離蛋白乳化性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加，花生分離蛋白氧化產(chǎn)生不可溶性聚集體，乳化性和乳化穩(wěn)定性降低；同時(shí)，李彤等［4］在研究陳化對米谷蛋白功能性質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，米谷蛋白在陳化過程中雖然疏水基團(tuán)的暴露引起了蛋白質(zhì)吸油性的增加，然而蛋白質(zhì)乳化作用減弱也與其溶解性下降導(dǎo)致蛋白質(zhì)吸附擴(kuò)散能力受限有關(guān)。丙二醛氧化使大米蛋白分子間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)和聚集形成不可溶性聚集體，導(dǎo)致溶解性下降，使得蛋白質(zhì)對脂肪的吸附擴(kuò)散能力降低，從而減弱了大米蛋白的乳化作用。

圖5　丙二醛氧化對大米蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.5　Effect of oxidative modification by malondialdehyde on emulsification and emulsion stability of rice protein

3　結(jié)論

大米儲藏過程中易發(fā)生陳化，陳化期間脂質(zhì)發(fā)生水解和氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基和活性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物可導(dǎo)致大米蛋白氧化。本文以新收獲秈米為原料提取大米蛋白，以丙二醛代表脂質(zhì)次生活性氧化產(chǎn)物，研究丙二醛氧化對大米蛋白功能性質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著丙二醛濃度的增加，氧化大米蛋白羰基和二硫鍵含量增加，游離巰基含量下降，表明丙二醛導(dǎo)致大米蛋白氧化。隨著大米蛋白氧化程度的增加，氧化大米蛋白溶解性、持水性、起泡性、乳化性逐漸下降，持油性上升，表明丙二醛氧化對大米蛋白功能性質(zhì)有負(fù)面影響。丙二醛氧化影響大米蛋白功能性質(zhì)的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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Effect of oxidative modification by malondialdehyde on functional properties of rice protein

WU Wei1，CAI Yong-jian1，WU Xiao-juan2，LI Tong1，LIN Qin-lu1，YANG Tao-tao1
（1.College of Food Science and Engineering，Center South University of Forestry and Technology，National Engineering Laboratory for Rice and By-product Deep Processing，Changsha 410004，China；2.Hunan Grain Group，Changsha 410008，China）

Fresh indica rice which oxidatively modified by different concentration of malondialdehyde were used as material to investigate effects of oxidative modification by malondialdehyde on functional properties of indica rice protein.The results indicated that as concentration of malondialdehyde increased，content of rice protein carbonyl and disulfide increased，and content of free sulphydryl decreased，which indicated that incubation of malondialdehyde with rice protein resulted in oxidation of rice protein.As concentration of malondialdehyde increased from 0 to 100 mmol/L，solubility of rice protein decreased from 28.88%to 12.20%，water holding capacity of rice protein decreased from 353.67%to 132.33%，oil-absorbing capacity of rice protein decreased from 89.40%to 189.40%，foaming capacity and foam stability of rice protein decreased from 74.27%and 54.06%to 57.56%and 38.01%，respectively，emulsification and emulsion stability of rice protein decreased from 55.32 m2/g and 97.59 min to 45.13 m2/g and 75.29 min，respectively.The results indicated that oxidative modification by malondialdehyde had a negative effect on function properties of rice protein.The results provided effective basis for further improve the functional properties of rice protein.

rice protein；malondialdehyde；protein oxidation；functional properties

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0113-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.014

2015－01－06

吳偉（1981-），男，博士，副教授，研究方向：糧油工程，E-mail：foodwuwei@126.com。

國家自然科學(xué)基金（31201319）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303071）；湖南省教育廳項(xiàng)目（編號14C1181）；湖南省科技計(jì)劃專項(xiàng)（2014GK4003）；長沙市科技計(jì)劃重大專項(xiàng)（K1404006-21）。