任先偉，魏曉璐，黃　鑫，劉　麗，馮　悅，夏雪山（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

核桃青皮提取物抑菌活性及抑菌機(jī)理研究

任先偉，魏曉璐，黃鑫，劉麗*，馮悅，夏雪山
（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等不同極性有機(jī)溶劑對(duì)核桃青皮乙醇提取物進(jìn)行萃取，以7種細(xì)菌為供試菌，采用離體實(shí)驗(yàn)方法對(duì)核桃青皮乙醇提取物的不同極性萃取相進(jìn)行抑菌作用研究并探討其作用機(jī)理。結(jié)果表明：各萃取相對(duì)供試細(xì)菌均有一定抑制作用：乙酸乙酯相＞氯仿相＞正丁醇相＞石油醚相。乙酸乙酯萃取相對(duì)7種細(xì)菌均有較好抑制效果，具有廣譜抑菌作用。在濃度為50 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯萃取相抑菌效果最好，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到19.94 mm，對(duì)其最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）分別為0.781和1.563 mg/mL。乙酸乙酯萃取相對(duì)溫度和紫外線的耐受力較強(qiáng)，抑菌作用受pH影響較大，NaCl和蔗糖的添加對(duì)菌體生長(zhǎng)也有一定抑制。其抑菌機(jī)理主要是破壞菌體的細(xì)胞壁或膜的結(jié)構(gòu)。

核桃青皮提取物，抑菌活性，抑菌機(jī)理

核桃（Juglans regia Linn.），也叫胡桃或者羌桃，為胡桃科核桃屬落葉喬木。我國核桃資源十分豐富［1］，核桃全身是寶，其果仁含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)和維生素等，成為食品、食用油脂行業(yè)的優(yōu)質(zhì)原料；核桃枝、葉、殼、青皮、樹皮等均有藥用價(jià)值［2-3］。近年來，我國核桃產(chǎn)量穩(wěn)步增長(zhǎng)，對(duì)核桃資源的綜合開發(fā)利用已成為發(fā)展核桃產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵。核桃青皮又稱青龍衣，是核桃殼外部的一層厚厚的綠色果皮。核桃青皮在核桃采收后被大量堆放在田間、溝邊或地頭，嚴(yán)重污染環(huán)境也造成資源浪費(fèi)。核桃青皮中含有大量生物活性物質(zhì)如酚類、酮類、生物堿等，研究核桃青皮中生物活性物質(zhì)，有利于充分發(fā)揮核桃青皮的利用價(jià)值。有學(xué)者對(duì)其活性物質(zhì)抗菌殺蟲及化感作用等方面做出報(bào)道［4-7］，但對(duì)核桃青皮在抑菌殺蟲作用的研究多停留在初步的抑菌效果上［8-12］，尤其缺乏對(duì)其功能活性的作用機(jī)理研究。

本研究通過管碟法和最低抑菌濃度（MIC）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)核桃青皮乙醇提取物的不同極性萃取對(duì)常見于臨床產(chǎn)生耐藥性細(xì)菌的抑菌活性，同時(shí)考察了pH、溫度、NaCl濃度、蔗糖濃度、紫外照射等因素對(duì)核桃青皮提取物抑菌作用效果的影響，通過透射電鏡觀察、檢測(cè)培養(yǎng)液電導(dǎo)率以及大分子物質(zhì)溶出情況研究核桃青皮提取物抑菌機(jī)理。為進(jìn)一步探索核桃青皮在農(nóng)業(yè)病害防治、食品安全保藏以及消毒殺菌的醫(yī)藥研發(fā)方面提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)與理論基礎(chǔ)，為核桃青皮資源的多途徑綜合開發(fā)應(yīng)用尋找出路。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

核桃青皮取自云南臨滄核桃產(chǎn)區(qū)，洗凈后陰干，陰干的核桃青皮置粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，儲(chǔ)存?zhèn)溆?；乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮均為分析純，天津博迪化工有限公司；革蘭氏陽性菌（G+）：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），革蘭氏陰性菌（G-）：大腸桿菌（Escherichia coli）、普通變形桿菌（Proteus vuigaris）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、粘質(zhì)沙雷（Serratia marcescens）、腸炎沙門菌（Salmonellaenteritidis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）由云南省第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科提供；培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；磷酸緩沖鹽溶液；四氧化鋨。

LRH-70F恒溫生化培養(yǎng)箱上海璽恒實(shí)業(yè)有限公司；ALLEGRA X-15R高速冷凍離心機(jī)Beckman coulter；Q-250B粉碎機(jī)廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；RE1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、RE1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器水浴槽、RE300B高壓真空泵西安禾普生物科技有限公司；XFH-40CA高溫高壓滅菌鍋湟中東山建材開發(fā)有限公司；HH-1恒溫水浴鍋常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；BHC-1300IIB2超凈工作臺(tái)蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司；GK-9040鼓風(fēng)干燥箱泰州蘭迪醫(yī)用設(shè)備廠；DW-86L828超低溫冰箱蘇州柏兆科學(xué)儀器有限公司；TS-100C恒溫?fù)u床金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；Scientz-18SN冷凍干燥機(jī)上海市茸研儀器有限公司；JEM-2100透射電鏡日本電子株式會(huì)社。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1核桃青皮粗提物的制備與分離取核桃青皮粉100 g，用85%乙醇室溫冷浸提取4次，每次24 h。合并濾液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，將部分醇提物用50%丙酮配成濃度為干樣500 mg/mL待測(cè)液。剩余部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇按1∶1的比例進(jìn)行液-液逐級(jí)萃取各24 h，經(jīng)45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到相應(yīng)萃取相浸膏。用50%丙酮將各萃取相配制成濃度為50 mg/mL的待測(cè)液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2抑菌活性檢測(cè)采用管碟法［13］。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期、濃度為106～107cfu/mL的菌懸液200 μL加入到9 cm平板中，向平板中加入7 mL培養(yǎng)基，充分混勻制成帶菌平板。在培養(yǎng)基上放置牛津杯，分別向牛津杯中加入100 μL不同濃度的待測(cè)液，每菌做3組重復(fù)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌、肺炎克雷伯菌、腸炎沙門菌、銅綠假單胞菌于37℃、粘滯沙雷菌于30℃培養(yǎng)18 h，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，取重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值作為結(jié)果。

1.2.3最低殺菌濃度（MBC）和最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定［14］采用試管梯度稀釋法。將濃度為50 mg/mL的待測(cè)液用培養(yǎng)基依次倍比稀釋成50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 mg/mL的濃度。將已培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌加入待測(cè)液中，調(diào)整其濃度為106～107cfu/mL。對(duì)照組含相應(yīng)濃度的有機(jī)溶劑。220 r/min下，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌、肺炎克雷伯菌、腸炎沙門菌、銅綠假單胞菌37℃、粘滯沙雷30℃培養(yǎng)，18 h后觀察，培養(yǎng)液澄清，搖勻后仍澄清者表明無細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液渾濁則表明有細(xì)菌生長(zhǎng)，以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥液濃度作為MIC值。

依次取未見細(xì)菌生長(zhǎng)的各管培養(yǎng)物，劃線于固體培養(yǎng)基上，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌、肺炎克雷伯菌、腸炎沙門菌、銅綠假單胞菌37℃、粘滯沙雷30℃培養(yǎng)18 h。平板上菌落數(shù)小于5個(gè)的最高藥物濃度即為最低殺菌濃度MBC。

1.2.4不同影響因素對(duì)核桃青皮提取物抑菌活性的影響

1.2.4.1pH對(duì)抑菌作用的影響用1 mol/L的檸檬酸和1 mol/L的NaOH溶液分別將待測(cè)液pH調(diào)為3.0、5.0、6.0、7.0（待測(cè)液原pH為4.12），培養(yǎng)基的pH調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0，采用管碟法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，每處理做3個(gè)重復(fù)，以相應(yīng)有機(jī)溶劑做空白對(duì)照。

1.2.4.2溫度對(duì)核桃青皮乙酸乙酯萃取相的穩(wěn)定性的影響將待測(cè)液分別置于70、80、90、100℃的水浴中處理20 min，采用管碟法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，每處理做3個(gè)重復(fù)，以未經(jīng)處理的待測(cè)液作為對(duì)照。

1.2.4.3不同NaCl、蔗糖濃度對(duì)抑菌作用的影響分別向待測(cè)液中添加10%、20%、30%、50%的NaCl或蔗糖，采用管碟法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，每處理做3個(gè)重復(fù)，以未經(jīng)處理的待測(cè)液作為對(duì)照。

1.2.4.4紫外線對(duì)核桃青皮乙酸乙酯萃取相的穩(wěn)定性的影響將待測(cè)液分別置于紫外燈下處理15、30、45、60 min，采用管碟法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，每處理做3個(gè)重復(fù)，以未經(jīng)處理的待測(cè)液作為對(duì)照。

1.2.5核桃青皮乙酸乙酯萃取物的抑菌機(jī)理

1.2.5.1核桃青皮乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響向菌懸液中加入待測(cè)液使其終濃度為1 mg/mL，設(shè)立陰性對(duì)照組，220 r/min、37℃恒溫?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2 h取菌液3 mL，離心收集菌體，生理鹽水洗3次后重懸于3 mL生理鹽水，分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值為縱坐標(biāo)，繪制核桃青皮乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用的生長(zhǎng)曲線，分析其抑菌活性及作用特點(diǎn)。

1.2.5.2核桃青皮乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)的影響以2.5%戊二醛固定細(xì)菌，4℃放置2 h，0.01 mol/L磷酸緩沖液洗滌三次，離心后經(jīng)四氧化鋨再固定，乙醇逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋等步驟處理，制備成超薄切片。在透射電鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.5.3核桃青皮乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響向菌懸液中加入待測(cè)液使其終濃度為1 mg/mL，對(duì)照組向菌懸液中加入相應(yīng)體積的溶劑，220 r/min、37℃恒溫?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)。藥物作用0、2、4、6、8、10、12 h取菌液3 mL，5000 r/min離心15 min取上清，去離子水稀釋20倍后，用電導(dǎo)儀測(cè)各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液的電導(dǎo)率，做3組重復(fù)，從而研究菌體內(nèi)部離子的滲出變化趨勢(shì)。

1.2.5.4核桃青皮乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)的影響取活化好的金黃色葡萄球菌，用培養(yǎng)基稀釋成含菌數(shù)為106～107cfu/mL的菌懸液。處理組向菌懸液中加入待測(cè)液使其終濃度為1 mg/mL，設(shè)立對(duì)照組，220 r/min、37℃恒溫?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)。待藥物作用0、2、4、6、8、10、12 h取菌液3 mL，12000 r/min離心5 min取上清，紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm波長(zhǎng)下吸收值。將含有相同核桃青皮乙酸乙酯萃取物濃度的培養(yǎng)液12000 r/min離心5 min，取其上清樣品的OD260nm來校正處理組；研究乙酸乙酯萃取相作用后上清液中DNA和RNA等大分子物質(zhì)的變化。

1.2.6數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Excel工具作圖。

2　結(jié)果與討論

2.1核桃青皮提取物對(duì)7種細(xì)菌的抑制作用

2.1.1核桃青皮各萃取相對(duì)7種細(xì)菌的抑制作用核桃青皮中存在著豐富的抑菌或殺菌活性物質(zhì)，從核桃青皮乙醇提取物中萃取的不同極性活性物質(zhì)對(duì)7種細(xì)菌均有不同程度的抑制作用，結(jié)果見表1。不同極性溶劑萃取后所得的相應(yīng)萃取相抑菌效果存在較大的差異，在供試濃度為50 mg/mL時(shí)，各萃取相對(duì)供試菌抑制作用為：乙酸乙酯相＞氯仿相＞正丁醇相＞石油醚相。乙酸乙酯萃取相對(duì)7種細(xì)菌均有較好抑制效果，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，其次是普通變形桿菌、銅綠假單胞菌和粘質(zhì)沙雷菌。其中大腸桿菌和腸炎沙門菌僅對(duì)乙酸乙酯萃取相敏感，石油醚、氯仿、正丁醇萃取相對(duì)這兩種菌抑制作用均不明顯。乙酸乙酯相的抑菌效果明顯優(yōu)于其他三相，具有廣譜抑菌作用，說明核桃青皮中的抑菌活性成分主要集中在中等極性部位，因此選用乙酸乙酯相做進(jìn)一步研究。同時(shí)，對(duì)乙酸乙酯萃取相的進(jìn)一步活性追蹤將有望開發(fā)出具抗菌活性的物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)僅限于研究核桃青皮粗提物及其萃取物的抑菌活性，對(duì)其中起抑菌作用的活性成分進(jìn)一步分離純化仍需進(jìn)一步的探討。

表1　核桃青皮各萃取相對(duì)細(xì)菌的抑制效果Table 1　Inhibiting activities of extracts of walnut green husk with different solvents to bacteria

2.1.2不同濃度乙酸乙酯萃取相對(duì)7種細(xì)菌的抑制作用不同濃度乙酸乙酯萃取相對(duì)7種細(xì)菌的抑制作用如圖1。在6.25～50 mg/mL濃度時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌作用效果明顯，抑菌圈均在10 mm以上，最大可達(dá)19.22 mm，在3.125和1.563 mg/mL濃度時(shí)也有一定抑制作用。在50和25 mg/mL濃度處理下，對(duì)普通變形桿菌、銅綠假單胞菌以及粘質(zhì)沙雷菌有著由大到小的抑制作用，抑菌圈均在10～16 mm之間；而在3.125～12.5 mg/mL濃度時(shí)對(duì)3種菌的抑制效果幾乎沒有差別；1.563 mg/mL濃度時(shí)對(duì)這3種菌都沒有抑制作用。腸炎沙門菌和肺炎克雷伯菌在各濃度作用下抑菌圈也無明顯差別，在6.25～50 mg/mL濃度作用時(shí)有抑制作用，抑菌圈均不到10 mm。大腸桿菌是幾種菌中的最耐藥菌，僅在50、25和12.5 mg/mL濃度下被抑制，且抑制效果不夠理想，僅在50 mg/mL濃度時(shí)抑菌圈達(dá)9.19 mm。這與翟梅枝等的研究相符，在40 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用，對(duì)大腸桿菌的抑制作用較弱［12］。

圖1　不同濃度乙酸乙酯萃取相對(duì)7種細(xì)菌的抑制作用Fig.1　Inhibition of acetyl acetate’s extraction by different concentrations on 7 kinds of bacteria

由此可知，核桃青皮乙酸乙酯萃取相對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯大于其余革蘭氏陰性菌，這可能與陽性菌和陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組成不同有一定的關(guān)系。

2.1.3乙酸乙酯萃取相對(duì)7種細(xì)菌的MIC和MBC乙酸乙酯萃取相對(duì)7種細(xì)菌的MIC和MBC見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與管碟法中結(jié)果一致。金黃色葡萄球菌的MIC值和MBC值均為最小，分別為0.781 mg/mL和1.563 mg/mL，表明乙酸乙酯相對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯抑制效果。普通變形桿菌、銅綠假單胞菌以及粘質(zhì)沙雷菌的MIC和MBC值完全一樣，其MIC值為3.125 mg/mL，MBC值為6.25 mg/mL，抑制效果僅次于金黃色葡萄球菌。腸炎沙門菌的MIC值為6.25 mg/mL，略小于肺炎克雷伯菌12.5 mg/mL，但它們的MBC值是一樣的均為12.5 mg/mL；大腸桿菌的MIC值和MBC值最大為12.5 mg/mL，對(duì)其抑制效果較差。綜上，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌。

表2　乙酸乙酯萃取相對(duì)7種細(xì)菌的MIC和MBC測(cè)定結(jié)果Table 2　MIC and MBC results of acetyl acetate’s extraction of walnut seedcases

2.2核桃青皮提取物抑菌活性影響因素研究

(ⅱ)如果c*(t)=0，即則問題仍轉(zhuǎn)化為齊次問題.當(dāng)Κ≥0時(shí)，問題的一般解(16)右邊還要添加一項(xiàng)Φ1(z)；當(dāng)Κ<0時(shí)，由于相應(yīng)問題只有零解Φ0(z)≡0，故原問題有唯一非零解Φ1(z).

2.2.1pH對(duì)抑菌作用的影響不同pH對(duì)乙酸乙酯萃取相抑菌作用的影響如圖2所示，金黃色葡萄球菌受乙酸乙酯萃取相溶液pH影響較大。乙酸乙酯萃取相本身的pH為4.16，調(diào)整其pH為3時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最佳，這可能與細(xì)菌本身不宜在酸性條件下生長(zhǎng)有關(guān)；調(diào)整其pH為5、6、7時(shí)，抑菌圈逐漸變小。

圖2　不同乙酸乙酯萃取相pH對(duì)抑菌作用的影響Fig.2　The effect of pH on steady antimicrobial activity of acetyl acetate extraction

圖3　不同培養(yǎng)基pH對(duì)抑菌作用的影響Fig.3　The effect of medium pH against the antibacterial activity of acetyl acetate extraction

不同培養(yǎng)基pH對(duì)抑菌作用的影響如圖3所示，金黃色葡萄球菌受培養(yǎng)基pH影響較大，隨著培養(yǎng)基pH的降低，抑菌圈也隨之增大。在弱堿性條件pH為8時(shí)，抑制作用稍有下降，抑菌圈直徑為11.95 mm；當(dāng)培養(yǎng)基pH為5時(shí)抑菌圈最大，直徑達(dá)到19.85 mm；培養(yǎng)基pH為6時(shí)，抑菌效果也較明顯，抑菌圈直徑為15.27 mm。

2.2.2不同處理溫度對(duì)抑菌作用的影響乙酸乙酯萃取相經(jīng)70、80、90、100℃溫度處理后對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用如圖4所示，與對(duì)照相比抑菌圈大小無明顯變化，表明溫度對(duì)核桃青皮提取物乙酸乙酯相中活性物質(zhì)影響不大。

圖4　不同處理溫度對(duì)抑菌作用的影響Fig.4　The effect of temperature against the antibacterial activity of acetyl acetate extraction

2.2.3不同NaCl濃度對(duì)抑菌作用的影響10%、20%、30%和50%的NaCl濃度對(duì)乙酸乙酯萃取相抑制金黃色葡萄球菌作用的影響如圖5。在10%NaCl濃度下的抑菌圈大小與未處理對(duì)照組相差不大，而隨著NaCl濃度繼續(xù)增大，抑菌圈也有所擴(kuò)大，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到50%時(shí)抑菌圈達(dá)到14.61 mm。

圖5　不同NaCl濃度對(duì)抑菌作用的影響Fig.5　The effect of different NaCl concentration against the antibacterial activity of acetyl acetate extraction

2.2.4不同蔗糖濃度對(duì)抑菌作用的影響10%、20%、30%和50%的蔗糖濃度對(duì)乙酸乙酯萃取相抑制金黃色葡萄球菌作用的影響見圖6。可看出隨著蔗糖濃度的升高，抑菌圈明顯變大，在50%高濃度蔗糖處理下，抑菌圈直徑可達(dá)到16.78 mm。

2.2.5紫外線照射對(duì)抑菌作用的影響乙酸乙酯萃取相經(jīng)15、30、45和60 min紫外線照射后對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用結(jié)果見圖7，與對(duì)照相比抑菌圈大小無明顯變化，說明紫外線照射對(duì)乙酸乙酯萃取相抑菌活性無明顯的影響。

圖6　不同蔗糖濃度對(duì)抑菌作用的影響Fig.6　The effect of different NaCl concentration against the antibacterial activity of acetyl acetate extraction

圖7　不同紫外線照射時(shí)間對(duì)抑菌作用的影響Fig.7　The effect of different UV irradiation time against the antibacterial activity of acetyl acetate extraction

2.3核桃青皮提取物抑菌機(jī)理的研究

2.3.1核桃青皮乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響核桃青皮乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響如圖8所示。對(duì)照組金黃色葡萄球菌在0～6 h之間處于調(diào)整期，6 h后開始大量繁殖進(jìn)入對(duì)數(shù)期，12 h時(shí)進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，20 h后進(jìn)入衰退期。經(jīng)過乙酸乙酯萃取相作用的金黃色葡萄球菌在整個(gè)生長(zhǎng)過程中未表現(xiàn)出大量繁殖，處理菌的調(diào)整期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期均被明顯延后延長(zhǎng)，表明乙酸乙酯萃取相對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖起到了明顯的抑制作用。

圖8　核桃青皮乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.8　Contrast of the growth curves of the normal Staphylococcus aureus and the growth curves of Staphylococcus aureus effect by acetyl acetate extraction

2.3.2核桃青皮乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)的影響透射電鏡觀察顯示（圖9）正常生長(zhǎng)的金黃色葡萄球菌呈完整的圓形或者橢圓形狀，菌體非常飽滿；細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，表面光滑；內(nèi)容物清晰可見且分布均勻。經(jīng)過乙酸乙酯萃取相處理12 h和18 h后的金黃色葡萄球菌變小，菌體不夠飽滿；部分菌體細(xì)胞膜萎縮與細(xì)胞壁分離出現(xiàn)空隙；菌體細(xì)胞壁表面粗糙；胞內(nèi)物質(zhì)模糊不清；18 h時(shí)菌體的變化比12 h更為明顯。結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取相明顯增加了金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的通透性，破壞了細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性。

圖9　正常的和處理后的金黃色葡萄球菌形態(tài)Fig.9　The normal and treated Staphylococcus aureus

2.3.3核桃青皮乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響乙酸乙酯萃取相加入后，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液上清的電導(dǎo)率明顯高于未處理的對(duì)照組（圖10），且隨處理時(shí)間的推移電導(dǎo)率越來越高，說明菌體內(nèi)離子的外漏程度隨乙酸乙酯萃取相作用時(shí)間的推移逐漸變大，菌體細(xì)胞膜受到損傷，實(shí)現(xiàn)抑菌效果，此結(jié)果同透射電鏡結(jié)果相一致。

圖10　乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響Fig.10　Effect of acetyl acetate extraction on electrical conductivity of Staphylococcus aureus’s culture supernatant

2.3.4核桃青皮乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)的影響核桃青皮乙酸乙酯相萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)的影響見圖11。對(duì)照組的金黃色葡萄球菌在整個(gè)生長(zhǎng)過程中的OD260非常穩(wěn)定，表示無細(xì)胞內(nèi)容物外溢。而加入乙酸乙酯萃取相的金黃色葡萄球菌初期的2 h內(nèi)OD260變化緩慢；之后隨著時(shí)間的推移，OD260呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，說明細(xì)胞內(nèi)有內(nèi)容物外溢，大分子物質(zhì)流出，菌體細(xì)胞膜的通透性及完整性有所改變，此結(jié)果同透射電鏡結(jié)果相符合。

圖11　乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)的影響Fig.11　Effect of acetyl acetate extraction on medium OD260nmvalues of Staphylococcus aureus

3　結(jié)論

3.1核桃青皮中存在著豐富的抑菌或殺菌活性物質(zhì)，從核桃青皮乙醇提取物中萃取的不同極性活性物質(zhì)對(duì)7種供試臨床耐藥細(xì)菌均有不同程度的抑制作用，各萃取相對(duì)供試菌抑制作用順序?yàn)椋阂宜嵋阴ハ啵韭确孪啵菊〈枷啵臼兔严唷Ｆ渲?，乙酸乙酯萃取相?duì)7種細(xì)菌均有較好抑制效果，具有廣譜抑菌作用；對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，MIC和MBC分別為0.781 mg/mL和1.563 mg/mL，其次是普通變形桿菌、銅綠假單胞菌和粘質(zhì)沙雷菌。其中大腸桿菌和腸炎沙門菌僅對(duì)乙酸乙酯萃取相敏感，石油醚、氯仿、正丁醇萃取相對(duì)這兩種菌抑制作用均不明顯。

3.2核桃青皮乙酸乙酯萃取相對(duì)溫度和紫外線的耐受力較強(qiáng)，表明乙酸乙酯萃取相所含活性物質(zhì)較為穩(wěn)定；抑菌作用受pH影響較大，在相應(yīng)pH范圍內(nèi)酸性越強(qiáng)抑制效果越好；NaCl和蔗糖的添加對(duì)菌體抑制作用也有一定影響，抑制作用隨濃度的升高而加大，其中滲透壓對(duì)菌體的抑制作用不可忽視。

3.3抑菌機(jī)理研究表明，經(jīng)過核桃青皮提取物乙酸乙酯萃取相處理后的菌體細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞壁及內(nèi)容物均受到損害，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)曲線發(fā)生變化，調(diào)整期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期均被明顯延后延長(zhǎng)；細(xì)胞內(nèi)容物溶出，OD260呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)；電導(dǎo)率明顯升高。

［1］高海生，朱鳳妹，李潤(rùn)豐.我國核桃加工產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)［J］.經(jīng)濟(jì)林研究，2008，26（3）：119-126.

［2］Yang J A，Qiu K Q.Preparation of activated carbons from walnut shells via vacuum chemical activation and their application for methylene blue removal［J］.Chemical Engineering Journal，2010，165（1）：209-217.

［3］Pereira J A，Oliveira I，Sousa A，et al.Walnut（Juglans regia L.） leaves：phenolic compounds，antibacterial activity and antioxidant potential of different cultivars［J］.Food and Chemical Toxicology，2007，45（11）：2287-2295.

［4］Lee K S，Li G，Kim S H，et al.Cytotoxic diarylheptanoids from the roots of Juglans and shurica［J］.Journal of natural products，2002，65（11）：1707-1708.

［5］Davis L，Stonehouse W，Mukuddem-Petersen J，et al.The effects of high walnut and cashew nut diets on the antioxidant status of subjects with metabolic syndrome［J］.European journal of nutrition，2007，46（3）：155-164.

［6］Márcia Carvalho，Pedro J Ferreira，Vanda S Mendes，et al. Human cancer cell antiproliferative and antioxidant activities of Juglans regia L.［J］.Food and Chemical Toxicology，2010，48（1）：441-447.

［7］翟梅枝，張鳳云，劉朝斌，等.核桃葉提取物對(duì)粘蟲和小菜蛾的拒食活性研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20（2）：138-140.

［8］丁存寶，吳卓尚，李桂秋，等.核桃青皮提取物的抗真菌活性研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2013，29（4）：722-724.

［9］Ravikumar，M Kalaiselvi，D Gomathi，et al.In vitro antibacterial and free radical scavenging activity of green hull of Juglans regia［J］.Journal of Pharmaceutical Analysis，2013，3（4）：298-302.

［10］A Fernández-Agulló，E Pereira，MS Freire，et al.Influence of solvent on the antioxidant and antimicrobial properties of walnut（Juglans regia L.）green husk extracts［J］.Industrial Crops and Products，2013，42：126-132.

［11］Vali Akbari，Rashid Jamei，Reza Heidari，et al.Antiradical activity of different parts of Walnut（Juglans regia L.）fruit as a function of genotype［J］.Food Chemistry，2012，135（4）：2404-2410.

［12］翟梅枝，王磊，何文君，等.核桃青皮乙醇提取物抑菌活性研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2009，29（12）：2542-2547.

［13］陳麗艷，施曉光，付玉杰，等.甘草根莖乙醇提取物抗菌活性研究［J］.植物研究，2006（3）：229-232.

［14］肖新生，林倩英.枇杷葉提取物抑菌作用研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2010，26（1）：59-62.

Antibacterial activity and mechanism of walnut green husk’extract

REN Xian-wei，WEI Xiao-lu，HUANG Xin，LIU Li*，F(xiàn)ENG Yue，XIA Xue-shan
（Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

The ethanol extracts from walnut green husk were further extracted with different solvents，including petroleum ether，chloroform，ethyl acetate and n-butanol.Antimicrobial activities of the different solvent extracts against 7 microorganisms were studied with the plate diluting method.The results showed that the different solvent extracts had certain inhibition effects on testing microbial and the order was ethyl acetate extract＞chloroform extract＞n-butanol extract＞petroleum ether extract.The ethyl acetate extract had obvious antibacterial effect and broad-spectrum antibacterial activity.The inhabitation of ethyl acetate extract was the best when the concentration was 50 mg/mL.Diameter of the inhibited ring was 19.94 mm to Staphylococcus aureus and the MIC（Minimum inhibitory concentration）and MBC（Minimal bactericidal concentration）were 0.781 and 1.563 mg/mL respectively.Temperature and ultraviolet（uv）had no effect to antibacterial activity，NaCl and sucrose had little influence on it，but it was greatly influenced by pH of culture medium and solution.The mainly antimicrobial mechanism was to destroy bacteria cell wall or membrane structure.

walnut green husk extract；antimicrobial activity；antimicrobial mechanism

TS201.3

A

1002-0306（2015）18-0093-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.010

2015－01－22

任先偉（1986-），男，碩士研究生，主要從事食品安全檢測(cè)及藥物生物活性方面的研究，E-mail：396329904@qq.com。

劉麗（1969-），女，碩士，教授，研究方向：環(huán)境微生物，E-mail：liuli2272@163.com。

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD46B00）。