黃小波，付 明，陳東明

（民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，懷化學(xué)院生命科學(xué)系，湖南 懷化 418008）

四棱豆總黃酮抗氧化和抗肝損傷作用研究

黃小波，付 明*，陳東明

（民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，懷化學(xué)院生命科學(xué)系，湖南 懷化 418008）

目的：探討四棱豆總黃酮體外和體內(nèi)抗氧化能力以及對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的修復(fù)效果。方法：利用超聲波輔助提取四棱豆種子總黃酮，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2，2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基、羥自由基的清除率和還原力表征四棱豆總黃酮的抗氧化活性。利用CCl4誘導(dǎo)昆明小鼠肝損傷，以不同劑量的四棱豆總 黃酮灌胃7 d，測定血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性和總膽紅素含量，測定肝、腎組織中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性及谷胱甘肽、丙二醛含量，免疫組化法觀察肝細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)水平，蘇木精-伊紅染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化。結(jié)果：體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明四棱豆總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化效果，四棱豆總黃酮各劑量組均能降低CCl4致小鼠急性肝損傷血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性和總膽紅素含量升高，降低肝、腎組織中丙二醛含量，增強(qiáng)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性和谷胱甘肽含量，抑制肝細(xì)胞中TNF-α表達(dá)，減輕CCl4對(duì)肝組織的損傷。結(jié)論：四棱豆總黃酮對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、抑制TNF-α表達(dá)有關(guān)。

四棱豆；抗氧化活性；護(hù)肝活性；腫瘤壞死因子-α

四棱豆（Psophocarpus tetragonolobus （L.） DC.），又名翼豆、翅豆、楊桃豆等，是豆科四棱豆屬的一年生或多年生草本植物。在我國大部分地區(qū)，如云南、廣西、廣東、海南、湖南、湖北、河南、福建等省區(qū)，均可種植栽培［1］。在湘西，侗族人常將四棱豆種子粉碎后做成茶飲，用于治療肝病、高血壓和口腔潰瘍等疾病，目前有關(guān)四棱豆的研究主要集中在種質(zhì)資源創(chuàng)新和引種栽培等方面［2-3］，相關(guān)藥理學(xué)研究鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用體外和體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)，結(jié)合CCl4致小鼠急性化學(xué)性肝損傷模型，對(duì)四棱豆種子總黃酮保護(hù)小鼠急性肝損傷和抗氧化作用進(jìn)行研究。

1　材料與方法

1 材料、動(dòng)物與試劑

四棱豆種子采集于湖南通道縣四棱豆栽培基地，經(jīng)懷化學(xué)院劉光華老師鑒定為豆科四棱豆屬一年生植物四棱豆（Psophocarpus tetragonolobus （L.） DC.），憑證標(biāo)本保存在懷化學(xué)院侗族藥用植物標(biāo)本館內(nèi)。40～50 ℃烘干種子，用中藥粉碎機(jī)粉碎，過60 目篩。

清潔級(jí)健康雄性KM小白鼠，體質(zhì)量（20±2） g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003，分籠飼養(yǎng)，飼料充足飲水不限，室溫20～25 ℃，適應(yīng)環(huán)境5 d后用于實(shí)驗(yàn)。

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transferase，GGT）測試盒、總膽紅素（total bilirubin，TB）測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測試盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）測試盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測試盒，丙二醛（malondialdehyde，MDA） 北京北化康泰臨床試劑有限公司；兔抗鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）一抗、羊抗兔IgGFITC二抗 武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑除注明外均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Infinite M200 TECAN 酶標(biāo)儀 瑞士TECAN集團(tuán)公司；AL104電子天平 瑞士Mettler-Toledo儀器公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；CTXNW-10B超聲波循環(huán)提取機(jī) 北京弘祥生物技術(shù)開發(fā)公司；DU-800紫外掃描分光光度計(jì) 美國貝克曼庫爾特公司。

1.3方法

1.3.1四棱豆總黃酮（total flavonoid of Psophocarpus tetragonolobus （L.） DC.，TFP）的提取

稱取干燥四棱豆5 kg，按1∶20（m/V）的料液比加入60%乙醇浸泡24 h，利用循環(huán)式超聲波提取儀于45 ℃條件下提取45 min；將提取液減壓濃縮，回收乙醇得水溶液；采用SB-8大孔樹脂純化提取液，先用20%乙醇洗脫去除雜質(zhì)，再用70%乙醇洗脫，得總黃酮的乙醇提取液，減壓濃縮回收乙醇后烘干粉碎得四棱豆總黃酮粉末。

1.3.2TFP總黃酮含量測定

精密稱取經(jīng)干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品20.0 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL，配成200 μg/mL蘆丁對(duì)照品溶液，準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0.0、0. 5、1.0、2. 0、3.0、4.0 mL移入10 mL具塞試管中，甲醇定容至5 mL，各加5 g/100 mL NaNO2溶液0.3 mL，振搖后放置5 min，加入10 g/100 mL Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L NaOH溶液2 mL，用甲醇定容至10 mL，靜置10 min，以零管為空白，搖勻后在510 nm波長處測定吸光度（A510nm），以A510nm為縱坐標(biāo)，以蘆丁的質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確稱取純化后的TFP浸膏1.0 g，加甲醇溶解并定容至500 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測定吸光度，并根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量。

1.3.3TFP體外抗氧化作用研究

1.3.3.1TFP對(duì)DPPH自由基的清除率

準(zhǔn)確稱取DPPH溶于甲醇中配制成0.06 mmol/L的溶液；參照文獻(xiàn)［4］將TFP樣品用甲醇配制成25、50、75、100、125、150、200 μg/mL的溶液，分別將不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.1 mL加入到3.5 mL DPPH甲醇溶液中，混合30 min后測定其在517 nm處的吸光度；以VC和二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）為對(duì)照，每份樣品平行操作3 次，按照公式（1）計(jì)算TFP對(duì)DPPH自由基的清除率。

式中：Ac為3.5 mL DPPH甲醇溶液與0.1 mL甲醇混合后的吸光度；As為3.5 mL DPPH甲醇溶液與0.1 mL樣品混合后的吸光度。

1.3.3.2TFP對(duì)ABTS+·的清除率

按照文獻(xiàn)［5］將等量的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合，避光放置 12～16 h；用無水乙醇稀釋至其在734 nm波長處吸光度為0.70±0.02，得到ABTS工作液。將樣品用甲醇配制成25、50、75、100、125、150 μg/mL，取0.15 mL樣品加入到2.85 mL ABTS工作液中，混合30 min后測定A734nm。以VC和BHT為對(duì)照，按照公式（2）計(jì)算TFP對(duì)ABTS+·的清除率。

式中：Ac為2.85 mL ABTS工作液與0.15 mL甲醇混合后的吸光度；As為2.85 mL ABTS工作液與0.15 mL樣品混合后的吸光度。

1.3.3.3TFP的還原力測定

參照文獻(xiàn)［6］將樣品配制成10、30、60、90、120、150 μg/mL的溶液，分別取各質(zhì)量濃度樣品液0.5 mL，加入0.2 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）1 mL和1 g/100 mL的K3［Fe（CN）6］溶液1 mL，混勻，于50 ℃條件下保溫20 min，加入體積分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸混合，取混合液1 mL，加入蒸餾水1 mL和1 g/100 mL FeCl330.5 mL，然后在700 nm波長處進(jìn)行比色測定吸光度［6］，以VC和BHT為對(duì)照，還原力即以A700nm表示。

1.3.3.4TFP對(duì)羥自由基（·OH）的清除率

根據(jù)TFP清除·OH能力的強(qiáng)弱來評(píng)價(jià)其抗氧化性的大小。參照文獻(xiàn)［7］的方法加以適當(dāng)改進(jìn)，將TFP配制成質(zhì)量濃度為125、200、275、350、425、500 μg/mL的樣品溶液，依次加入1 mL樣品、1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲-乙醇溶液、2 mL pH 7.4 PBS、1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和1 mL 2.4 mmol/L H2O2溶液，混勻后，37 ℃恒溫水浴60 min，于536 nm波長處測定吸光度；以VC和BHT為對(duì)照，每份樣品平行操作 3 次。按照公式（3）計(jì)算TFP對(duì)·OH的清除率。

式中：As為加入樣品反應(yīng)后溶液的吸光度；Aj為用水代替樣品的溶液吸光度；Ac為用水代替樣品和H2O2的溶液吸光度。

1.3.4TFP對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的修復(fù)作用

1.3.4.1小鼠肝損傷模型的建立和處理

實(shí)驗(yàn)用昆明小白鼠60 只，隨機(jī)分成6 組：Ⅰ組為正常組，在治療期間喂養(yǎng)10 mL/kg體質(zhì)量0.3 g/100 mL的羧甲基纖維素鈉；Ⅱ組為肝損傷模型組，分別給予10 mL/kg體質(zhì)量0.3 g/100 mL的羧甲基纖維素鈉；Ⅲ組為陽性對(duì)照組，給予100 mg/kg（以體質(zhì)量計(jì)，下同）的水飛薊素，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組分別為TFP低、中、高劑量組，分別給予100、200、400 mg/kg的TFP（按照純化物1.64 g/mL水溶液計(jì)算）。每天灌胃1 次，連續(xù)6 d，末次給藥2 h 后，Ⅱ～Ⅵ組按5 mL/kg腹腔注射體積分?jǐn)?shù)6%的CCl4橄欖油溶液1 次，禁食不禁水24 h，麻醉后眼眶取血測定生化指標(biāo)；脫頸處死小鼠，迅速剖腹取出肝臟和腎臟于冷的生理鹽水中洗凈血液備用，另外剪下肝右葉置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛中固定，待做病理和免疫組織化學(xué)檢測。

1.3.4.2生化指標(biāo)的測定

將小鼠血樣4 ℃、3 500 r/min離心10 min后取血清，自動(dòng)生化分析儀檢測血清ALT、AST、ALP、GGT活性和TB含量；分別取肝臟組織和腎臟組織加入生理鹽水于冰水浴中制成組織勻漿，離心后取上清液按試劑盒說明書方法測定SOD、CAT活性和GSH、MDA含量。

1.3.4.3肝臟組織的病理切片觀察

取小鼠肝臟右葉相同位置肝組織，用4 ℃生理鹽水沖洗后，濾紙拭干，浸泡于體積分?jǐn)?shù)10%中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織切片的病理變化。

1.3.4.4免疫組化法測定肝組織中TNF-α的表達(dá)

小鼠肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水，PBS沖洗后用0.4 g/100 mL胃蛋白酶鹽酸溶液在37 ℃條件下修復(fù)抗原30 min，再用PBS沖洗3次，每次5 min；用體積分?jǐn)?shù)10%正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min，滴加混合好的兔抗鼠TNF-α一抗，4 ℃過夜，再加入相應(yīng)的二抗、親和素-生物素系統(tǒng)。二氨基聯(lián)苯胺顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肝組織中TNF-α的表達(dá)。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用方差分析和t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都采用±s表示。

2　結(jié)果與分析

2.1四棱豆種子總黃酮的含量

四棱豆種子提取物經(jīng)過大孔樹脂純化后，得到浸膏253.6 g，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A = 12.657ρ－0.006（r = 0.999 7），A為蘆丁對(duì)照品溶液在510 nm波長處的吸光度，ρ為蘆丁質(zhì)量濃度，最后測得四棱豆種子提取物經(jīng)過純化后總黃酮純度達(dá)到84.6%。

2.2TFP的體外抗氧化作用

圖1　TFP的體外抗氧化作用Fig.1 In vitro free radical scavenging activity and antioxidant effect of TFP

在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中TFP對(duì)DPPH自由基、ABTS+·、·OH的清除效果及其還原力見圖1。由圖1A可知，TFP對(duì)DPPH自由基的清除效果呈現(xiàn)明顯劑量依賴性，在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)清除率為80.0%；圖1B顯示，在質(zhì)量濃度25～150 μg/mL范圍內(nèi)，TFP對(duì)ABTS+·的清除率隨著質(zhì)量濃度增加而增大，清除率最高達(dá)到80.2%；當(dāng)TFP質(zhì)量濃度為10～150 μg/mL時(shí)，TFP的還原力（A700nm）依次升高（圖1C）；另外，TFP對(duì)·OH同樣表現(xiàn)出明顯的清除效果（圖1D），在質(zhì)量濃度為125、500 μg/mL時(shí)對(duì)·OH的清除率分別為28.45%、81.90%，雖然TFP對(duì)以上自由基的清除效果及還原力不如VC和BHT，但是TFP也明顯體現(xiàn)了較強(qiáng)的體外抗氧化能力。

2.3TFP對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷模型血清中ALP、AST、ALT、GGT活力和TB含量的影響

表1　TFP對(duì)肝損傷小鼠血清中生化指標(biāo)的影Table 1 Effect of TFP on biochemical parameters of CCl4-induced liver injury mic

表1　TFP對(duì)肝損傷小鼠血清中生化指標(biāo)的影Table 1 Effect of TFP on biochemical parameters of CCl4-induced liver injury mic

注：#. 與正常組（Ⅰ組）比較，P＜0.05；##. 與正常組比較，P＜0.01；###. 與正常組比較，P＜0.001；*. 與肝損傷模型組（Ⅱ組）比較，P＜0.05；**. 與肝損傷模型組比較，P＜0.01；***. 與肝損傷模型組比較，P＜0.001。

組別ALT活力/（IU/L）AST活力/（IU/L）ALP活力/（IU/L）GGT活力/（IU/L） TB含量/（mg/ dL）I組42.56±2.2360.53±1.7375.34±1.6535.23±1.430.51±0.04Ⅱ組142.23±9.58###223.54±15.63###197.47±16.32###122.56±5.34###1.56±0.15###Ⅲ組58.35±4.18***72.87±4.89***80.23±5.26***48.56±4.53***0.65±0.04***Ⅳ組115.32±7.43*136.45±19.62**143.15±8.51**98.53±7.04**1.22±0.09**Ⅴ組88.46±2.65***98.73±8.54***113.46±7.16**78.15±4.15***1.04±0.06***Ⅵ組64.32±4.18***76.54±6.32***80.23±5.03***56.14±6.21***0.69±0.05***

由表1可知，與正常組比較，肝損傷模型組小鼠血清中的ALP、ALT、AST、GGT活力和TB含量顯著升高（P＜0.001），說明CCl4致小鼠肝損傷造模成功。與肝損傷模型組比較，陽性對(duì)照組（Ⅲ組，水飛薊素治療）和TFP各劑量組均能顯著降低小鼠血清中ALP、ALT、AST、GGT活力和TB含量（P＜0.01或P＜0.001）。

2.4TFP對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷肝、腎組織中SOD、CAT活力和GSH、MDA含量的影響

圖2　TFP對(duì)肝損傷小鼠肝腎組織中SOD、CAT、GSH和MDA的影響Fig.2 Effect of TFP on liver superoxide dismutase， catalase， MDA， and GSH in carbon tetrachloride-induced liver injury mice

如圖2所示，與正常組對(duì)比，肝損傷模型組小鼠肝、腎組織中的SOD、CAT活力和GSH含量均顯著降低（P＜0.001），而MDA含量顯著升高（P＜0.001），與肝損傷模型組相比，TFP各劑量組小鼠肝、腎組織中的SOD、CAT活力和GSH含量均顯著升高（P＜0.001或P＜0.01），而MDA的含量明顯降低（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05）。

2.5TFP對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠的肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

圖3　TFP對(duì)CCCCll4致小鼠急性肝損傷的肝組織病理切片的光鏡觀察結(jié)果Fig.3 Pathologic observation of CCl4-induced acute liver injury in miceshowing the ventral veins and hepatic cells

如圖3所示，正常組小鼠肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索中央靜脈為中心，成輻射狀排列，匯管區(qū)可見小葉間血管和膽管，肝細(xì)胞無變性、壞死等損傷性改變（圖3A）；肝損傷模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，中央?yún)^(qū)肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的水樣變性或脂肪變性，甚至壞死，伴隨炎癥細(xì)胞浸潤（圖3B）；陽性對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，但肝小葉中央?yún)^(qū)肝細(xì)胞排列紊亂，可見肝細(xì)胞水樣變性或脂肪變性，偶見壞死，伴隨炎癥細(xì)胞浸潤（圖3C）；與肝損傷模型組比較，TFP各劑量組可明顯改善小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)，不同程度地減少CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷中肝細(xì)胞的炎性浸潤、水腫和壞死等（圖3D～3F）。

2.6TFP對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織TNF-α表達(dá)的影響

圖4　TFP對(duì)CCCCll4致急性肝損傷小鼠肝組織TTNNFF--α表達(dá)的影響Fig.4 Effect of TFP on the expression of TNF-α in mice with CCl4-induced acute injury

如圖4所示，正常組小鼠肝臟中幾乎沒有TNF-α表達(dá)（圖4A），肝損傷模型組小鼠肝臟中TNF-α呈高表達(dá)（圖4B），陽性對(duì)照組以及TFP各劑量組小鼠肝組織中TNF-α的表達(dá)量明顯減弱（圖4C～4F）。

3　討 論

黃酮類化合物具有抗自由基、抗氧化、抗腫瘤，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、保肝護(hù)肝，抑菌和抑制細(xì)胞凋亡等作用［8］。李加興等［9］發(fā)現(xiàn)黃秋葵黃酮對(duì)·OH、O2－·、DPPH自由基的最大清除率分別達(dá)31.49%、64.40%、62.22%，且具有較強(qiáng)的還原力，表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。杜鵑等［10］發(fā)現(xiàn)芹菜籽黃酮在一定濃度范圍內(nèi)能抑制DPPH自由基和·OH的生成，自由基清除效果與黃酮提取物濃度呈現(xiàn)一定的量-效關(guān)系，其總抗氧化能力逐漸加強(qiáng)。董孝元等［11］發(fā)現(xiàn)蘆筍黃酮對(duì)·OH、O2－·的清除率分別達(dá)46.08%、59.42%，并能提高SOD活性，降低MDA含量。陳明珠等［12］的研究結(jié)果表明，槐角黃酮具有一定的抗氧化能力。

CCl4在肝臟代謝過程中，代謝產(chǎn)物直接或間接導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷，使許多活性物質(zhì)如各種轉(zhuǎn)氨酶和磷酸酶從肝臟中逃逸出來，因此CCl4常被用來構(gòu)建肝損傷模型以評(píng)價(jià)藥物的抗肝損傷作用［13］。CCl4經(jīng)酶系統(tǒng)作用后，生成三氯甲基自由基（·CCl3），·CCl3與氧反應(yīng)生成CCl3OO－·［14］。這些自由基進(jìn)一步引發(fā)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜和肝組織損傷［15］。GSH、SOD、CAT為機(jī)體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶，可防止氧化損傷［16］。SOD將O2－·轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，從而參與氧自由基的清除；CAT將H2O2分解為水，會(huì)抑制自由基誘導(dǎo)細(xì)胞損傷［17］。GSH水平是評(píng)價(jià)肝臟和腎臟氧化損傷的另一個(gè)抗氧化參數(shù)，在CCl4處理的小鼠中，肝臟GSH含量降低表明CCl4對(duì)肝細(xì)胞有損害作用。MDA是自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸而引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量的多少可反映組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化速率或強(qiáng)度［18-19］。周軍等［20］發(fā)現(xiàn)桑葉黃酮能顯著降低CCl4所致小鼠血清ALT和AST活性的升高，升高SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，降低MDA含量，從而保護(hù)肝細(xì)胞。于偉凡［21］發(fā)現(xiàn)高、中劑量的馬鞭草總黃酮能降低血清中ALT、AST活性，升高肝組織中SOD、GSH-Px和CAT活性，降低MDA、NO的含量，對(duì)CCl4所造成的肝細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用。在本研究中，通過CCl4誘導(dǎo)，肝損傷模型組小鼠肝損傷標(biāo)記酶如AST、ALT、ALP、GGT活性升高，經(jīng)過各劑量TFP的治療，可明顯降低小鼠血清中各種酶的活力和TB的含量；小鼠肝臟和腎臟組織中SOD、CAT活力和GSH含量明顯降低，MDA含量明顯增加，通過不同劑量TFP的治療，小鼠肝、腎組織中的SOD、CAT活力和GSH含量都明顯提高，而MDA含量明顯降低。

此外，CCl4進(jìn)入肝臟中會(huì)迅速破壞線粒體的結(jié)構(gòu)，使某些轉(zhuǎn)氨酶和抗氧化酶遭到破壞，自由基激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，從而產(chǎn)生具有高活性的細(xì)胞因子如TNF-α等［22］，TNF-α是引起急、慢性肝損傷的重要因素之一，直接或間接引起肝細(xì)胞的免疫損傷［23］；TNF-α還可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生凋亡刺激因子，誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞凋亡［24］。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織中幾乎不表達(dá)TNF-α，而肝損傷模型組中大量表達(dá)TNF-α，陽性對(duì)照組和TFP各劑量組小鼠肝組織表達(dá)TNF-α的量明顯減弱，說明水飛薊素和TFP對(duì)肝細(xì)胞損傷有明顯改善作用。

綜上所述，四棱豆種子中的總黃酮對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與清除自由基、減輕脂質(zhì)過氧化、保護(hù)肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，以及提高肝細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，還可減少肝組織內(nèi)TNF-α過度表達(dá)而誘發(fā)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

［1］ 王佩芝， 許冠南. 一種有待開發(fā)的稀有蔬菜： 四棱豆［J］. 中國蔬菜，1991（3） ： 30-32.

［2］ 楊衍， 劉維俠， 劉昭華， 等. 四棱豆種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀的主成分及聚類分析［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2012， 38（8）： 1389-1393.

［3］ 陳東明， 全妙華， 艾辛， 等. 四棱豆的開發(fā)利用價(jià)值及其高產(chǎn)栽培技術(shù)［J］. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2005（4）： 21-23.

［4］ OYEDEMI S O， BRADLEY G， AFOLAYAN A J. In vitro and in vivo antioxidant activities of aqueous extract of Strychnos henningsii Gilg.［J］. African Journal Pharmacy and Pharmacology， 2010， 4（2）： 70-78.

［5］ WU Lichen， HSU Hsiuwen， CHEN Yunchen， et al. Antioxidant and antiproliferative activities of red pitaya［J］. Food Chemistry， 2006，95（2）： 319-327.

［6］ OYAIZU M. Studies on products of browning reactions： antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine［J］. Japanese Journal of Nutrition， 1986， 44： 307-315.

［7］ SMIRNOFF N， CUMBES Q J. Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes［J］. Phytochemistry， 1989， 28（4）： 1057-1060.

［8］ 徐靜娟， 姚茂君， 鄔敏辰， 等. 二氫楊梅素生物功效的研究［J］. 食品科學(xué)， 2008， 29（11）： 622-625.

［9］ 李加興， 陳選， 鄧佳琴， 等. 黃秋葵黃酮的提取工藝和體外抗氧化活性研究［J］. 食品科學(xué)， 2014， 35（10）： 121-125. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201410022.

［10］ 杜鵑， 宋春梅， 張嵐， 等. 芹菜籽黃酮體外抗氧化活性研究［J］. 食品研究與開發(fā)， 2013， 34（21）： 3-6.

［11］ 董孝元， 方冬芬， 楊梅， 等. 纖維素酶輔助提取蘆筍黃酮及其抗氧化活性分析［J］. 食品科學(xué)， 2014， 35（6）： 17-23. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201406004.

［12］ 陳明珠， 申艷艷， 趙越， 等. 槐角黃酮的體外抗氧化活性研究［J］. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（4）： 94-96.

［13］ 鞠洋， 駱勤， 黨月蘭. 紅毛五加多糖對(duì)四氯化碳肝損傷大鼠的保護(hù)作用［J］. 中藥藥理與臨床， 2005， 21（3）： 25-26.

［14］ 閆冰， 丁安偉， 張麗. 二至丸提取物對(duì)小鼠四氯化碳急性肝損傷的保護(hù)作用［J］. 中國中藥雜志， 2010， 35（22）： 3080-3083.

［15］ ZHOU Daonian， RUAN Jinlan， CAI Yaling， et al. Antioxidant and hepatoprotective activity of ethanol extract of Arachniodes exilis（Hance） Ching［J］. Journal of Ethnopharmacology， 2010， 129（2）：232-237.

［16］ HALLIWELL B， GUTTERIDGE J M C. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease： an overview［J］. Methods in Enzymology， 1990， 186： 1-85.

［17］ SRINIVASAN R， CHANDRASEKAR M J N， NANJAN M J， et al. Antioxidant activity of Caesalpinia digyna root［J］. Journal of Ethnopharmacology， 2007， 113（2）： 284-291.

［18］ WEBER L W D， BOL L M， STAMPFL A. Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes： carbon tetrachloride as a toxicological model［J］. Critical Reviews in Toxicology， 2003， 33（2）：105-136.

［19］ 黃玉軍， 陳霞， 顧瑞霞， 等. 嗜熱鏈球菌grx02發(fā)酵乳對(duì)大鼠酒精性肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 營養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2012， 34（2）： 164-171.

［20］ 周軍， 張福華. 桑葉黃酮對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷保護(hù)作用［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2013， 19（15）： 269-272.

［21］ 于偉凡. 馬鞭草總黃酮對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷的影響［J］. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2013， 32（10）： 1289-1292.

［22］ 朱濤， 周麗萍， 應(yīng)斌宇， 等. 肝病大鼠創(chuàng)傷弧菌攻擊后肝細(xì)胞損傷和血清細(xì)胞因子檢測［J］. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2005， 35（6）： 452-456.

［23］ 胡成穆， 姜輝， 劉洪峰， 等. 金銀花總黃酮對(duì)免疫性肝損傷小鼠的影響［J］. 安徽醫(yī)學(xué)， 2008， 12（4）： 295-297.

［24］ GABELE E， FROH M， ARTEEL G E， et al. TNFα is required for cholestasis-induced liver fibrosis in the mouse［J］. Biochemical Biophysical Research Communications， 2009， 378（3）： 348-353.

Antioxidant Activity and Hepatoprotective Activity of Total Flavonoids from Psophocarpus tetragonolobus （L.） DC. Seeds

HUANG Xiaobo， FU Ming*， CHEN Dongming
（Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources， Department of Life Science，Huaihua University， Huaihua 418008， China）

Objective： To investigate the hepatoprotective and antioxidant effects of total flavonoids from Psophocarpus tetragonolobus （L.） DC. seeds （TFP） in vitro and in vivo. Methods： The antioxidant activity of TFP in vitro was determined by scavenging capacities against DPPH， ABTS， and hydroxyl free radicals as well as reducing power. Mice with carbon tetrachloride （CCl4）-induced liver injury were used to assess the hepatoprotective and antioxidant activity of TFP in vivo. The activities of alkaline phosphatase （ALP）， glutamate pyruvate transaminase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST） and gamma-glutamyl transpeptidase （GGT） and total bilirubin （TB） level in serum， and the levels of malondialdehyde （MDA）and glutathione （GSH） and the activities of superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） in the liver and kidney of mice were assayed using standard procedures. Immunohistochemistry was used to detect the expression of TNF-α in hepatic tissue. Meanwhile hepatic histopathological examination was observed. Results： TFP exhibited strong antioxidant activity. TFP at all investigated doses significantly lowered the levels of serum ALT， AST， ALP， GGT， TC， TG and TB and the levels of hepatic and renal MDA， enhanced the activities of SOD and CAT， and greatly inhibited the expression of TNF-α in mice with acute liver injury induced by CCl4， thus ameliorating the liver damage in mice. Conclusion： TFP has a significant hepatoprotective effect on CCl4-induced acute liver injury in mice， possibly by scavenging free radicals and inhibiting lipid peroxidation and TNF-α expression.

Psophocarpus tetragonolobus （L.） DC.； antioxidant activity； hepatoprotective activity； tumor necrosis factor-α （TNF-α）

TS201.4

A

1002-6630（2015）15-0206-06

10.7506/spkx1002-6630-201515038

2014-09-24

湖南省植物學(xué)重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（2011-42）；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013FJ6090）

黃小波（1983—），男，講師，碩士，研究方向?yàn)樗幱弥参锷鷳B(tài)學(xué)及利用。E-mail：4429463@163.com

付明（1966—），女，副教授，學(xué)士，研究方向?yàn)樗幱弥参锏膽?yīng)用與開發(fā)。E-mail：fm6988@163.com