周 康，楊兆錁，劉書亮，韓新鋒

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

鯉魚中腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)模型的建立和驗(yàn)證

周 康，楊兆錁，劉書亮，韓新鋒

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

利用市售鯉魚中分離鑒定得到的腐敗希瓦氏菌進(jìn)行了生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立。通過預(yù)測(cè)微生物學(xué)的方法比較Logistic、Gompertz和Baranyi模型的生物學(xué)特性和應(yīng)用特性，對(duì)3 種模型所得參數(shù)進(jìn)而構(gòu)建了二級(jí)模型并分別進(jìn)行了內(nèi)部和外部驗(yàn)證。結(jié)果表明：Logistic、Gompertz和Baranyi模型在內(nèi)部驗(yàn)證中的r2分別為0.982 4、0.983 6和0.988 4，偏差因子（bias factor，Bf）分別為0.985 0、0.995 0和0.970 0；而外部驗(yàn)證Bf值分別為0.804、1.177和0.826。Baranyi模型在對(duì)微生物生長(zhǎng)的預(yù)測(cè)性上不僅準(zhǔn)確，而且能夠更加有效地進(jìn)行食品安全預(yù)警，在實(shí)際的農(nóng)產(chǎn)品和食品領(lǐng)域具有很好的實(shí)用價(jià)值。

生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型；內(nèi)部驗(yàn)證；外部驗(yàn)證；腐敗希瓦氏菌

腐敗希瓦氏菌是水產(chǎn)品中最常見的一類腐敗菌，在低溫中可以存活并生長(zhǎng)，不僅能導(dǎo)致食品腐敗，還能引起人類患?。?］，嚴(yán)重地影響著水產(chǎn)業(yè)及其農(nóng)副業(yè)的生產(chǎn)和銷售［2］。因此，如何保證水產(chǎn)品及其農(nóng)副產(chǎn)品的質(zhì)量，防止食物中毒就顯得尤為重要。一般而言，采用預(yù)測(cè)微生物學(xué)的方法對(duì)食品和農(nóng)產(chǎn)品中的微生物進(jìn)行預(yù)測(cè)是現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的可行方法之一［3］。

在國(guó)內(nèi)的預(yù)測(cè)微生物學(xué)研究中，多采用Logistic［4］和Gompertz模型［5］，而采用Baranyi模型進(jìn)行研究的報(bào)道還相對(duì)較少［6］，而在國(guó)外已有大量文獻(xiàn)在使用該模型［7-9］，尤其是全球最大的開源微生物預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)Combase中也全部都采用Baranyi模型進(jìn)行擬合回歸［10］。因而對(duì)這一模型進(jìn)行深入和全面的研究，了解其生物學(xué)意義和數(shù)學(xué)特性對(duì)于實(shí)際中應(yīng)用預(yù)測(cè)模型進(jìn)行安全預(yù)警是十分必要的。

本實(shí)驗(yàn)比較了Logisitc、Gompertz和Baranyi模型，通過內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)Baranyi模型具有更好的預(yù)測(cè)效果和生物學(xué)性能，能夠?yàn)槭称泛娃r(nóng)業(yè)中微生物引起的危害起到良好的預(yù)警效果。

1　材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

腐敗希瓦氏菌分離自市售鯉魚，經(jīng)生理生化鑒定及分子鑒定為腐敗希瓦氏菌，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏。經(jīng)30 ℃活化3 次后用于生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

選用胰蛋白胨大豆肉湯（tryptose soya broth，TSB）培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養(yǎng)基分別作為微生物生長(zhǎng)和計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。

1.2方法

將活化好的菌株按10 倍梯度稀釋后，以約為103CFU/mL的接種量接種于TSB中培養(yǎng)，選擇適當(dāng)時(shí)間取樣測(cè)定其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線。每次實(shí)驗(yàn)取3 個(gè)稀釋梯度，每個(gè)稀釋梯度3 個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)所選溫度為：4、10、20、30 ℃和37 ℃。

1.3模型的建立

1.3.1一級(jí)模型的建立

分別采用Logistic模型（公式（1））、修正Gompertz模型（公式（2））［11］和Baranyi模型（公式（3））［12］對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和比較。采用Microsoft Excel軟件中的規(guī)劃求解以最小二乘法的原理進(jìn)行擬合。

式中：x（t）為微生物在時(shí)間t時(shí)的數(shù)量（lg（CFU/mL））；A為隨時(shí)間無(wú)限減小時(shí)漸進(jìn)對(duì)數(shù)值；B為相對(duì)最大生長(zhǎng)速率/h－1；C為隨時(shí)間無(wú)限增加時(shí)菌的增量（lg（CFU/mL））；D為達(dá)到相對(duì)最大生長(zhǎng)速率所需要的時(shí)間/h。

其中

式中：y（t）為微生物在時(shí)間t時(shí)的自然對(duì)數(shù)值（ln（CFU/mL））；y0為微生物的初始濃度（ln（CFU/mL））；ymax為微生物的最大濃度（ln（CFU/mL））；μmax為最大生長(zhǎng)速率/h－1；v為底物限值參數(shù)；h0為初始生理狀態(tài)參數(shù)α0的對(duì)數(shù)形式，

1.3.2二級(jí)模型的建立

采用Ratkowsky模型（公式（4））對(duì)一級(jí)模型所獲得的最大生長(zhǎng)速率（μmax）進(jìn)行二級(jí)模型的建立。采用Microsoft Excel中的規(guī)劃求解進(jìn)行二級(jí)模型的建立。

將一級(jí)模型求得的μmax和對(duì)應(yīng)的溫度變量代入上式中，擬合出模型參數(shù)

1.3.3模型的驗(yàn)證

驗(yàn)證采用內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證同時(shí)進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)從Combase數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇了基本符合本實(shí)驗(yàn)條件的32 組數(shù)據(jù)進(jìn)行外部驗(yàn)證，其中25 組是從培養(yǎng)基中獲得的數(shù)據(jù)，7 組是從食品中獲得的數(shù)據(jù)。選擇外源數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，不僅能說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所建模型的準(zhǔn)確程度，還能體現(xiàn)模型的安全性，說(shuō)明其在實(shí)際中進(jìn)行預(yù)測(cè)的潛在價(jià)值。

通過判定系數(shù)r2、均方誤差（mean square error，MSE）、偏差因子（bias factor，Bf）和準(zhǔn)確因子（accuracy factor，Af）來(lái)驗(yàn)證模型，公式如下［15-16］：

2　結(jié)果與分析

2.1一級(jí)模型的建立

腐敗希瓦氏菌在4 ℃依然可以緩慢的生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)速率根據(jù)Logistic、Gompertz和Baranyi模型求得分別為0.051、0.035、0.042 h－1。在37 ℃時(shí)根據(jù)Baranyi模型求得的生長(zhǎng)速率為0.337 h－1，較30 ℃條件下0.446 h－1緩慢，這也與腐敗希瓦氏菌的一般生長(zhǎng)情況近似。各一級(jí)模型與觀測(cè)數(shù)據(jù)擬合情況如圖1所示，其判定系數(shù)r2均高于0.96，可知3 種一級(jí)模型均可很好地對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合回歸。

圖1　腐敗希瓦氏菌在不同溫度條件下生長(zhǎng)曲線及各一級(jí)模型擬合曲線Fig.1 Growth curves and predictive model of Shewanella putrefacens at different temperatures

2.2二級(jí)模型的建立

使用最大生長(zhǎng)速率、延滯期和最大生長(zhǎng)量等參數(shù)進(jìn)行二級(jí)模型建立的研究已經(jīng)有很多了，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)在于以內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證方法，來(lái)比較3 種一級(jí)模型的預(yù)測(cè)性能和生物學(xué)特性，因而僅選擇其中最大生長(zhǎng)速率進(jìn)行二級(jí)模型的建立，其模型參數(shù)如表1所示。

表1　腐敗希瓦氏菌在不同溫度條件下的二級(jí)模型參數(shù)Table 1 Parameters of the secondary models

由表1可知，采用Baranyi模型獲得的最大生長(zhǎng)速率略高于Logistic和Gompertz模型獲得的最大生長(zhǎng)速率。因此在二級(jí)模型的建立時(shí)，其Tmin和Tmax都略高于另外兩種模型。此外，在二級(jí)模型的整體預(yù)測(cè)中（圖2），Baranyi模型也較Logistic和Gompertz模型所預(yù)測(cè)的最大生長(zhǎng)速率快一些，而Gompertz模型則將最大生長(zhǎng)速率預(yù)測(cè)得較慢。

圖2　溫度對(duì)不同一級(jí)模型所獲得的最大生長(zhǎng)速率的影響Fig.2 Effect of temperature on the maximum growth rate estimated from different primary models

2.3模型的驗(yàn)證

2.3.1內(nèi)部驗(yàn)證

模型驗(yàn)證比較了3 種一級(jí)模型的數(shù)學(xué)和生物學(xué)特性。內(nèi)部驗(yàn)證通過本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)與所建立的預(yù)測(cè)模型進(jìn)行比較，確定和比較各一級(jí)模型的準(zhǔn)確性和安全性；外部比較是以其他研究者已經(jīng)發(fā)表的數(shù)據(jù)與本實(shí)驗(yàn)所建立的預(yù)測(cè)模型進(jìn)行比較，從而確定本研究所得各一級(jí)模型的實(shí)用性和安全性。驗(yàn)證僅就最大生長(zhǎng)速率進(jìn)行討論，不涉及其他一級(jí)模型中的參數(shù)。

表2　腐敗希瓦氏菌在不同溫度條件下二級(jí)模型的內(nèi)部驗(yàn)證Table 2 Internal validation of the secondary models

由表2可知，r2（0＜r2＜1）越大說(shuō)明建立的模型與實(shí)際測(cè)量越接近；MSE（MSE＞0）越小，說(shuō)明建立的模型與實(shí)際測(cè)量越接近，但是由于Baranyi模型采用自然對(duì)數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，因此其MSE值較Logistic模型和Gompertz模型要高（ln10）2。

Bf是描述觀測(cè)值所處位置為預(yù)測(cè)值所構(gòu)成曲線的上方、下方還是正好在曲線上的參數(shù)，同時(shí)該值還能度量觀測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間存在差距的大小，即該模型結(jié)構(gòu)性誤差的多少。當(dāng)該值小于1時(shí)，即平均預(yù)測(cè)值大于平均觀測(cè)值，說(shuō)明該模型安全。

Af描述了各觀測(cè)值所得到的點(diǎn)與預(yù)測(cè)值構(gòu)成的曲線之間的平均距離。Af越大說(shuō)明模型平均準(zhǔn)確性越低，當(dāng)該值為1時(shí)說(shuō)明觀測(cè)與預(yù)測(cè)完全吻合，當(dāng)該值為2時(shí)說(shuō)明預(yù)測(cè)與觀測(cè)之差大致為2 h－1［15-16］。

在內(nèi)部驗(yàn)證中，基于Baranyi模型建立的二級(jí)模型具有有更大的r2，其MSE和Af綜合起來(lái)也優(yōu)于另外兩種模型。此外，由于Bf是預(yù)測(cè)模型是否安全的重要判斷依據(jù)［17］，因此，在可接受的范圍內(nèi)，較大的μ預(yù)測(cè)可以更早地預(yù)警某種微生物快速生長(zhǎng)所引起的食品危害，達(dá)到保證食品安全的目的，因此根據(jù)Bf公式可知該值越小其模型越具有預(yù)警的效果［18］。

一般認(rèn)為Bf值在0.90～1.05的范圍之內(nèi)，該模型能夠很好地預(yù)測(cè)微生物生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)狀況；Bf值在0.70～0.90或者1.06～1.15范圍之內(nèi)，則該模型是可以被接受的；如果Bf值大于1.15或者小于0.70，則說(shuō)明該模型是失敗的［16］。也有研究者認(rèn)為，在水產(chǎn)品貨架期的預(yù)測(cè)中，Bf介于0.75～1.25之間也可認(rèn)為模型是可靠、實(shí)用的［19-20］。

2.3.2外部驗(yàn)證

對(duì)二級(jí)模型的外部驗(yàn)證可以通過其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行，以驗(yàn)證本研究獲得模型的安全性，進(jìn)而知道該模型在生產(chǎn)和監(jiān)控應(yīng)用中是否能夠具有很好的實(shí)用性，也可在一定程度上體現(xiàn)模型的準(zhǔn)確性。

圖3　腐敗希瓦氏菌在不同溫度條件下二級(jí)模型的外部驗(yàn)證Fig.3 External validation of the secondary models

由圖3可知，在以Baranyi模型為基礎(chǔ)的二級(jí)模型中，散點(diǎn)多分布于對(duì)角線上側(cè)，說(shuō)明基于該模型建立的二級(jí)模型所得到的預(yù)測(cè)值較觀測(cè)值普遍要大。而Gompertz模型所得散點(diǎn)多分布于對(duì)角線下端，說(shuō)明其預(yù)測(cè)的μmax較小?；贚ogistic、Gompertz和Baranyi模型建立的二級(jí)模型在外部驗(yàn)證時(shí)，其Bf值分別為0.804、1.177、0.826。說(shuō)明在安全性上，Logistic和Baranyi模型優(yōu)于Gompertz模型，而在準(zhǔn)確性上，Baranyi模型優(yōu)于Logistic模型。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)鯉魚中的腐敗希瓦氏菌采用Logistic、Gompertz和Baranyi模型獲得了在不同溫度下的μmax，并對(duì)μmax進(jìn)行了二級(jí)模型的建立。在本實(shí)驗(yàn)的一級(jí)模型建立中，3 種模型都可較好地?cái)M合了微生物生長(zhǎng)。但是在二級(jí)模型的驗(yàn)證中，Baranyi模型的性能要優(yōu)于其他兩種模型，這也與近年來(lái)對(duì)于Baranyi模型的研究結(jié)果相一致［21-22］。本實(shí)驗(yàn)通過內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證對(duì)3 種一級(jí)模型進(jìn)行比較，在內(nèi)部驗(yàn)證中，Baranyi模型具有更好的安全性和準(zhǔn)確性，在外部驗(yàn)證中Baranyi模型也具有更好的安全性和實(shí)用性。

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Modeling and Validation of the Growth of Shewanella putrefaciens from Cyprinus carpio

ZHOU Kang， YANG Zhaoke， LIU Shuliang， HAN Xinfeng
（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya'an 625014， China）

A strain isolated from marketed common carp （Cyprinus carpio）， identified as Shewanella putrefacens by biological and molecular identification methods， was used in the growth modeling study. The obtained data were fitted with three different primary models including Logistic， Gompertz and Banrayi models and the fitted models were validated with coefficients of determination （r2） of 0.982 4， 0.983 6 and 0.988 4， as well as bias factor （Bf） of 0.985 0， 0.995 0 and 0.970 0 in the internal validation and 0.804， 1.177 and 0.826 in the external validation， respectively. The results showed that the Baranyi model not only had a goodness-of-fit， but also could provide effective early warnings of microbial food safety risks. Therefore， the Baranyi model has a great potential for application in agricultural products and foods.

growth kinetic model； internal validation； external validation； Shewanella putrefacens

TS254

A

1002-6630（2015）15-0147-04

10.7506/spkx1002-6630-201515027

2014-09-09

四川省教育廳科研項(xiàng)目（13ZA0265）

周康（1983—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：kang_zhou@163.com