林凱旋　安輝　繆燦銘　黃國強(qiáng)　刁建新

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中山附屬醫(yī)院，廣東中山528400；2.南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，廣東廣州510000）

益氣化瘀方對(duì)缺血-再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響*

林凱旋1安輝1繆燦銘1黃國強(qiáng)1刁建新2

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中山附屬醫(yī)院，廣東中山528400；2.南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，廣東廣州510000）

目的觀察益氣化瘀方對(duì)缺血-再灌注（I/R）大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Fas及P53表達(dá)的影響。方法采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，心肌缺血30 min，再灌注2、4 h制作缺血-再灌注模型。將大鼠隨機(jī)分為7組，即假手術(shù)組、模型2 h組（缺血-再灌注2 h）、模型4 h組（缺血-再灌注4 h組）、通心絡(luò)2 h組（缺血-再灌注2 h）、通心絡(luò)4 h組（缺血-再灌注4 h）、益氣化瘀方2 h組（缺血-再灌注2 h）、益氣化瘀方4 h組（缺血-再灌注4 h）。造模前連續(xù)灌胃相應(yīng)藥物1周。免疫組化法測(cè)定Bcl-2、Bax、Caspase-3、Fas、P53蛋白表達(dá)。結(jié)果益氣化瘀方可提高缺血-再灌注大鼠心肌Bcl-2蛋白表達(dá)量（P＜0.05）、降低缺血-再灌注大鼠心肌Bax、Caspase-3、Fas、P53蛋白表達(dá)量（P＜0.05）。結(jié)論益氣化瘀方可減輕大鼠心肌缺血-再灌注細(xì)胞凋亡，其機(jī)理可能與上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)和下調(diào)Bax、Caspase-3、fas、P53蛋白表達(dá)有關(guān)。

缺血-再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡益氣化瘀方Bcl-2蛋白Bax蛋白Caspase-3蛋白fas蛋白P53蛋白

近年來，細(xì)胞凋亡的研究改變了人們對(duì)許多心血管疾病的認(rèn)識(shí)。既往認(rèn)為心肌缺血、缺血/再灌損傷造成的心肌細(xì)胞死亡形式是細(xì)胞壞死。近年研究證明［1］，氧化應(yīng)激、負(fù)荷過重、缺血、缺氧、再灌注損傷等不僅引起心肌細(xì)胞壞死，還可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是受一系列程序控制并通過信號(hào)通路介導(dǎo)的病理過程，阻斷其信號(hào)通路將有助于阻斷凋亡發(fā)生，防止心肌細(xì)胞數(shù)目的減少，維持或改善心功能［2］。筆者通過多年的臨床觀察發(fā)現(xiàn)：益氣化瘀方能減少急性心肌梗死冠狀動(dòng)脈介入手術(shù)（PCI）后再灌注損傷。為明確其機(jī)理，本研究應(yīng)用大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注模型，采用免疫組化法對(duì)心肌凋亡相應(yīng)調(diào)控蛋白進(jìn)行觀察，為防治心肌缺血/再灌損傷從而促進(jìn)心肌細(xì)胞功能恢復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物健康雄性SD大鼠（鼠齡3個(gè)月左右）42只，體質(zhì)量（220±20）g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SXCK粵2011-0015。

1.2試劑與儀器益氣化瘀方：中山市中醫(yī)院制劑室制造，批號(hào)：粵20130227。通心絡(luò)膠囊：石家莊以嶺藥業(yè)，批號(hào)：120404。細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（POD）購自Roche公司，SP試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3分組與給藥將42只SD大鼠隨機(jī)分為7組：假手術(shù)組、模型2 h組（30 min心肌缺血后再灌注2 h）、模型4 h組（30 min心肌缺血后再灌注4 h）、通心絡(luò)2 h組（30 min心肌缺血后再灌注2 h）、通心絡(luò)4 h組（30 min心肌缺血后再灌注4 h）、益氣化瘀方2 h組（30 min心肌缺血后再灌注2 h）、益氣化瘀方4 h組（30 min心肌缺血后再灌注4 h），每組6只。各組大鼠于造模前1周開始灌胃給藥，連續(xù)7 d。益氣化瘀方組予益氣化瘀方1.8 mL［生藥含量7.2 g/（kg·d）］，通心絡(luò)組予通心絡(luò)藥粉兌入0.9%氯化鈉注射液溶液1.8 mL［生藥含量0.142 g/（kg·d）］，其余3組予等量0.9%氯化鈉注射液。

1.4模型制備10%烏拉坦腹腔注射麻醉（1 mL/100 g）大鼠，仰臥位固定，用針型電極插入大鼠四肢皮下記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于胸骨左緣3～4肋間切開胸壁，暴露心臟，在左心耳與肺動(dòng)脈于之間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，同時(shí)在結(jié)扎線與血管之間穿一直徑2 mm，長(zhǎng)5 mm的硅膠管，結(jié)扎30 min；然后剪斷縫合線，取出硅膠管，各組分別再灌注2 h或再灌注4 h，以往已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)此缺血再灌注時(shí)間足以引起心肌細(xì)胞凋亡。假手術(shù)組僅分離前降支，但不結(jié)扎。

1.5標(biāo)本采集及檢測(cè)1）心肌細(xì)胞凋亡率檢測(cè)。石蠟包埋心肌組織，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT酶）介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)。結(jié)果根據(jù)凋亡陽性細(xì)胞分布情況，每張切片拍攝10個(gè)陽性視野，每視野記數(shù)30個(gè)心肌細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，以平均計(jì)算陽性細(xì)胞所占的百分比作為細(xì)胞凋亡率（AR）。2）Bcl-2、Bax、Caspase-3、Fas、P53蛋白表達(dá)檢測(cè)。取上述石蠟標(biāo)本相應(yīng)部位的連續(xù)切片各5張，采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（SP）法進(jìn)行免疫組化染色和DAB顯色法。每張切片于陽性表達(dá)區(qū)域選擇10個(gè)無重疊視野，用圖像分析儀進(jìn)行分析，并計(jì)算其光密度值的均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示，使用方差分析方法計(jì)算平均值，并且進(jìn)行多重分析。如果方差齊，平均值是通過方差分析，個(gè)體差異有意義，再進(jìn)行多重分析。如果方差不齊，平均值是用Welch的檢驗(yàn)，他們的個(gè)體差異由Games-Howell的分析。多組比較采用方差。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較見表1。經(jīng)TUNEL染色及蘇木精復(fù)染后凋亡細(xì)胞核呈棕色，正常細(xì)胞核染藍(lán)色。假手術(shù)組缺血-再灌注2 h后僅見極少數(shù)散在的凋亡細(xì)胞，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組相比明顯增加（P＜0.05），隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加（P＜0.05）。益氣化瘀方組及通心絡(luò)組凋亡細(xì)胞數(shù)較相同灌注時(shí)間的模型組顯著下降（P＜0.05）。

表1　各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較（±s）

表1　各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較（±s）

與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與模型2 h組比較，*P＜0.05；與模型4 h組比較，#P＜0.05。下同。

組別n劑量［g/（kg·d）］細(xì)胞凋亡率（%）假手術(shù)組100.081.00±0.40*#模型2 h組100.0826.50±2.80△#模型4 h組100.0840.20±2.90△*通心絡(luò)2 h組100.1414.10±1.00△*#通心絡(luò)4 h組100.1416.70±2.20△*#益氣化瘀方2 h組107.2012.20±1.90△*#益氣化瘀方4 h組107.2020.30±5.36△#

2.2各組心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的比較見表2。假手術(shù)組見較多的Bcl-2蛋白陽性染色胞質(zhì)。模型組2 h及4 h的Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.05），通心絡(luò)組和益氣化瘀方組2 h及4 h后Bcl-2蛋白表達(dá)較模型組顯著增加（P＜0.05）。

表2　各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達(dá)比較（光密度值，±s）

表2　各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達(dá)比較（光密度值，±s）

組別nBcl-2Bax假手術(shù)組100.90±0.07*#1.34±0.09*#模型2 h組100.63±0.05△0.63±0.03△模型4 h組100.75±0.06△0.71±0.04△通心絡(luò)2 h組100.81±0.07*#1.34±0.10*#通心絡(luò)4 h組100.73±0.050.81±0.02△益氣化瘀方2 h組100.95±0.06*#1.27±0.01*#益氣化瘀方4 h組100.89±0.06*#0.87±0.03△

2.3各組心肌細(xì)胞Bax表達(dá)的比較見表3。假手術(shù)組僅見極少數(shù)散在的Bax蛋白陽性染色胞質(zhì)。模型組2 h及4 h的Bax蛋白的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），通心絡(luò)組和益氣化瘀方組2 h及4 h后Bax蛋白表達(dá)較模型組減少（P＜0.05）。

表3　各組大鼠心肌細(xì)胞Caspase-3、Fas、P53蛋白表達(dá)比較（光密度值，±s）

表3　各組大鼠心肌細(xì)胞Caspase-3、Fas、P53蛋白表達(dá)比較（光密度值，±s）

組別nCaspase-3假手術(shù)組100.22±0.01*#模型2 h組100.39±0.01△模型4 h組100.48±0.02△通心絡(luò)2 h組100.28±0.01*#通心絡(luò)4 h組100.39±0.02△*益氣化瘀方2 h組100.36±0.01△益氣化瘀方4 h組100.43±0.02△FasP53 0.28±0.02*#0.32±0.02*#0.65±0.06△0.77±0.03△0.69±0.06△0.83±0.03△0.41±0.02△*#0.51±0.01△*#0.49±0.03△*#0.64±0.03△*#0.45±0.03△*#0.56±0.02△*#0.53±0.04△*#0.54±0.02△*#

2.4各組心肌細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的比較見表3。假手術(shù)組僅見極少數(shù)散在的Caspase-3蛋白陽性染色胞質(zhì)。模型組2 h及4 h的Caspase-3蛋白的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），通心絡(luò)組和益氣化瘀方組2 h及4 h后Caspase-3蛋白表達(dá)較模型組減少（P＜0.05）。

2.5各組心肌細(xì)胞Fas表達(dá)的比較見表3。假手術(shù)組僅見極少數(shù)散在的Fas蛋白陽性染色胞質(zhì)。模型組2 h及4 h的Fas蛋白的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），通心絡(luò)組和益氣化瘀方組2 h及4 h后Fas蛋白表達(dá)較模型組減少（P＜0.05）。

2.6各組心肌細(xì)胞P53表達(dá)的比較見表3。假手術(shù)組僅見極少數(shù)散在的P53蛋白陽性染色胞質(zhì)。模型組2 h及4 h的P53蛋白的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），通心絡(luò)組和益氣化瘀方組2 h及4 h后P53蛋白表達(dá)較模型組減少（P＜0.05）。

3　討論

隨著急性心肌梗死再灌注治療的廣泛開展，再灌注損傷的研究也逐漸深入，細(xì)胞凋亡是心肌缺血-再灌注損傷的重要機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡是個(gè)體發(fā)育過程中由一系列基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程。在多數(shù)細(xì)胞類型中，原癌基因Bcl-2蛋白家族與P53是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞凋亡中相互聯(lián)系，相互作用，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)［3］，Bcl-2家族蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)功能不同分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。前者主要有Bcl-2，后者主要有Bax，各蛋白之間可形成同源或異源二聚體，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2與Bax的相對(duì)比值可能在決定細(xì)胞接受凋亡信號(hào)刺激后是否發(fā)生凋亡過程中起關(guān)鍵作用。比值增加，可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，反之，則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)細(xì)胞凋亡發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的有Caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，根據(jù)Caspase在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的作用位置可分為上游調(diào)控其他Caspase活化的始動(dòng)Caspase如Caspase-1、2、4、5、8等以及下游直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)施的效應(yīng)Caspase如Caspase-3、6、7等［4-6］。其核心成員為Caspase-3，是細(xì)胞凋亡早期階段激活的關(guān)鍵蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起中心環(huán)節(jié)作用，故也被稱為死亡蛋白酶，是目前已知的凋亡最后執(zhí)行因子［7-8］。根據(jù)以往的研究，Caspase-3的激活作為判斷細(xì)胞凋亡嚴(yán)重性的可靠指標(biāo)之一。若抑制Caspase-3蛋白的激活表達(dá)，則可明顯減輕凋亡的產(chǎn)生［9-11］。Fas/ Fas-L系統(tǒng)為主的膜受體死亡通路在細(xì)胞凋亡發(fā)生中起重要作用。Fas-L屬于腫瘤壞死因子細(xì)胞因子超家族，F(xiàn)as-L與表達(dá)Fas的靶細(xì)胞交聯(lián)后，啟動(dòng)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致Fas表達(dá)陽性的靶細(xì)胞凋亡。

益氣化瘀方是本院繆燦銘名中醫(yī)多年臨床經(jīng)驗(yàn)方，由五指毛桃、三七、丹參、仙鶴草、紅景天5味中藥制成，具有補(bǔ)益心氣、活血化瘀的功效。在本科用于預(yù)防冠心病支架內(nèi)再狹窄［12］。經(jīng)過多年的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，益氣化瘀方還能減輕急性心肌梗死急診PCI后的再灌注損傷。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該方可以減少大鼠急性心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡，且能減少促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白Bax、Caspase-3、Fas及P53的表達(dá)，增加抑制心肌細(xì)胞凋亡的相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2表達(dá)，且與通心絡(luò)膠囊在抑制缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡方面有相似功效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，益氣化瘀方中五指毛桃所含補(bǔ)骨脂素具有抗凝、免疫調(diào)節(jié)、激素樣作用［8］。三七有效成分三七總皂苷對(duì)心肌缺血再灌注損傷有很強(qiáng)的保護(hù)作用，對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有明顯抑制作用，主要抑制心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而保護(hù)心肌細(xì)胞［9］。丹參中丹參酮Ⅱ具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低心肌耗氧量、縮小心肌梗死面積等多種心血管藥理活性作用［10］；紅景天能使機(jī)體整體的耗氧速度速度降低、提高對(duì)缺氧的耐力，同時(shí)增加血液的載氧能力，增加機(jī)體抗病能力。全方合用，可達(dá)抗凝、減輕鈣超載、抑制心肌細(xì)胞凋亡、縮小心肌梗死面積、改善心肌耗氧等作用，從而減輕缺血再灌注損傷。

因該實(shí)驗(yàn)方法是持續(xù)給藥7 d后進(jìn)行，與臨床上急性心肌梗死介入治療術(shù)前緊急給藥有一定差異，故而有一定局限性，具體結(jié)果還需要臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Effect of Yiqi Huayu Decoction on the Expression of Apoptosis Related Proteins in Myocardial Cells of Rats with Ischemia Reperfusion Injury

LIN Kaixuan，AN Hui，Miao Canming，et al.Zhongshan Affiliated Hospital of Guangzhou TCM University，Guangdong，Zhongshan 528400，China

Objective：To investigate the Yiqi Huayu Decoction on myocardial cell apoptosis and Bcl-2，Bax，Caspase-3，fas and P53 protein expression in experimental rats with myocardial ischemia and reperfusion（ischemia/reperfusion，I/R）and to analyze the pathological damage in myocardial tissue.Methods：The myocardialischemia-reperfusion injury model was established by occluding the left anterior descending branch of coronary artery for 30 minutes and removing the ligation later to reperfusion for 2 hours，4 hours.Forty-two rats were randomly divided into seven groups：the normal（Normal）group，the sham operation（Sham）group，the saline ischemia-reperfusion 2 hours（NS-2 h）group，the saline ischemia-reperfusion 4 hours（NS-4 h）group，Tongxinluo control 2 hours group（TXL-2 h），Tongxinluo control 4 hours group（TXL-4 h），Yiqi Huayu Decoction treatment 2 hours group（YQ-2 h），and Yiqi Huayu Decoction treatment 4 hours group（YQ-4 h）.Bcl-2，Bax Caspase-3，F(xiàn)as and P53 protein expression were tested by immunohistochemical staining method.Results：Yiqi Huayu Decoction increased the Bcl-2 protein expression（P＜0.05）and reduced the Bax，Caspase-3，F(xiàn)as and P53 protein expression（P＜0.05）in rats with myocardial ischemia.Conclusion：The mechanism of Yiqi Huayu Decoction against myocardial apoptosis may be related to the increase of Bcl-2 protein expression and decrease of Bax，Caspase-3，F(xiàn)as and P53 protein expression.

Myocardialischemia-reperfusion injury；Myocardial apoptosis；Yiqi Huayu Decoction；Bcl-2 protein；Bax protein；Caspase-3 protein；Fas protein；P53 protein

R285.5

A

1004-745X（2015）11-1936-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.017

2015-07-05）

·綜述·

廣東省中山市科技局科技計(jì)劃立項(xiàng)重大項(xiàng)目（20113A003）