雷蕾　楊秦予

（陜西省友誼醫(yī)院，陜西西安710069）

·實(shí)驗(yàn)報(bào)告·

黃芩抗菌作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究

雷蕾楊秦予

（陜西省友誼醫(yī)院，陜西西安710069）

目的觀察黃芩提取物及分離的化合物的抑菌效果。方法醇提法對(duì)黃芩進(jìn)行提取，對(duì)提取物用不同溶劑進(jìn)行萃取，對(duì)萃取物進(jìn)行分離和純化，得到了4個(gè)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，對(duì)不同提取物和化合物進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果黃芩乙酸乙酯和正丁醇提取物在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)對(duì)大腸桿菌有一定的抑菌作用，千紙層素-A和黃芩素對(duì)大腸桿菌也有一定的抑菌作用。結(jié)論千紙層素-A和黃芩素是黃芩抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

黃芩抗菌黃芩素千紙層素-A

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）是臨床中最常用的中藥之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血的功效。文獻(xiàn)中對(duì)黃芩抗菌作用研究主要集中在黃芩水溶性黃芩苷類成分，而黃芩中的脂溶性抗菌成分研究較少。筆者以70%的乙醇對(duì)黃芩進(jìn)行了提取，再以硅膠分離得到了黃芩不同極性的部分，并對(duì)這些部分進(jìn)行了體外抗菌活性篩選。現(xiàn)將對(duì)黃芩脂溶性抗菌成分的研究報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1試藥與試劑黃芩采購自西安市萬壽路藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為黃芩屬植物黃芩的干燥根；無水乙醇、石油醚購自西安試劑廠；乙酸乙酯、正丁醇、石油醚購自南京市鑫宏發(fā)化工有限公司；蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xid公司。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器垂直流動(dòng)超凈工作臺(tái)，上海智誠儀器制造有限公司；303型數(shù)顯溫控電熱恒溫培養(yǎng)箱，銳鋒制藥機(jī)械有限公司；RE-522旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3菌株E.coli BL21，購自中國食品藥品檢驗(yàn)所。

1.4黃芩的提取與粗分離取黃芩1 kg，適當(dāng)粉碎后放于自制的浸泡缸中，向其中加入3 L 70%的乙醇，室溫浸泡7 d后將提取液取出，再加入3 L 70%的乙醇室溫提取2次，每次7 d。將3次的提取液合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，回收溶劑，得到浸膏。稱取黃芩浸膏100 g，加200 mL水使其分散均勻。將混懸液加入到1000 mL的分液漏斗中，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取。每次200 mL，重復(fù)3次。合并每部分的萃取液，進(jìn)行減壓濃縮。分別得到黃芩的3種不同極性的混合物，用來進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.5乙酸乙酯萃取物分離稱取黃芩乙酸乙酯部分20 g，用硅膠濕法裝柱，進(jìn)行柱分離。以石油醚∶乙酸乙酯15∶1作為起始的洗脫劑，依次調(diào)整洗脫劑的比例為15∶1，12∶1，10∶1，8∶1，6∶1，5∶1，4∶1，2∶1，1∶1，最后用甲醇將柱子沖洗并收集洗脫液，合并含有相同組分的洗脫液，回收溶劑，共得到5段不同極性的混合物，用作下一步的抑菌試驗(yàn)。

1.6柱分離后第2段和第4段的分離1）稱取第2段100 mg丙酮溶解，進(jìn)行拌樣。用硅膠濕法裝柱，以氯仿∶丙酮（10∶1）開始進(jìn)行洗脫。等到第1個(gè)黃色色帶完全下來后并且洗脫液沒有顏色時(shí)，將洗脫液換成5∶1進(jìn)行洗脫。對(duì)洗脫液進(jìn)行TLC分析，合并含有相同成分的洗脫液。將合并液減壓濃縮后再進(jìn)行TLC檢測(cè)。本次分離得到了2個(gè)化合物，分別編號(hào)為化合物1和2，質(zhì)量分別為25 mg和40 mg，用作下一步的抑菌試驗(yàn)。2）稱取第4段100 mg用丙酮溶解，進(jìn)行拌樣。稱取20 g的硅膠放于燒杯中，加入200 mL石油醚后攪拌除氣泡并進(jìn)行裝柱。上樣，以氯仿∶丙酮（8∶1）為起始，依次調(diào)整洗脫劑的比例為8∶1，6∶1，4∶1，2∶1進(jìn)行洗脫。收集洗脫液并進(jìn)行TLC檢測(cè)，合并相同部分的洗脫液，對(duì)合并液進(jìn)行減壓濃縮。得到了兩個(gè)化合物，分別編號(hào)為化合物3和4，質(zhì)量分別為20 mg和25 mg，用作下一步的抑菌試驗(yàn)。

1.7體外抑菌試驗(yàn)將大腸桿菌接種到含有蛋白胨和酵母提取物的固體培養(yǎng)基中，將含有黃芩提取物的濾紙片（d=0.2 cm）貼到培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈的直徑。黃芩提取物以水為溶劑，若不溶于水，以10%的吐溫-80作為助溶劑，以氨芐青霉素作為陽性對(duì)照組，以10%的吐溫-80溶液作為陰性對(duì)照。

2　結(jié)果

2.1黃芩不同提取物的抑菌結(jié)果見表1。從結(jié)果中可以看出，黃芩乙酸乙酯和正丁醇層對(duì)大腸桿菌有抑菌作用較強(qiáng)，石油醚層基本沒有抑菌作用。乙酸乙酯層柱分離后的活性主要集中在第2段和第4段，分離得到化合物1和化合物4相比另外兩個(gè)化合物的作用較強(qiáng)。

表1　黃芩不同提取物的抑菌結(jié)果

2.2化合物的結(jié)構(gòu)確定

2.2.1化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：12.5（1H，s，5-OH），7.91（2H，m，2’，6’-H），7.57（3H，m，3’，4’，5’-H），6.69（1H，s，3-H），6.45（1H，s，8-H），4.04（3H，s，OCH3）。EI-MS：［M］+m/z 284，［M-CH3］+m/z 269，［A1-CH3-CO］+m/z 139。

經(jīng)過與文獻(xiàn)對(duì)照分析［1］，發(fā)現(xiàn)該化合物與黃芩中千紙層素-A（oroxylin-A）的氫譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致。因此鑒定化合物1為千紙層素-A。結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1　千紙層素-A的結(jié)構(gòu)

2.2.2化合物2的結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：12.39（1H，s，5-OH），7.33（1H，t，J=8.4Hz，4’-H），6.73（1H，s，3-H），6.66（1H，d，J=8.4 Hz，3’-H），6.58（1H，d，J=8.4 Hz，5’-H），4.10（3H，s，OCH3），3.94（3H，s，OCH3），3.91（3H，s，OCH3），3.85（3H，s，OCH3）。EIMS：［M］+m/z 374，［M-CH3］+m/z 359。

經(jīng)過與文獻(xiàn)對(duì)照分析［2］，該化合物與黃芩中黃芩黃酮-Ⅱ的氫譜和核磁數(shù)據(jù)一致。因此，該化合物為黃芩黃酮-Ⅱ。結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2　黃芩黃酮-Ⅱ的結(jié)構(gòu)

2.2.3化合物3的結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMRR（CD3COCD3，400 MHz）δ：12.23（1H，s，5-OH），10.42（1H，s，3-OH），7.46（1H，t，J=8 Hz，4’-H），6.91（2H，d，J=8 Hz，3’，5’-H），6.41（1H，d，J=1 Hz，6-H），6.36（1H，d，J=1 Hz，8-H），5.99（1H，d，J=4 Hz，2-H），5.10（1H，d，J=4 Hz，8-H）。EI-MS：［M］+m/z 304。

通過與文獻(xiàn)對(duì)照［3］，該化合物與反式5，7，2’，6’-四羥基二氫黃酮醇的氫譜和核磁數(shù)據(jù)一致。因此，化合物3為5，7，2’，6’-四羥基黃酮醇。結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3　反式5，7，2’，6’-四羥基黃酮醇的結(jié)構(gòu)

2.2.4化合物4的結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：12.75（1H，s，5-OH），8.07（2 H，m，2’，6’-H），7.60（3 H，m，3’，4’，5’-H），6.76（1 H，s，3-H），6.69（1 H，s，8-H）。EI-MS：［M］+m/z 270。

通過與文獻(xiàn)比較［4］，該化合物與黃芩素的氫譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致。因此，化合物4的結(jié)構(gòu)鑒定為黃芩素。結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4　黃芩素的結(jié)構(gòu)

3　討論

黃芩中的化學(xué)成分比較復(fù)雜，從黃芩中已經(jīng)分離并鑒定了295種化合物［5］，其主要有黃酮類［6］、生物堿本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)黃芩提取物進(jìn)行體外抗菌作用研究，對(duì)黃芩乙酸乙酯層進(jìn)行純化得到了4個(gè)化合物，分別為千紙層素-A、黃芩黃酮-Ⅱ、5，7，2’，6’-四羥基黃酮醇和黃芩素。體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明，千紙層素-A和黃芩素有一定抑菌作用，表明這兩個(gè)化合物是黃芩體外抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。但千紙層素-A和黃芩素的作用都比混合物的作用弱，可能是由于混合物中的抗菌作用是多個(gè)化合物共同作用的結(jié)果。

類［7］、環(huán)烯醚萜苷類［8］、揮發(fā)油等化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芩具有抗腫瘤［9］、抗菌［10］、抗氧化［11］、保肝和鎮(zhèn)驚的作用。研究報(bào)道中關(guān)于黃芩的抗菌作用主要為黃芩提取物、黃芩苷等，而黃芩中具體的抗菌物質(zhì)研究較少。

隨著細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，傳統(tǒng)的抗生素篩選方法進(jìn)展比較緩慢，從天然產(chǎn)物中開發(fā)抗生素就顯得尤為重要。許多中藥都具有一定的抗菌活性，然而成分比較復(fù)雜，許多抗菌的有效成分還不明確。本研究為從黃芩中尋找新的抗菌藥物提供了依據(jù)，盡管研究表明千紙層素-A和黃芩素有一定抑菌作用，但具體的抗菌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］肖麗和，王紅燕，宋少江，等.滇黃芩化學(xué)成分的分離與鑒定［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20（3）：181-183.

［2］徐丹洋，陳佩東，張麗，等.黃芩的化學(xué)成分研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（1）：78-80.

［3］Takagi S，Yamuki M，Inoue K.Studies on the water-soluble constituents of the roots of Scutellaria baicalensis Georgi（wogon）［J］.Yakugaku Zasshi，1980，100：1220-1220.

［4］李云霞，索全伶，賀文智，等.黃芩素的分離純化與結(jié)構(gòu)表征［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2008，28（8）：1895-1899.

［5］Xiaofei Shang，Xirui He，Xiaoying He，et al.The genus Scutellaria an ethnopharmacological and phytochemical review［J］.Journal of Ethnopharmacology，2010，128：279-313.

［6］Xiaofei Shang，Xirui He，Xiaoying He，et al.The genus Scutellaria an ethnopharmacological and phytochemical review［J］.Journal of Ethnopharmacology，2010，128：279-313.

［7］Ma SC，Du J，But PPH，et al.Antiviral Chinese medicinal herbs against respiratory syncytial virus［J］.Journal of Ethnopharmacology，2002，79：205-211.

［8］Gousiadou C，Karioti A，Heilmann J，et al.Iridoids from Scutellaria albida ssp.Albida［J］.Phytochemistry，2007，68：1799-1804.

［9］Kumagai T，M’’uller CI，Desmond JC，et al.Scutellaria baicalensis，a herbalmedicine：anti-proliferative and apoptotic activity against acute lymphocytic leukemia［J］.Lymphoma and Myeloma Cell Lines，2007，31：523-530.

［10］Blaszczyk T，Krzyzanowska J，Lamer-Zarawska E.Screening for antimycotic properties of 56 traditional Chinese drugs［J］. Phytotherapy Research，2000，14：210-212.

［11］Schinella GR，Tournier HA，Prieto JM，et al.Antioxidant activity of anti-in ammatory plant extracts［J］.Life Sciences，2002，70：1023-1033.

·綜述·

R289.2

A

1004-745X（2015）11-1967-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.029

2015-07-21）