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        黃芩抗菌作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究

        2015-11-02 09:01:53雷蕾楊秦予
        中國(guó)中醫(yī)急癥 2015年11期
        關(guān)鍵詞:黃酮醇石油醚乙酸乙酯

        雷蕾 楊秦予

        (陜西省友誼醫(yī)院,陜西西安710069)

        ·實(shí)驗(yàn)報(bào)告·

        黃芩抗菌作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究

        雷蕾楊秦予

        (陜西省友誼醫(yī)院,陜西西安710069)

        目的觀察黃芩提取物及分離的化合物的抑菌效果。方法醇提法對(duì)黃芩進(jìn)行提取,對(duì)提取物用不同溶劑進(jìn)行萃取,對(duì)萃取物進(jìn)行分離和純化,得到了4個(gè)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,對(duì)不同提取物和化合物進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果黃芩乙酸乙酯和正丁醇提取物在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)對(duì)大腸桿菌有一定的抑菌作用,千紙層素-A和黃芩素對(duì)大腸桿菌也有一定的抑菌作用。結(jié)論千紙層素-A和黃芩素是黃芩抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

        黃芩抗菌黃芩素千紙層素-A

        黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)是臨床中最常用的中藥之一,具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血的功效。文獻(xiàn)中對(duì)黃芩抗菌作用研究主要集中在黃芩水溶性黃芩苷類成分,而黃芩中的脂溶性抗菌成分研究較少。筆者以70%的乙醇對(duì)黃芩進(jìn)行了提取,再以硅膠分離得到了黃芩不同極性的部分,并對(duì)這些部分進(jìn)行了體外抗菌活性篩選。現(xiàn)將對(duì)黃芩脂溶性抗菌成分的研究報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1.1試藥與試劑黃芩采購(gòu)自西安市萬(wàn)壽路藥材市場(chǎng),經(jīng)鑒定為黃芩屬植物黃芩的干燥根;無(wú)水乙醇、石油醚購(gòu)自西安試劑廠;乙酸乙酯、正丁醇、石油醚購(gòu)自南京市鑫宏發(fā)化工有限公司;蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)xid公司。

        1.2實(shí)驗(yàn)儀器垂直流動(dòng)超凈工作臺(tái),上海智誠(chéng)儀器制造有限公司;303型數(shù)顯溫控電熱恒溫培養(yǎng)箱,銳鋒制藥機(jī)械有限公司;RE-522旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠。

        1.3菌株E.coli BL21,購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)所。

        1.4黃芩的提取與粗分離取黃芩1 kg,適當(dāng)粉碎后放于自制的浸泡缸中,向其中加入3 L 70%的乙醇,室溫浸泡7 d后將提取液取出,再加入3 L 70%的乙醇室溫提取2次,每次7 d。將3次的提取液合并,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮,回收溶劑,得到浸膏。稱取黃芩浸膏100 g,加200 mL水使其分散均勻。將混懸液加入到1000 mL的分液漏斗中,分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取。每次200 mL,重復(fù)3次。合并每部分的萃取液,進(jìn)行減壓濃縮。分別得到黃芩的3種不同極性的混合物,用來(lái)進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

        1.5乙酸乙酯萃取物分離稱取黃芩乙酸乙酯部分20 g,用硅膠濕法裝柱,進(jìn)行柱分離。以石油醚∶乙酸乙酯15∶1作為起始的洗脫劑,依次調(diào)整洗脫劑的比例為15∶1,12∶1,10∶1,8∶1,6∶1,5∶1,4∶1,2∶1,1∶1,最后用甲醇將柱子沖洗并收集洗脫液,合并含有相同組分的洗脫液,回收溶劑,共得到5段不同極性的混合物,用作下一步的抑菌試驗(yàn)。

        1.6柱分離后第2段和第4段的分離1)稱取第2段100 mg丙酮溶解,進(jìn)行拌樣。用硅膠濕法裝柱,以氯仿∶丙酮(10∶1)開(kāi)始進(jìn)行洗脫。等到第1個(gè)黃色色帶完全下來(lái)后并且洗脫液沒(méi)有顏色時(shí),將洗脫液換成5∶1進(jìn)行洗脫。對(duì)洗脫液進(jìn)行TLC分析,合并含有相同成分的洗脫液。將合并液減壓濃縮后再進(jìn)行TLC檢測(cè)。本次分離得到了2個(gè)化合物,分別編號(hào)為化合物1和2,質(zhì)量分別為25 mg和40 mg,用作下一步的抑菌試驗(yàn)。2)稱取第4段100 mg用丙酮溶解,進(jìn)行拌樣。稱取20 g的硅膠放于燒杯中,加入200 mL石油醚后攪拌除氣泡并進(jìn)行裝柱。上樣,以氯仿∶丙酮(8∶1)為起始,依次調(diào)整洗脫劑的比例為8∶1,6∶1,4∶1,2∶1進(jìn)行洗脫。收集洗脫液并進(jìn)行TLC檢測(cè),合并相同部分的洗脫液,對(duì)合并液進(jìn)行減壓濃縮。得到了兩個(gè)化合物,分別編號(hào)為化合物3和4,質(zhì)量分別為20 mg和25 mg,用作下一步的抑菌試驗(yàn)。

        1.7體外抑菌試驗(yàn)將大腸桿菌接種到含有蛋白胨和酵母提取物的固體培養(yǎng)基中,將含有黃芩提取物的濾紙片(d=0.2 cm)貼到培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈的直徑。黃芩提取物以水為溶劑,若不溶于水,以10%的吐溫-80作為助溶劑,以氨芐青霉素作為陽(yáng)性對(duì)照組,以10%的吐溫-80溶液作為陰性對(duì)照。

        2 結(jié)果

        2.1黃芩不同提取物的抑菌結(jié)果見(jiàn)表1。從結(jié)果中可以看出,黃芩乙酸乙酯和正丁醇層對(duì)大腸桿菌有抑菌作用較強(qiáng),石油醚層基本沒(méi)有抑菌作用。乙酸乙酯層柱分離后的活性主要集中在第2段和第4段,分離得到化合物1和化合物4相比另外兩個(gè)化合物的作用較強(qiáng)。

        表1 黃芩不同提取物的抑菌結(jié)果

        2.2化合物的結(jié)構(gòu)確定

        2.2.1化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMR(CDCl3,400 MHz)δ:12.5(1H,s,5-OH),7.91(2H,m,2’,6’-H),7.57(3H,m,3’,4’,5’-H),6.69(1H,s,3-H),6.45(1H,s,8-H),4.04(3H,s,OCH3)。EI-MS:[M]+m/z 284,[M-CH3]+m/z 269,[A1-CH3-CO]+m/z 139。

        經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)對(duì)照分析[1],發(fā)現(xiàn)該化合物與黃芩中千紙層素-A(oroxylin-A)的氫譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致。因此鑒定化合物1為千紙層素-A。結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

        圖1 千紙層素-A的結(jié)構(gòu)

        2.2.2化合物2的結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMR(CDCl3,400 MHz)δ:12.39(1H,s,5-OH),7.33(1H,t,J=8.4Hz,4’-H),6.73(1H,s,3-H),6.66(1H,d,J=8.4 Hz,3’-H),6.58(1H,d,J=8.4 Hz,5’-H),4.10(3H,s,OCH3),3.94(3H,s,OCH3),3.91(3H,s,OCH3),3.85(3H,s,OCH3)。EIMS:[M]+m/z 374,[M-CH3]+m/z 359。

        經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)對(duì)照分析[2],該化合物與黃芩中黃芩黃酮-Ⅱ的氫譜和核磁數(shù)據(jù)一致。因此,該化合物為黃芩黃酮-Ⅱ。結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

        圖2 黃芩黃酮-Ⅱ的結(jié)構(gòu)

        2.2.3化合物3的結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMRR(CD3COCD3,400 MHz)δ:12.23(1H,s,5-OH),10.42(1H,s,3-OH),7.46(1H,t,J=8 Hz,4’-H),6.91(2H,d,J=8 Hz,3’,5’-H),6.41(1H,d,J=1 Hz,6-H),6.36(1H,d,J=1 Hz,8-H),5.99(1H,d,J=4 Hz,2-H),5.10(1H,d,J=4 Hz,8-H)。EI-MS:[M]+m/z 304。

        通過(guò)與文獻(xiàn)對(duì)照[3],該化合物與反式5,7,2’,6’-四羥基二氫黃酮醇的氫譜和核磁數(shù)據(jù)一致。因此,化合物3為5,7,2’,6’-四羥基黃酮醇。結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

        圖3 反式5,7,2’,6’-四羥基黃酮醇的結(jié)構(gòu)

        2.2.4化合物4的結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMR(CD3COCD3,400 MHz)δ:12.75(1H,s,5-OH),8.07(2 H,m,2’,6’-H),7.60(3 H,m,3’,4’,5’-H),6.76(1 H,s,3-H),6.69(1 H,s,8-H)。EI-MS:[M]+m/z 270。

        通過(guò)與文獻(xiàn)比較[4],該化合物與黃芩素的氫譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致。因此,化合物4的結(jié)構(gòu)鑒定為黃芩素。結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。

        圖4 黃芩素的結(jié)構(gòu)

        3 討論

        黃芩中的化學(xué)成分比較復(fù)雜,從黃芩中已經(jīng)分離并鑒定了295種化合物[5],其主要有黃酮類[6]、生物堿本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)黃芩提取物進(jìn)行體外抗菌作用研究,對(duì)黃芩乙酸乙酯層進(jìn)行純化得到了4個(gè)化合物,分別為千紙層素-A、黃芩黃酮-Ⅱ、5,7,2’,6’-四羥基黃酮醇和黃芩素。體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明,千紙層素-A和黃芩素有一定抑菌作用,表明這兩個(gè)化合物是黃芩體外抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。但千紙層素-A和黃芩素的作用都比混合物的作用弱,可能是由于混合物中的抗菌作用是多個(gè)化合物共同作用的結(jié)果。

        類[7]、環(huán)烯醚萜苷類[8]、揮發(fā)油等化學(xué)成分,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芩具有抗腫瘤[9]、抗菌[10]、抗氧化[11]、保肝和鎮(zhèn)驚的作用。研究報(bào)道中關(guān)于黃芩的抗菌作用主要為黃芩提取物、黃芩苷等,而黃芩中具體的抗菌物質(zhì)研究較少。

        隨著細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng),傳統(tǒng)的抗生素篩選方法進(jìn)展比較緩慢,從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)抗生素就顯得尤為重要。許多中藥都具有一定的抗菌活性,然而成分比較復(fù)雜,許多抗菌的有效成分還不明確。本研究為從黃芩中尋找新的抗菌藥物提供了依據(jù),盡管研究表明千紙層素-A和黃芩素有一定抑菌作用,但具體的抗菌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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        ·綜述·

        R289.2

        A

        1004-745X(2015)11-1967-03

        10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.029

        2015-07-21)

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