鐘召兵

（泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山東泰安 271000）

水貂養(yǎng)殖舍中細(xì)菌氣溶膠與氣載內(nèi)毒素檢測

鐘召兵

（泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山東泰安 271000）

［目的］本研究旨在了解水貂舍細(xì)菌氣溶膠和氣載內(nèi)毒素對環(huán)境的污染及對飼養(yǎng)人員健康的潛在危害。［方法］采用Andersen-6空氣收集器和AG?-30液體沖擊式采樣器對市郊不同飼養(yǎng)條件的2個水貂場6棟養(yǎng)殖舍內(nèi)的細(xì)菌氣溶膠和氣載內(nèi)毒素進(jìn)行定期檢測。［結(jié)果］兩個場舍內(nèi)氣載需氧革蘭氏陰性菌濃度分別介于4.17×101～2.43×103CFU/m3之間和4.27×101～5.1×103CFU/m3之間，以大腸桿菌科為主，假單胞菌屬和巴斯德氏菌屬次之；從革蘭氏陰性菌在Andersen-6空氣收集器層級上的分布規(guī)律來看，主要分布在Ⅲ級（36.9%），氣溶膠顆粒直徑在2～6 mm之間。兩個場舍內(nèi)的氣載內(nèi)毒素濃度分別介于2.92×102～2.15×103EU/m3之間和2.67×101～2.56×102EU/m3之間。［結(jié)論］水貂舍內(nèi)氣溶膠顆?？梢赃M(jìn)入到動物和人的支氣管、細(xì)支氣管，甚至肺泡，在一定程度上增加了水貂和飼養(yǎng)人員呼吸道疾病發(fā)生的可能性；氣載內(nèi)毒素的濃度部分超出了對人體無影響的推薦標(biāo)準(zhǔn)（1.0×102EU/m3），可對水貂飼養(yǎng)人員的健康造成一定的危害；舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌與內(nèi)毒素之間沒有必然的相關(guān)性，表明空氣中氣載內(nèi)毒素含量不能用空氣中氣載革蘭氏陰性菌的含量來評估。

水貂場；環(huán)境；氣載需氧革蘭氏陰性菌；氣載內(nèi)毒素

空氣微生物的污染程度是衡量空氣質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。國外在畜禽舍環(huán)境與人類和動物的健康方面已做過很多研究［1］，空氣中病原微生物可導(dǎo)致畜禽呼吸道感染［2］；高濃度的非病原微生物可導(dǎo)致機(jī)體免疫負(fù)荷過重，抵抗力降低，易感性升高［3］。特別是空氣中的微生物及其代謝產(chǎn)物（內(nèi)毒素、氨、硫化氫等）是影響動物健康的因素［4］。畜禽舍環(huán)境中微生物氣溶膠不僅對畜禽和養(yǎng)殖人員的健康造成威脅，還對外界環(huán)境造成生物污染［5］。

細(xì)菌內(nèi)毒素來源于革蘭氏陰性菌細(xì)胞外壁，是其死亡或菌體裂解時釋放出來的一類具有多種生物活性的毒性物質(zhì)，可對機(jī)體產(chǎn)生毒害作用，如熱源性、白細(xì)胞減少癥、Shwartzman反應(yīng)、內(nèi)毒素毒血癥和休克等［6］，因此對動物舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素檢測有其必要性和重要性。

畜禽舍細(xì)菌氣溶膠和氣載內(nèi)毒素對人類健康的影響在國外已有研究報道［7］，而對水貂舍內(nèi)空氣中細(xì)菌和內(nèi)毒素檢測以及內(nèi)毒素和革蘭氏陰性菌相關(guān)性的研究迄今為止國內(nèi)外還沒有報道。因此，本研究對水貂舍氣載內(nèi)毒素和氣載革蘭氏陰性細(xì)菌的濃度進(jìn)行檢測并分析其危害，對兩者是否存在相關(guān)性做了研究，旨在對水貂養(yǎng)殖環(huán)境空氣質(zhì)量做出客觀評價。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑、培養(yǎng)基。血瓊脂基礎(chǔ)（上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司）、50 mL/瓶的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)海洋生物制品廠）、LAL試 劑（0.1 mL/支，λ=0.125 EU/mL）（ 湛江博康海洋生物有限公司）、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE（10 EU/支）（湛江博康海洋生物有限公司）。1.1.2 主要儀器。Andersen-6級撞擊式微生物樣品收集器（遼寧市應(yīng)用技術(shù)研究所）、AG?-30液體沖擊式采樣器（遼陽市醫(yī)療器械廠）、DEM6型輕便三杯風(fēng)向風(fēng)速表（天津市氣象海洋儀器廠）、DH4000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱（中國天津市泰斯特儀器有限公司）、YOX型厭氧培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、無菌超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司制造）。

1.2方法

1.2.1血瓊脂培養(yǎng)基的制備。將血瓊脂基礎(chǔ)滅菌后加5%公綿羊血制成血瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.2水貂舍的選擇。選擇A、B兩個開放式和半封閉式水貂養(yǎng)殖場進(jìn)行研究。其中，場A為開放式籠養(yǎng)，遠(yuǎn)離公路，占地約50畝，飼養(yǎng)水貂1100只左右；貂舍呈東西走向，背風(fēng)向陽；采樣地點(diǎn)為育成貂和仔貂舍A1、A2、A3，每棟舍長30 m、寬4 m、高2.5 m，養(yǎng)貂300只，通風(fēng)條件良好；場B為半封閉式籠養(yǎng)，近鄰國道，占地30畝，飼養(yǎng)水貂500只左右；貂舍呈東西走向；采樣地點(diǎn)育成貂舍B1、B2、B3，舍長16m，寬4m，高2.5m，每舍養(yǎng)貂150只，自然通風(fēng)，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 被研究的2個水貂場情況

1.2.3舍內(nèi)空氣樣品采集。采用國際標(biāo)準(zhǔn)ANDERSEN-6級［8］空氣微生物樣品收集器（遼寧市應(yīng)用技術(shù)研究所），置于水貂舍中央、高1 m、空氣流量為28.3 L / min處，采樣介質(zhì)為血-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基，驅(qū)動時間1～5 min。

1.2.4舍內(nèi)空氣內(nèi)毒素采集。通過國際標(biāo)準(zhǔn)AG?-30液體沖擊式采樣器（All Glass ?mpinger AG?-30）和鱟變形細(xì)胞溶解物試驗（Limulus Amebocyte Lysate Test）測得。將收集器置于舍中央、高80 cm處，采樣介質(zhì)為50 mL內(nèi)毒素檢查用水（湛江海洋生物制品廠），空氣流量為12.5 L/min，驅(qū)動時間30 min。

1.2.5舍內(nèi)空氣中革蘭氏陰性菌的分離、鑒定與濃度計算。一半（72個）樣本放入YQX型厭氧培養(yǎng)箱中（88%N2、7%H2、5%CO2），40 ℃培養(yǎng)24～48 h；另一半（72個）置于培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24～48 h，陽性菌落經(jīng)過“KOH 反應(yīng)”試驗鑒定其是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌。將革蘭氏陰性菌通過O-F（氧化-發(fā)酵）試驗和氧化酶試驗分成腸桿菌科類和非發(fā)酵類，分別用AP?-20E和AP?- 20NE進(jìn)行鑒定，經(jīng)Andersen校正表校正后，計算出環(huán)境空氣中細(xì)菌的濃度（CFU/m3）和氣載革蘭氏陰性菌濃度（CFU/m3）［9］。

2　結(jié)果

2.1數(shù)據(jù)分析

舍內(nèi)空氣微生物數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，為減少誤差達(dá)到準(zhǔn)確反應(yīng)實(shí)際真值的目的，水貂舍環(huán)境氣載內(nèi)毒素和細(xì)菌濃度采用了中間值（Median）［10］，這種統(tǒng)計方法適用于數(shù)量較少數(shù)值浮動較大的樣本統(tǒng)計，同時用最大值與最小值反映數(shù)值的波動范圍，并應(yīng)用Microsoft Excel 對參數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性和回歸分析。

2.2舍內(nèi)氣載細(xì)菌在Andersen-6級生物采集器各層級上的分布特征

Andersen-6級生物采集器Ⅰ-Ⅱ級收集的細(xì)菌粒子（＞6.0 mm）可沉著在小支氣管內(nèi)，Ⅲ-Ⅵ級收集的粒子（≤6.0 mm）可直接侵入肺泡。不同種類細(xì)菌粒子因直徑大小不同，在不同級別上的分布比例也不同，氣載細(xì)菌總體分布在Ⅰ～Ⅴ層。貂舍內(nèi)氣載細(xì)菌在Andersen-6級生物采集器各層級上的分布用每一層級捕獲的細(xì)菌粒子數(shù)占采樣器捕獲的細(xì)菌粒子總數(shù)之比計算，具體數(shù)據(jù)見表2。

2.3貂舍內(nèi)細(xì)菌氣溶膠的濃度

場A與場B舍內(nèi)空氣中需氧菌濃度分別在4.32×102～2.35×104CFU/m3和 4.63×102～2.78×104CFU/ m3之間，厭氧菌濃度分別在6.18×102～1.12×104CFU/m3和 1.31×103～1.22×104CFU/ m3之間，具體數(shù)據(jù)見表3。

2.4貂舍內(nèi)革蘭氏陰性菌氣溶膠的濃度

場A、場B舍內(nèi)需氧革蘭氏陰性菌的濃度分別在4.17×101～2.43×103CFU/m3和4.27×101～5.1×103CFU/m3之間，具體數(shù)據(jù)見表4，沒有分離出氣載厭氧革蘭氏陰性菌。

2.5貂舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素的濃度

場A、場B舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素的濃度分別在2.92×102～2.15×103EU/m3和 2.67×101～2.56×102EU/m3之間，具體數(shù)據(jù)見表4，部分?jǐn)?shù)據(jù)已超出了推薦的健康標(biāo)準(zhǔn)（1.0×102EU/m3）［11］。

2.5貂舍內(nèi)氣載需氧革蘭氏陰性菌的菌群組成

場A、場B舍內(nèi)空氣中需氧革蘭氏陰性菌以腸桿菌科為主，其中，大腸埃希氏菌占優(yōu)勢，巴氏桿菌屬和假單胞菌屬細(xì)菌濃度相近，巴氏桿菌屬以多殺性巴氏桿菌最高，假單胞菌以銅綠假單胞菌為主。此外也檢測到不常見的成團(tuán)泛桿菌和成團(tuán)腸桿菌，具體數(shù)據(jù)見表5、表6。

表2　水貂場舍內(nèi)氣載細(xì)菌在Andersen-6級生物采集器各層級上的分布（%）

表3　水貂場A和B舍內(nèi)氣載需氧活菌和氣載厭氧活菌濃度

表4　水貂場A和B舍內(nèi)氣載需氧革蘭氏陰性活菌和氣載內(nèi)毒素濃度

表5　水貂場A中需氧革蘭氏陰性細(xì)菌的菌群構(gòu)成

表6　水貂場B中需氧革蘭氏陰性細(xì)菌的菌群構(gòu)成

2.6貂舍空氣中內(nèi)毒素與革蘭氏陰性菌的相關(guān)性分析

對水貂場A和B舍內(nèi)空氣中細(xì)菌內(nèi)毒素和氣載革蘭氏陰性菌之間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，氣載內(nèi)毒素與氣載革蘭氏陰性菌之間相關(guān)系數(shù)r1和r2不顯著，氣載革蘭氏陰性菌與氣載內(nèi)毒素沒有必然的相關(guān)性，因此不可以用水貂舍氣載革蘭氏陰性菌濃度來估測氣載內(nèi)毒素，具體數(shù)據(jù)見表7。

表7　水貂場A和B舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素與革蘭氏陰性菌之間的關(guān)系

3　討論

3.1水貂場舍內(nèi)氣載細(xì)菌氣溶膠的潛在危害

本研究采用Andersen-6級空氣微生物收集器，采集粒譜范圍在0.2～20 mm，可以統(tǒng)計各種直徑粒子的數(shù)量，了解微生物氣溶膠顆粒空氣動力學(xué)直徑（Dae50）大小，評估它們的傳播距離和進(jìn)入呼吸道的深度，判斷能否進(jìn)入肺泡和在空氣中懸浮時間，間接推斷對人及動物造成的危害程度。

兩個水貂場舍內(nèi)細(xì)菌氣溶膠顆粒在Andersen-6收集器6個層級上的分布（表2）看出，場A和B舍內(nèi)氣載細(xì)菌在 Andersen-6級生物空氣采樣器上的粒徑分布趨勢基本相同。氣載細(xì)菌主要分布在Ⅱ和Ⅳ級（捕獲范圍2.0～8.2 mm），最低值在Ⅵ級（＜0.65 mm）。根據(jù)飼養(yǎng)人員和水貂的吸氣量以及在舍內(nèi)的停留時間（飼養(yǎng)人員8 h，水貂24 h），人和水貂在1 d內(nèi)可吸入3.1×103 CFU和5.4×104 CFU氣載細(xì)菌，其中Ⅰ級和Ⅱ級上的氣載細(xì)菌可進(jìn)入人和水貂的鼻腔和上呼吸道，這些顆粒在空氣中懸浮時間短，最多能通過鼻腔到達(dá)氣管，但由于重力作用將很快沉落，一般情況下，對人和動物的威脅不大；但Ⅲ-Ⅵ級的氣載細(xì)菌可以沉著在人和水貂的小支氣管或直接侵入肺泡，對人和動物的健康構(gòu)成威脅。

3.2水貂場舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌

本研究主要對兩個水貂場舍內(nèi)空氣中的氣載革蘭氏陰性菌的組成和含量進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示革蘭氏陰性病原菌的濃度很低，雖然沒有文獻(xiàn)報道水貂舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌的標(biāo)準(zhǔn)范圍，但是不能忽視它們對舍內(nèi)環(huán)境空氣的影響。

檢測結(jié)果顯示，氣載革蘭氏陰性菌群主要包括腸桿菌、巴氏桿菌和假單胞菌。其中，腸桿菌科在兩個水貂場舍內(nèi)空氣的革蘭氏陰性菌中占大多數(shù)，以大腸桿菌最多，這同報道的畜禽舍的情況基本一致［12-13］，都沒有檢出厭氧革蘭氏陰性菌。高濃度非病原菌會導(dǎo)致機(jī)體免疫力降低，使病原菌侵入機(jī)體的可能性增加。

在兩個水貂場內(nèi)檢測到很多種假單胞菌屬，其是常見的條件致病菌，感染途徑主要通過呼吸道，可引起人的肺炎、肺栓塞、手術(shù)創(chuàng)傷感染、菌血癥與敗血癥等病癥［14］。另外在兩個場中還分離到巴氏桿菌，其中多殺巴氏桿菌能導(dǎo)致人上呼吸道感染以及生殖道感染等病癥。

場A舍內(nèi)還分離到了雞巴氏桿菌，分析可能與舍內(nèi)有雞混養(yǎng)有關(guān)；還分離到了不常見的成團(tuán)腸桿菌和成團(tuán)泛桿菌，含量極少。成團(tuán)腸桿菌是免疫系統(tǒng)缺陷病人的條件致病菌，常侵犯新生兒和創(chuàng)傷病人。

場B舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌濃度比場A高（表3），可能與這兩個場的養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)，場A是開放式養(yǎng)殖，通風(fēng)狀況良好，有一套完整有序的消毒和疾病控制體系；場B是半封閉式養(yǎng)殖，通風(fēng)條件相對較差并且雞狗混養(yǎng)，這些因素都可導(dǎo)致氣載致病性革蘭氏陰性菌濃度升高。

從水貂場舍內(nèi)空氣中分離的氣載革蘭氏陰性菌群組成及濃度反映出水貂場存在發(fā)生疾病的潛在危險，尤其對在半封閉式水貂場內(nèi)的飼養(yǎng)人員和動物的健康危害更大。

3.3水貂場舍內(nèi)空氣中內(nèi)毒素

國外研究表明，空氣中內(nèi)毒素可以造成人及動物嚴(yán)重的呼吸道刺激反應(yīng)［15］；氣載內(nèi)毒素含量與動物疾病的發(fā)生有協(xié)同作用，長期暴露在有氣載內(nèi)毒素存在的環(huán)境中，可導(dǎo)致肺功能下降，甚至導(dǎo)致免疫性疾?。?6］。Halloy通過研究內(nèi)毒素含量對豬的健康影響，表明氣載內(nèi)毒素可以導(dǎo)致豬發(fā)生多方面呼吸道疾?。?7］，Donham通過相關(guān)性和回歸性分析發(fā)現(xiàn)了重要的劑量反應(yīng)關(guān)系，指出0.16 mg/m3可被吸入的塵埃，614 EU/m3的內(nèi)毒素以及12ppm的氨氣與肺部損傷有很大的相關(guān)性［18］。

本研究在兩個不同水貂場舍內(nèi)測得氣載內(nèi)毒素含量在2.67×101～2.15×103EU/m3之間，部分已超過引起人的肺炎推薦標(biāo)準(zhǔn)（2.0×103EU/m3），大部分已經(jīng)超了對人體健康無影響推薦標(biāo)準(zhǔn)（1.0×102EU/m3）。對長期生活在這種環(huán)境中的動物和飼養(yǎng)人員的健康會產(chǎn)生很大的危害。然而舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素對動物和飼養(yǎng)人員的健康會產(chǎn)生多大的危害及其含量在多少之內(nèi)不會影響動物和人的健康等問題，還有待研究。

3.4水貂舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌與氣載內(nèi)毒素的相關(guān)性

通過舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌與內(nèi)毒素的相關(guān)性分析，說明兩者之間沒有必然的相關(guān)性，且氣載內(nèi)毒素依賴于氣載革蘭氏陰性菌的回歸方程（見表7）也不顯著（P＞0.05）。表明空氣中氣載內(nèi)毒素含量不能用空氣中氣載革蘭氏陰性菌的含量來評估。氣載內(nèi)毒素的活性可保持?jǐn)?shù)月，其含量可以積累，而革蘭氏陰性細(xì)菌在空氣中存活時間短，采樣過程也可使其活性喪失［19-20］。

綜上所述，水貂舍環(huán)境中高含量的氣載細(xì)菌和氣載內(nèi)毒素，不僅會危及人和動物的健康，還可能造成周圍環(huán)境的空氣污染。盡管在采樣過程中未觀察到人和水貂的異常表現(xiàn)，但長期暴露在這種環(huán)境中會給人和動物的健康造成危害，因此關(guān)注畜禽養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生是健康養(yǎng)殖的重要環(huán)節(jié)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Detection of Bacterial Aerosol and Airborne Endotoxin in Mink Breeding Houses

Zhong Zhaobing
（Daiyue District Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Tai，an，Shandong 271000）

［Objective］The purpose of the study is to understand bacterial aerosol and airborne endotoxin pollution in the mink stables and the potential health hazards to mink breeders. ［Methods］Concentrations of bacteria aerosol and airborne endotoxin were measured by Andersen-6 stage sampler and AG?-30（All Glass ?mpinger AG?-30） in six stables of two mink farms in the suburbs. ［Results］Concentrations of airborne aerobic gram-negative bacteria were 4.17×101to 2.43×103CFU/m3and 4.27×101to 5.1×103CFU/m3respectively in the two farms with Enterobacteriaceae as the predominant species flowed by Pasteurella and the Pseudomonas. The airborne gram-negative bacteria were mainly distributed in the Ⅲ stage（36.9%）of Andersen-6 stage sampler，with aerosol particle diameters ranging from 2μm to 6μm. Concentrations of airborne endotoxin in two mink farms were 2.92×102to 2.15×103EU/m3and 2.67×101to 2.56×102EU/m3respectively.［Conclusion］The pollution of aerosol aerobic gram-negative bacteria detected in the mink stables，although with very low concentration，would increase possibilities of minks and the breeders to suffer from respiratory diseases. Concentrations of airborne endotoxin was above the recommended standard for human health（1.0×102EU/m3）and would have certain threat to the health of mink breeders. There is no inevitable correlation between the airborne gram-negative bacteria and endotoxins in mink houses，suggesting that airborne endotoxin concentrations can not be used to assess the concentration of gram-negative bacteria.

mink field；environment；airborne aerobic gram-negative bacteria；airborne endotoxin

S851.2+4

B

1005-944X（2015）11-0022-05