馬凱，白羽，陳爾凝，劉杰，劉悅，武會娟，高麗娟

（北京市理化分析測試中心，北京100089）

鮮豬肉中沙門和金葡菌熒光定量PCR檢測

馬凱，白羽，陳爾凝，劉杰，劉悅，武會娟，高麗娟*

（北京市理化分析測試中心，北京100089）

通過結(jié)合兩種技術(shù)-免疫磁分離技術(shù)與雙重?zé)晒舛縋CR技術(shù)，建立同時、快速對鮮豬肉進(jìn)行沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測方法。利用偶聯(lián)有特異性抗體免疫磁球，在37℃的條件下能夠有效地從250 mL循環(huán)體系中邊富集邊捕獲目標(biāo)菌。利用特異性的引物與探針，對兩種食源性致病菌進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR同時檢測。本研究方法針對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測限分別達(dá)到3.6 CFU/g和9.2 CFU/g。方法總體靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度達(dá)到98.8%、100%以及98.9%。本研究建立的免疫磁分離-雙重?zé)晒舛縋CR方法比國標(biāo)方法更快速和高效，適用于鮮豬肉中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的快速檢測。

沙門氏菌；金黃色葡萄球菌；免疫磁分離；雙重?zé)晒舛縋CR

食品安全是當(dāng)今全球關(guān)注的熱點問題。據(jù)統(tǒng)計，在美國食源性疾病每年影響超過6百萬到8千萬人的生活，導(dǎo)致多達(dá)9千人死亡，造成多達(dá)50億美元的損失［1］。這些事件中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是主要的兩種致病菌。由感染沙門氏菌而引起的腹瀉等疾病幾乎在所有國家都有發(fā)生，而其主要的感染源包括豬肉、家禽和雞蛋等［2］。沙門氏菌和金黃色葡萄球菌在我國近10年來由微生物引起的食源性疾病事件中的比例分別為10.3%和1.5%［3］。鮮豬肉中存在的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的食源性疾病呈逐年上升趨勢，給人們的健康帶來很大的潛在威脅。因此，同時、快速地對鮮豬肉中的這些食源性致病菌進(jìn)行檢測，才能夠快速應(yīng)對此類食品安全突發(fā)事件。

目前針對上述兩種致病菌的檢測手段包括依賴傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)的致病菌檢測方法，因其存在培養(yǎng)時間長、分型實驗復(fù)雜、靈敏度低等缺點，在很多突發(fā)事件中不能夠很好地及時反映準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)；多重PCR技術(shù)能夠在一個PCR反應(yīng)中同時對多種目的序列進(jìn)行擴(kuò)增，顯著地節(jié)約了成本，縮短了時間，在多個檢測領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用［4-6］。但因為普通PCR需要經(jīng)過瓊脂糖電泳對結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，容易導(dǎo)致交叉污染［7］，此外，現(xiàn)今使用的染色液多為有毒性的染料物質(zhì)，也限制了其在檢測當(dāng)中的使用。熒光定量PCR技術(shù)采用封閉式反應(yīng)體系，不需要后續(xù)的電泳檢測［8］，加之其采用了特異性的探針或熒光染料，其較常規(guī)PCR技術(shù)顯著提高了檢測的靈敏度與準(zhǔn)確性。目前，針對食源性致病菌的快速檢測的報道多為針對一種致病菌的熒光定量PCR快速檢測技術(shù)的建立［9-13］，也有針對4種致病菌做同時檢測的報道，但因為4重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系中4套引物及模板相互影響等原因?qū)е聶z測限較高［5，14］。雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系即能保證較高的對多種致病菌同時檢測，又能有效降低相互干擾，降低成本和檢測限，在檢測致病菌方面具有一定的優(yōu)勢［15］。免疫磁分離技術(shù)是利用包被有特異性抗體的磁球捕獲目標(biāo)物，并利用磁場的分離效果使磁球-目標(biāo)物復(fù)合物從環(huán)境中分離出來。免疫磁分離技術(shù)已經(jīng)被證實為一種有效地分離多種致病菌的方法［14，16-17］。

免疫磁球-多重實時熒光定量PCR具有快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點，它是近幾年在免疫磁球高效磁分離技術(shù)、多重實時熒光定量PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的致病菌快速檢測技術(shù)，在利用特異性抗體對目標(biāo)菌捕獲之后，利用特異性引物和探針，可對食源性致病菌的DNA片段進(jìn)行同時擴(kuò)增［18-19］。本研究使用兩種特異性免疫磁球捕獲同時沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，并設(shè)計兩種特異性引物及探針，從而實現(xiàn)對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的同時檢測。

1材料與方法

1.1培養(yǎng)基與菌株

沙門氏菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基配制參考國標(biāo)GB 4789.4-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》［20］和GB/T 4789.10-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球檢驗》［21］，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

沙門氏菌ATCC 14028、金黃色葡萄球菌ATCC 25923均購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

1.2試劑與儀器

超順磁性納米微球：上海AllMag公司；沙門氏菌多克隆抗體、金黃色葡萄球菌多克隆抗體：美國Meridian公司；1-乙基-（3-二甲氨基丙基）、碳酰二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺：美國Sigma公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（2×）：美國Applied Biosystems公司。

BHC-1300II A2生物安全柜：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZSD-1270生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器有限公司；GENIE2渦旋震蕩器：美國SCIENTIFIC INDUSTRIES公司；Biospec-nano核酸分析儀：日本島津公司；Pathatrix免疫磁分離系統(tǒng)：英國Matrix公司；5804R離心機(jī)：德國Eppendorf公司；7500 Fast熒光定量PCR儀：美國Applied Biosystem公司。

1.3引物及探針的選擇與合成

本研究中沙門氏菌［22］、金黃色葡萄球菌［23］的引物及探針參考相關(guān)文獻(xiàn)（見表1），由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1　雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增用特異引物及探針序列Table 1Primers and probes for multiplex RT-PCR detection of Salmonella，and Staphylococcus aureus

1.4免疫磁球制備及免疫磁分離

1.4.1免疫磁球的制備

取200 μg磁球用600 μL PBST洗滌3次；加入新配制的15 μL 5 mg/mL EDC和15 μL 5 mg/mL NHS溶液到離心管中，震蕩混勻，37℃活化60 min，600 μL PBST洗滌3次。800 μL PBS（pH=7.4）重懸磁球。加入50 μg細(xì)菌多克隆抗體，37℃結(jié)合3 h。磁分離后棄上清，600 μL PBST洗滌3次，300 μL 1%BSA重懸磁球，37℃封閉30 min。磁分離后棄上清，600 μL PBS洗滌3次～5次。向制備好的致病菌磁球中加入100 μL PBST。4℃保存待用。

1.4.2免疫磁分離捕獲

25 g鮮豬肉樣品，加入225 mL NB，均質(zhì)后接種10倍稀釋的不同濃度菌液，制備成250 mL體系。將體系放置到免疫磁分離系統(tǒng)上進(jìn)行循環(huán)富集30min。最后得到終體積為1.5 mL菌體-磁球復(fù)合物懸液，取200 μL涂布計數(shù)檢測，剩余全部用于DNA提取。

1.5DNA提取

1.5.1純菌DNA提取

菌種按1∶50（體積比）比例接種至5 mL NB，于37℃培養(yǎng)24 h后，再次按1∶50接種，于37℃培養(yǎng)24 h，取1 mL菌懸液做10倍梯度稀釋，各取1 mL使用用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取基因組DNA，測定OD260/OD280、DNA濃度，剩余置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

另1 mL菌懸液做10倍梯度稀釋，取100 μL適當(dāng)?shù)膸讉€稀釋倍數(shù)的培養(yǎng)物涂布于NB平板，37℃過夜培養(yǎng)后，計數(shù)初始培養(yǎng)物中每毫升培養(yǎng)物中的菌落形成單位（CFU）。

1.5.2菌體-磁球復(fù)合物懸液的DNA提取

使用高速低溫離心機(jī)12 000 r/min將菌體-磁球復(fù)合物離心棄上清后，使用上述試劑盒提取DNA。

1.6雙重?zé)晒舛縋CR及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系為20 μL：10 mL TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（2×），探針（2.5 μmol/L）各1 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL（標(biāo)曲實驗中兩種菌DNA溶液各1 μL；免疫磁分離實驗中得到DNA溶液上樣量為1 μL），補(bǔ)水至20 μL；反應(yīng)條件：95℃、20 s，95℃、3 s，60℃、30 s，40個循環(huán)。

以純菌DNA作10倍梯度稀釋后的DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7特異性檢測

1.7.1引物特異性檢測

從沙門氏菌和金黃色葡萄球菌中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測引物特異性。

1.7.2免疫磁球特異性檢測

取已知濃度的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌菌懸液，稀釋至102CFU/mL，使用一種免疫磁球分別去捕獲兩種菌株。條件如下：將一種菌液1 mL加入到裝有一種免疫磁球的離心管中，室溫結(jié)合30 min，磁分離30 min，棄懸浮液，1mLPBS洗滌磁球-細(xì)菌復(fù)合體3次，加入1 mL 1×PBS使離心管中的磁球充分分散，分別取洗滌后的上清和最終磁球懸液400 μL，涂布，37℃培養(yǎng)24 h后觀察。

1.8檢測限的測定

取經(jīng)國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)檢驗證實為沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均為陰性的50份豬肉樣品被平均分成5組，將經(jīng)過菌落計數(shù)的一定數(shù)量的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌做10倍梯度稀釋后，每份加入1 mL菌懸液，按照1.4.2節(jié)的方法進(jìn)行免疫磁分離捕獲目標(biāo)菌后，按照1.5.2的方法提取DNA，用雙重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行檢測。每一組添加1份樣品作為空白對照，使用相同方法檢測。

1.9方法的相對靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度的評價

用以測定檢測限的樣品以及用以實際樣品檢測的樣品一起被用以計算本研究方法的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度。方法如下：接種目標(biāo)菌的樣品，該目標(biāo)菌的RT-PCR檢測結(jié)果為陽性，記為檢測陽性；沒有接種目標(biāo)菌的樣品，該目標(biāo)菌的RT-PCR檢測結(jié)果為陰性，記為檢測陰性；沒有接種目標(biāo)菌的樣品，但該目標(biāo)菌的RT-PCR檢測結(jié)果為陽性，記為陽性偏差；接種目標(biāo)菌的樣品，但該目標(biāo)菌的RT-PCR檢測結(jié)果為陰性，記為陰性偏差。靈敏度/%=［檢測陽性總數(shù)/（檢測陽性總數(shù)+陰性偏差總數(shù)）］×100，特異性/%=［檢測陰性總數(shù)/（檢測陰性總數(shù)+陽性偏差總數(shù)）］×100，準(zhǔn)確度/%=［（檢測陽性總數(shù)+檢測陰性總數(shù)）/樣品總數(shù)］×100。

1.10實際樣品檢測

從本地各大超市購買的70份鮮豬肉樣品，分別使用國標(biāo)方法和IMS-RT-PCR方法進(jìn)行檢測，比較兩種方法的。

2結(jié)果與分析

2.1特異性檢測

2.1.1引物特異性檢測

提取沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的DNA后，分別以沙門氏菌DNA、金黃色葡萄球菌DNA、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的混合DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。圖1可知擴(kuò)增條帶與預(yù)期片段大小一致。

圖1　引物特異性PCR電泳圖Fig.1Electrophoresis test for the specificity of primers

2.1.2免疫磁球特異性檢測

免疫磁球特異性實驗結(jié)果見表3。

實驗結(jié)果顯示沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性免疫磁球均具有較高的特異性，沒有明顯的非特異性吸附。

表3　免疫磁球特異性實驗Table 3Specificity detectionof IMBs

2.2雙重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線

沙門氏菌、金黃色葡萄球菌原菌液做10倍稀釋，沙門氏菌取濃度依次為90、900、9 000、90 000、900 000 CFU/mL，金黃色葡萄球菌取濃度依次為230、2 300、23 000、23 000、2 300 000 CFU/mL，各取1 mL提取DNA，并以此DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)雙重?zé)晒舛縋CR的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），可知兩種菌的標(biāo)曲的相關(guān)系數(shù)均大于為0.99，表明在在此DNA濃度的稀釋范圍內(nèi)，濃度與Ct值有很好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于0.6，表明每個點具有很好的重復(fù)性。

圖2　雙重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2Standard curve of duplex real-time PCR

2.3檢測限的測定

5組豬肉樣品按照1.4.2方法接種沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，250 mL體系中沙門氏菌的終濃度分別為0.36、3.6、36、360、3 600 CFU/g，金黃色葡萄球菌的終濃度分別為0.92、9.2、92、920、9 200 CFU/g。其中，一組接種0.36 CFU/g沙門氏菌、0.92 CFU/g金黃色葡萄球菌的10個樣品中，只有2個樣品的沙門氏菌RT-PCR檢測為陽性，金黃色葡萄球菌RT-PCR檢測均為陰性，故此組不作為雙重?zé)晒舛縋CR檢測限測定的有效數(shù)據(jù)。所以，免疫磁分離-雙重?zé)晒舛縋CR檢測豬肉樣品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測限分別達(dá)到3.6 CFU/g和9.2 CFU/g。

2.4方法的檢測靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度的評價

用以測定檢測限的4組共45份樣品（包括40個接種樣品和5個空白對照樣品）被用以計算本研究方法的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度，見表4。

表4　方法的相對靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度Table 4Relative sensitivity，specificity and accuracy of the IMS-multiplex RT-PCR method

實驗中發(fā)現(xiàn)一例金黃色葡萄球菌檢測陰性偏差。本方法的總體靈敏度為98.8%，特異性為100%，準(zhǔn)確度為98.9%。

2.5實際樣品檢測

使用國標(biāo)方法以及本研究的方法對70份鮮豬肉進(jìn)行的檢測結(jié)果顯示，國標(biāo)方法檢出沙門氏菌陽性2例，RT-PCR對此2份樣品的檢測結(jié)果也為陽性，兩種方法對其余樣品的沙門氏菌檢測結(jié)果均為陰性。國標(biāo)方法檢出金黃色葡萄球菌陽性3例，RT-PCR對此3份樣品的檢測結(jié)果也為陽性，兩種方法對其余樣品的金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果均為陰性。

3討論

隨著食品衛(wèi)生要求的不斷提高，快速檢測食品微生物在食品安全中的重要性愈加明顯。本研究開發(fā)了一種同時檢測沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的方法，能夠在3 h以內(nèi)完成對鮮豬肉樣品的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測。

獲得高純度的目標(biāo)菌株的DNA是得到好的檢測結(jié)果的前提。豬肉樣品中油脂成分、培養(yǎng)基成分以及DNA提取過程中的提取液的殘留成分，都可能會對PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性［24］。包被有特異性免疫多克隆抗體的磁球能夠與目標(biāo)菌株特異性結(jié)合，既能夠保證對目標(biāo)菌的高效富集，又能夠通過磁分離技術(shù)有效地將目標(biāo)菌株與豬肉中的雜質(zhì)分離，實現(xiàn)對目標(biāo)菌株的捕獲。

本研究中使用180 nm之間的Fe3O4磁性復(fù)合微球制備納米免疫磁球，由于具有較大的比表面積，因而在捕獲微生物等目標(biāo)物時表現(xiàn)出更高捕獲效率；同時由于其較小的粒徑而表現(xiàn)出很好的溶液穩(wěn)定性，使得小粒徑的納米免疫磁球表現(xiàn)出高磁分離效率。本研究中采用的沙門氏菌特異性多克隆抗體和金黃色葡萄球菌的特異性多克隆抗體的特異性都高達(dá)95%以上，分別達(dá)到95.93%、97.97%，同時對非目標(biāo)菌株的非特異性吸附控制在18%以下（表3）。

目前熒光定量PCR探針的淬滅基團(tuán)的選擇大多為TAMRA，但考慮到TAMRA自身也是熒光染料，在淬滅報告基團(tuán)的同時，會在更高波長處發(fā)射熒光；而BHQ系列為非熒光染料，淬滅報告基團(tuán)時，自身不發(fā)射熒光，探針熒光本底比TAMRA低，檢測靈敏度更高［25］，故本研究選用BHQ為探針的淬滅基團(tuán)。

對檢測線的測定結(jié)果顯示，兩種菌檢測限能夠達(dá)到10 CFU/g及以下。沙門氏菌的檢測限達(dá)到3.6 CFU/g，金黃色葡萄球菌的檢測限達(dá)到9.2 CFU/g。針對兩種菌的檢測結(jié)果顯示，本方法的檢測靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度均比較理想。目前很多研究食源性致病菌檢測的研究中，通常僅使用檢出率對不同方法進(jìn)行比對，不夠全面也不夠科學(xué)。使用靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度三個參數(shù)來衡量本方法，更能體現(xiàn)本方法的可靠性，更具科學(xué)性。

對從不同地區(qū)購買的70個鮮豬肉樣品的檢測結(jié)果顯示，相比國標(biāo)方法，本方法針對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度均達(dá)到100%。這些實驗結(jié)果顯示本研究方法在針對鮮豬肉中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的同時檢測當(dāng)中可以作為一種可靠地快速檢測手段。

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Real-Time PCR Assay for Salmonella and Staphylococcus Aureus in Pork

MA Kai，BAI Yu，CHEN Er-ning，LIU Jie，LIU Yue，WU Hui-juan，GAO Li-juan*
（Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis，Beijing 100089，China）

In this study，a rapid and simultaneous detection for Salmonella sp.and Staphylococcus（S.）aureus from fresh pork samples was developed by combining immunomagnetic separation（IMS）with duplex real-time PCR（RT-PCR）.Magnetic beads coated with specific antibodies were used to capture the pathogens from 250 mL at 37℃.Then，duplex RT-PCR was applied with two sets of specific primers and probes.The limit of detections were 3.6 CFU/g for Salmonella，and 9.2 CFU/g for S.aureus.The sensitivity，specificity，and accuracy of IMS-multiplex RT-PCR method were 98.8%，100%，and 98.8%，respectively.IMS-duplex RT-PCR method is more rapid and effective than GB method，and which was suitable for the rapid detection of Salmonella and Staphylococcus aureus in fresh pork.

Salmonella；Staphylococcus aureus；immunomagnetic separation；duplex real-time PCR

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.030

2014-02-09

北京市科技新星（2008B31）

馬凱（1986—），男（漢），助理研究員，碩士研究生，研究方向：食品微生物學(xué)。