毛曉宇，林思敏，張春雨，陳曉丹，賴建平，周勇強，曾慶祝

（廣州大學化學化工學院，廣東廣州510006）

花生粕雙菌固態(tài)發(fā)酵的工藝研究

毛曉宇，林思敏，張春雨，陳曉丹，賴建平，周勇強，曾慶祝*

（廣州大學化學化工學院，廣東廣州510006）

以熱榨花生粕為原料，水解度（DH）為指標，米曲霉AS3.951與枯草芽孢桿菌1.398結合對花生粕進行發(fā)酵并確定了接種時間差，通過實驗確定最佳接種時間差為3 h。正交試驗得出雙菌發(fā)酵最適工藝條件：花生含量90%、溫度32℃、接種比例1∶2、接種量10%、時間72 h。在此條件下，水解度達33.81%，氮溶解指數(shù)達85.65%。

花生粕；固態(tài)發(fā)酵；水解度；混菌

花生粕是花生仁經(jīng)壓榨提油后的副產品，含豐富的植物蛋白?；ㄉ傻臓I養(yǎng)價值較高，其代謝能是粕類飼料中最高的，粗蛋白含量達48%以上［1］。然而由于花生粕蛋白質品質欠佳，氨基酸不平衡，同時很容易感染黃曲霉菌而產生黃曲霉毒素，從而在一定程度上限制了花生粕的高效利用［2-3］。解決上述的問題，主要是利用酶解、發(fā)酵等生物方法。與單一酶解相比，發(fā)酵的優(yōu)勢在于：在酶解蛋白質的同時，可以利用微生物的代謝產生大量的活性物質或成味物質［4］。本研究采用米曲霉與枯草芽孢桿菌雙菌固態(tài)發(fā)酵花生粕，以代表多肽或氨基酸含量的蛋白質水解度為指標，通過正交試驗確定最佳工藝條件，使花生粕中的蛋白質最大限度分解為多肽或氨基酸，從而提高花生粕的營養(yǎng)價值和利用率。

1材料與方法

1.1材料

熱榨花生粕；枯草芽孢桿菌1.398：上海市工業(yè)微生物研究所；米曲霉AS3.951：廣東省微生物菌種保藏中心；麩皮：市場購買；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基（水分含量64%，花生粕∶麩皮=9∶1，水分含量64%）。

1.2主要設備

ZSD-1270生化培養(yǎng)箱、ZHJH-1112垂直流超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；PHS-25數(shù)顯pH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1斜面培養(yǎng)及種子培養(yǎng)

1.3.1.1米曲霉AS3.951

PDA斜面保藏菌種培養(yǎng)：28℃恒溫培養(yǎng)4 d后，于4℃冰箱保存。

一級斜面種子：刮取一環(huán)保藏菌種接種到PDA斜面上培養(yǎng)4 d。

二級三角瓶種曲：取滅菌生理鹽水9 mL將一級斜面菌種的孢子完全沖下，并全部轉移到99 mL的滅菌生理鹽水中，取0.10 mL接種到裝料量為30 g/250 mL的三角瓶中，于28℃恒溫培養(yǎng)60 h。

擴大培養(yǎng)：稱取0.10 g三角瓶種曲于裝料量為30 g/250 mL的三角瓶中，于28℃恒溫培養(yǎng)60 h。

1.3.1.2枯草芽孢桿菌1.398

營養(yǎng)瓊脂斜面保藏菌種培養(yǎng)：30℃恒溫培養(yǎng)24 h后，于4℃冰箱保存。

一級斜面種子：刮取一環(huán)保藏菌種接種到營養(yǎng)瓊脂斜面上培養(yǎng)24 h。

二級三角瓶種曲：取滅菌生理鹽水9 mL將一級斜面菌種的孢子完全沖下，并全部轉移到99 mL的滅菌生理鹽水中，取1.00 mL接種到裝料量為30 g/250 mL的三角瓶中，于30℃恒溫培養(yǎng)60 h。

擴大培養(yǎng)：稱取1.00 g三角瓶種曲于裝料量為30 g/250 mL的三角瓶中，于30℃恒溫培養(yǎng)60 h。

1.3.2固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

花生粕→預處理（粉碎，過40目篩）→配制固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基→121℃滅菌30 min→接種→發(fā)酵（各因素對發(fā)酵影響）→取樣加水溶解→離心→上清液適當稀釋→甲醛滴定法測定花生發(fā)酵水解度。

在發(fā)酵過程中，影響發(fā)酵花生粕產多肽因素有發(fā)酵時間、溫度、接種比例、接種量、花生含量等，分別在初始條件基礎上進行單因素及正交試驗，確定花生粕發(fā)酵的最佳工藝條件。

1.3.3水解度（DH）測定

水解度測定采用甲醛滴定法［5］。

2結果與討論

2.1單因素實驗

2.1.1花生粕含量對水解度的影響

在自然pH下，培養(yǎng)基含水量為64%，接種量為固態(tài)物料的10%，接種比例為米曲霉∶枯草芽孢桿菌＝1∶1，接種時間差為3 h，分別于固態(tài)物料中花生粕含量為60%、70%、80%、90%、100%，于30℃下發(fā)酵56 h，結果見圖1?？芍?，固態(tài)物料中花生粕的含量由60%增加到90%時，發(fā)酵料的水解度呈緩慢上升的趨勢，當花生粕含量大于90%時，水解度隨花生粕含量的增加而下降，這是因為兩種發(fā)酵菌種均是好氣性微生物，而麩皮具有支持培養(yǎng)基結構，利于通風、保持水分等作用［6］且在麩皮還含有大量微生物所需要的生物素，適量加入麩皮有利于菌體的生長繁殖，故選取發(fā)酵培養(yǎng)基中加入花生粕和麩皮兩種固態(tài)物料的量分別為90%和10%。

圖1　溫度對混合發(fā)酵過程中水解度的影響Fig.1Effects of peanut meal content on DH in the mixed fermentation process

2.1.2發(fā)酵溫度對水解度的影響

在自然pH下，培養(yǎng)基含水量為64%，固態(tài)物料中花生粕含量為90%、麩皮含量為10%，接種量為固態(tài)物料的10%，接種比例為米曲霉∶枯草芽孢桿菌＝1∶1，接種時間差為3 h，分別于22、26、30、34、38℃下發(fā)酵56 h，結果見圖2。

圖2　溫度對混合發(fā)酵過程中水解度的影響Fig.2Effects of different fermentation temperature on DH in the mixed fermentation process

由圖2可知，溫度對枯草芽孢桿菌與米曲霉混合發(fā)酵花生粕的水解度的影響比較明顯。由22℃到30℃過程中，水解度隨發(fā)酵溫度的增加而呈直線上升的趨勢，在30℃時，水解度到達最大值，30℃以后，水解度呈下降趨勢。故選取30℃為最適發(fā)酵溫度。

2.1.3不同菌種混合比例對水解度的影響

在自然pH下，培養(yǎng)基含水量為64%，固態(tài)物料中花生粕含量為90%、麩皮含量為10%，接種量為固態(tài)物料的10%，接種時間差為3h，接種比例分別為米曲霉∶枯草芽孢桿菌＝1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，于30℃下發(fā)酵56 h，結果見圖3。

由圖3可知，米曲霉∶枯草芽孢桿菌由1∶3到1∶1時，水解度呈上升趨勢。在米曲霉：枯草芽孢桿菌為1∶1時水解度達到最大值。此后，隨著枯草芽孢桿菌比例的增加，水解度呈下降趨勢，故選取兩種菌種的混合比例為1∶1。

圖3　不同菌種混合比例對混合發(fā)酵過程中水解度的影響Fig.3Effects of mixing ratio of different microbial strain on DH in the mixed fermentation process

2.1.4接種量對水解度的影響

在自然pH下，培養(yǎng)基含水量為64%，固態(tài)物料中花生粕含量為90%、麩皮含量為10%，接種比例為米曲霉∶枯草芽孢桿菌＝1∶1，接種時間差為3h，接種量為固態(tài)物料的1%、4%、7%、10%、13%、16%，于30℃下發(fā)酵56 h，結果見圖4。

圖4　接種量對混合發(fā)酵過程中水解度的影響Fig.4Effects of inoculation size on DH in the mixed fermentation process

由圖4可知，接種量為1%到7%時，水解度隨接種量增大而增大，接種量高于7%后，水解度增加平緩，且略有下降的趨勢。原因可能是隨著接種量的增大，花生粕中的營養(yǎng)物質被用于微生物的生長繁殖，而導致了水解度下降。故選取接種量為7%。

2.1.5發(fā)酵時間對水解度的影響

在自然pH下，培養(yǎng)基含水量為64%，固態(tài)物料中花生粕含量為90%、麩皮含量為10%，接種量為固態(tài)物料的7%，接種比例為米曲霉∶枯草芽孢桿菌＝1∶1，發(fā)酵溫度30℃，接種時間差為3 h，從48 h開始，每隔8 h測定發(fā)酵料的水解度，測定結果如圖5。

圖5　混合發(fā)酵過程中水解度隨時間的變化趨勢Fig.5Variation trend of DH in mixed fermentation process with time

由圖5可知，米曲霉與枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵花生粕的過程中，從發(fā)酵48 h到72 h這一階段，水解度增加顯著，水解度增大約5%。這是由于米曲霉和枯草芽孢桿菌生長繁殖，產生大量的酶，酶的活性不斷增強，進而促進花生粕中的蛋白質等大分子物質的降解，因此水解度快速升高。發(fā)酵56 h核實并確定究竟是54 h還是56 h后隨著時間的延長，水解度變化不明顯，可能是菌體的大量積累，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質已被消耗大量消耗，菌體生長進入了穩(wěn)定期，甚至衰亡期，菌體大量死亡，故分泌蛋白酶的能力下降。所以發(fā)酵的時間為72 h最適宜。

2.2正交試驗結果

為了進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，在上述單因素基礎上，選取溫度、接種比例、接種量進行正交試驗，因素水平表見表1，采用發(fā)酵料的水解度作為指標進行評價。結果見表2。

表1　因素水平表Table 1Orthogonal factor in the level of table

表2　L9（33）正交試驗表Table 2Orthogonal test result

由表2可以得出，對混合菌種發(fā)酵花生粕的水解度影響最大的因素是溫度，其次是接種量和接種比例，通過極差分析得到最優(yōu)組合為A3B3C3。為了驗證結果的準確性，根據(jù)極差分析所得的最佳工藝條件A3B3C3與正交表中水解度最大的第7號試驗A3B1C3做對比試驗，得到結果為DH（A3B3C3）=32.94%，DH（A3B1C3）=33.81%，所以第7號試驗A3B1C3是所需的最優(yōu)方案。

3結論

通過單因素實驗與正交試驗可以得出米曲霉與枯草芽孢桿菌混合固態(tài)發(fā)酵花生粕的最佳工藝條件：溫度32℃，接種比例1∶2，接種量10%，花生粕含量90%、時間72 h。此方案所得水解度為33.81%，氮溶解指數(shù)達85.65%。

［1］梅娜，周文明，胡曉玉.花生粕營養(yǎng)成分分析［J］.西北農業(yè)學報，2007，16（3）:96-99

［2］PESTIG M，BAKALLI R I，DR IVER JP，et al.Com parison of peanut meal and soybean meal as protein supplements for laying hens［J］. Poultry Science，2003，82:1274-1280

［3］COSTA E F，MILLER BR，PESTIG M，et al.Studies on feeding peanut mealasaproteinsource for broiler chickens［J］.Poultry Science，2001，80:306-313

［4］蔡國林，鄭兵兵，王剛，等.微生物發(fā)酵提高花生粕營養(yǎng)價值的初步研究［J］.中國油脂，2010，35（5）:31-34

［5］徐勤，葛向陽，劉建峰.甲醛法測大豆蛋白水解度的改進［J］.飼料工業(yè)，2008，29（5）:46-47

［6］活潑，茆軍，石玉瑚.耐熱芽孢桿菌高溫中性蛋白酶制備工藝研究［J］.生物技術，2003，13（4）:6-27

Research on Improving Nutritional Value of Peanut Meal by Solid-state Fermentation with Manifold Strains

MAO Xiao-yu，LIN Si-min，ZHANG Chun-yu，CHEN Xiao-dan，LAI Jian-ping，ZHOU Yong-qiang，ZENG Qing-zhu*
（College of Chemical Engineering，Guangzhou University，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

In the research hot pressed peanut cake was fermented with Aspergillus oryzae AS3.951 and Bacillus subtilis 1.398.The results showed that the optimal conditions were as follows：fermentation temperature，32℃；inoculation proportion，1∶2；inoculum size，10%；peanut content，90%；time，72 h.Under the optimized conditions，the DH（%）and NSI（%）reached 33.81%and 85.65%respectively.

peanut meal；solid-state fermentation；DH；manifold strains

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.024

2013-11-16

廣東省大學生創(chuàng)新實驗項目（1107812003）；第十三屆全國挑戰(zhàn)杯校級項目以及廣州市科技計劃項目（12C12011620）共同資助

毛曉宇（1991—），男（漢），本科生，研究方向：農副產品綜合利用。

曾慶祝（1965—），男，教授，博士，主要從事生物活性物質制備及功能性研究。