王麗君

（淄博職業(yè)學(xué)院，山東淄博255314）

脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成工藝優(yōu)化

王麗君

（淄博職業(yè)學(xué)院，山東淄博255314）

對(duì)脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯工藝進(jìn)行研究。以酯化率為參考指標(biāo)，考察了在有機(jī)介質(zhì)中不同脂肪酶催化合成亞麻酸枇杷甾醇酯，確定脂肪酶pseudomonas為催化劑。通過響應(yīng)面分析法確定脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯的最佳工藝，即在正己烷溶劑體系中，脂肪酶用量為7.8%，酸醇摩爾比為2.6∶1，反應(yīng)溫度為50.0℃，反應(yīng)時(shí)間為52.5 h，此時(shí)亞麻酸枇杷甾醇酯的酯化率達(dá)到79.59%。

亞麻酸枇杷甾醇酯；酶催化；合成；響應(yīng)面優(yōu)化

枇杷在我國(guó)的產(chǎn)量豐富，枇杷甾醇是其中的功能性成分，具有較好的降低血膽固醇作用［1］。然而枇杷甾醇在脂肪或水中的溶解度較差，限制了它的應(yīng)用。亞麻酸是人體必須營(yíng)養(yǎng)素之一，具有提高免疫功能、抗癌、抗糖尿病等功效，但是亞麻酸的氧化穩(wěn)定性較差［2］。枇杷甾醇與亞麻酸酯化成溶解性較好的甾醇酯，能夠在保留兩者優(yōu)良生物活性的同時(shí)，有效地解決它們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中的難題［3］。生物酶法催化合成甾醇酯的條件溫和、反應(yīng)選擇性高、能耗低、無溶劑污染，因而受到越來越多的關(guān)注。目前，已有學(xué)者利用亞麻酸與菜籽甾醇［4］、豆甾醇［5］等植物甾醇催化合成植物甾醇酯的研究，但亞麻酸枇杷甾醇酯的合成還未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)在有機(jī)介質(zhì)中，探索不同脂肪酶的催化效果，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯的合成工藝條件，以期為枇杷資源開發(fā)提供一些理論參考。

1材料及方法

1.1原料與試劑

枇杷甾醇：實(shí)驗(yàn)室提供；

亞麻酸：購(gòu)于青島諾金化工有限公司；脂肪酶Novozyme435：購(gòu)于諾維信酶制劑有限公司；脂肪酶pseudomonas：購(gòu)于丹麥Novo公司；脂肪酶AYS、脂肪酶AY-30G、脂肪酶A6：購(gòu)于日本Amano公司；脂肪酶Lipase AK：購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；

正己烷、二十六烷、乙醇、環(huán)己烷、無水乙醚、NaHCO3溶液、硅膠等：淄博職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2試驗(yàn)儀器與設(shè)備

JJ-160精密增力電動(dòng)攪拌器：天津騰博實(shí)驗(yàn)器材有限公司；GCMS-QP2010SE氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；HH-2恒溫水浴鍋：上?？砌螜C(jī)械有限公司，等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1亞麻酸枇杷甾醇酯的合成［6］

以枇杷甾醇、亞麻酸為原料，脂肪酶作催化劑，將它們?nèi)芙庥谡和橹?，加?nèi)標(biāo)二十六烷，置于連接有電動(dòng)攪拌器、溫度計(jì)、油水分離器的三口燒瓶中，水浴加熱，開啟攪拌器、恒溫控制，進(jìn)行酯交換反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，離心，取上層油狀物，冷卻，得到亞麻酸枇杷甾醇酯粗品。

1.3.2亞麻酸枇杷甾醇酯的純化［7］

亞麻酸枇杷甾醇酯粗品經(jīng)2%NaHCO3溶液和乙醇洗滌，離心，棄下層清夜，上層濾餅加入蒸餾水，除鹽，再次離心，濾餅真空干燥至恒重，加環(huán)己烷溶解，硅膠柱層析分離，流動(dòng)相為環(huán)己烷/無水乙醚，收集洗脫液，待測(cè)。

1.3.3亞麻酸枇杷甾醇酯的氣相色譜（GC）分析和酯化率計(jì)算

上述純化后的亞麻酸枇杷甾醇酯用正己烷稀釋一定倍數(shù)，進(jìn)行氣相色譜分析［8］：

色譜條件：Rxi-17型毛細(xì)管色譜柱（15m×0.25mm× 0.25 μm）；FID檢測(cè)器溫度380℃；進(jìn)樣口溫度350℃；進(jìn)樣量1.0 μL；載氣為高純度氮?dú)?；恒壓模式；分流?0∶1；H2流速30 mL/min，柱流速1.0 mL/min，尾吹氣氮?dú)?，流?0 mL/min。升溫程序：初始溫度200℃，保持2 min，以3℃/min的速度升至350℃，保持5 min。

酯化率=［1-（W2-W1）］×100%，式中：W1為反應(yīng)前體系中枇杷甾醇的含量；W2為反應(yīng)后體系中枇杷甾醇的含量。

1.3.4篩選催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的脂肪酶

參考有關(guān)文獻(xiàn)［9］，分別選取脂肪酶Novozyme435、脂肪酶pseudomonas、脂肪酶AYS、脂肪酶AY-30G、脂肪酶A6、脂肪酶LipaseAK這6種酶，在正己烷體系中，亞麻酸為1.0 mmol，枇杷甾醇為1.0 mmol，脂肪酶用量為底物混合物總量的5%，在反應(yīng)溫度為45℃，250 r/min下恒溫?cái)嚢?8 h。以酯化率為指標(biāo)，篩選出催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的脂肪酶。

1.3.5脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選取脂肪酶用量、酸醇摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間4個(gè)因素的最優(yōu)試驗(yàn)范圍，以酯化率為優(yōu)化指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法對(duì)脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

2結(jié)果與分析

2.1篩選催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的脂肪酶

分別選取肪酶Novozyme435、脂肪酶pseudomonas、脂肪酶AYS、脂肪酶AY-30G、脂肪酶A6、脂肪酶Lipase AK，按照1.3.1方法進(jìn)行亞麻酸枇杷甾醇酯的合成，不同脂肪酶對(duì)催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的酯化率影響結(jié)果如圖1所示。

圖1　脂肪酶種類對(duì)酯化率的影響Fig.1Influence of different kinds of lipase on the yield of esterification

由圖1可知，當(dāng)脂肪酶pseudomonas作為催化劑時(shí)，酯化率值較高。這是可能是由于脂肪酶pseudomonas以高催化速率水解不溶于水的長(zhǎng)鏈酯類化合物而促進(jìn)亞麻酸枇杷甾醇酯的合成，提高了酯化率。因此，選擇脂肪酶pseudomonas作為催化劑。

2.2脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成工藝的優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1脂肪酶用量對(duì)合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響

設(shè)定合成亞麻酸枇杷甾醇酯時(shí)，酸醇摩爾比為3∶1，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為24 h，分別在脂肪酶用量為2%、4%、6%、8%、10%、12%6個(gè)梯度下，按1.3.1和1.3.2合成亞麻酸枇杷甾醇酯并測(cè)其酯化率，脂肪酶用量對(duì)合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2　脂肪酶用量對(duì)酯化率的影響Fig.2Effect of enzyme amount on the yield of esterification

由圖2可以看出，當(dāng)脂肪酶用量為8%，酯化率達(dá)到最大且之后逐漸減小。因此，脂肪酶酶催化合成亞麻酸枇杷甾醇酯的最佳脂肪酶用量為8%。

2.2.2酸醇摩爾比對(duì)合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響

設(shè)定合成亞麻酸枇杷甾醇酯時(shí)，脂肪酶用量為8%，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為24 h，分別在酸醇摩爾比為1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1 6個(gè)梯度下，按1.3.1和1.3.2合成亞麻酸枇杷甾醇酯并測(cè)其酯化率，酸醇摩爾比對(duì)合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響如圖3所示。

圖3　酸醇摩爾比對(duì)酯化率的影響Fig.3Effect of molar ratio of linolenate to phytosterol on the yield of esterification

由圖3可以看出，當(dāng)酸醇摩爾比為3∶1時(shí)，酯化率達(dá)到最大。因此，選擇合成亞麻酸枇杷甾醇酯的酸醇摩爾比為3∶1。

2.2.3反應(yīng)溫度對(duì)合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響

設(shè)定合成亞麻酸枇杷甾醇酯時(shí)，脂肪酶用量為8%，酸醇摩爾比為3∶1，反應(yīng)時(shí)間為24 h，分別在反應(yīng)溫度為40、45、50、55、60、65℃6個(gè)梯度下，按1.3.1和1.3.2合成亞麻酸枇杷甾醇酯并測(cè)其酯化率，反應(yīng)溫度對(duì)合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響如圖4所示。

圖4　反應(yīng)溫度對(duì)酯化率的影響Fig.4Effect of reaction temperature on the yield of esterification

由圖4可以看出，當(dāng)反應(yīng)溫度為50℃時(shí)，亞麻酸枇杷甾醇酯合成效果較好。

2.2.4反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響

設(shè)定合成亞麻酸枇杷甾醇酯時(shí)，脂肪酶用量為8%，酸醇摩爾比為3∶1，反應(yīng)溫度為50℃，分別在反應(yīng)時(shí)間為12、24、36、48、60、72 h 6個(gè)梯度下，按1.3.1和1.3.2合成亞麻酸枇杷甾醇酯并測(cè)其酯化率，反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響如圖5所示。

由圖5可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為48 h時(shí)，亞麻酸枇杷甾醇酯合成效果較好。

圖5　反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化率的影響Fig.5Effect of reaction time on the yield of esterification

2.2.5脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的條件優(yōu)化

結(jié)合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，分別選取脂肪酶用量為6%、8%、10%，酸醇摩爾比為1∶1、3∶1、5∶1，反應(yīng)溫度為45、50、55℃，反應(yīng)時(shí)間為36、48、60 h，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工藝參數(shù)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見表1，結(jié)果見表2，回歸方程各項(xiàng)的方差分析見表3。

表1　響應(yīng)面因素水平Table 1Response surface factors level and coding

表2　脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2Test design and results of catalyzed synthesis of phytosterol linolenate esters

表3　回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 3The variance analysis of regression equation

對(duì)脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成條件進(jìn)行分析，脂肪酶用量，酸醇摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間都是顯著因素。關(guān)于亞麻酸枇杷甾醇酯的酯化率二次回歸擬合方程：

酯化率/%=77.20-2.85×A-2.57×B-2.40×C+ 5.41×D+8.57×A×B+4.46×A×C-2.52×A×D-0.66×B×C-4.43×B×D+1.61×C×D-8.09×A2-5.66×B2-3.29×C2-4.48× D2（式中：A為脂肪酶用量，B為酸醇摩爾比C為反應(yīng)溫度；D為反應(yīng)時(shí)間。）

由表3可以看出，模型的P值為＜0.000 1，而失擬項(xiàng)的P值為0.060 6，說明了脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的模型與實(shí)際情況擬合程度比較好，可以預(yù)測(cè)脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的條件。

由方差分析結(jié)果可以看出，AB的交互作用、AC的交互作用、AD的交互作用、BC的交互作用、BD的交互作用、CD的交互作用都顯著，相應(yīng)曲面圖見圖6至圖11。

根據(jù)脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的試驗(yàn)結(jié)果和回歸方程各項(xiàng)的方差分析，由響應(yīng)面分析法優(yōu)化出脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工藝條件，即脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工藝條件為脂肪酶用量為7.8%，酸醇摩爾比為2.6∶1，反應(yīng)溫度為50.0℃，反應(yīng)時(shí)間為52.5 h。

圖6　脂肪酶用量與酸醇摩爾比交互作用對(duì)酯化率影響的響應(yīng)面Fig.6Response surface of effect of enzyme amount and molar ratio of linolenate to phytosterol interaction on the yield of esterification

圖7　脂肪酶用量與反應(yīng)溫度交互作用對(duì)酯化率影響的響應(yīng)面Fig.7Response surface of effect of enzyme amount and reaction temperature interaction on the yield of esterification

圖8　脂肪酶用量與反應(yīng)時(shí)間交互作用對(duì)酯化率影響的響應(yīng)面Fig.8Response surface of effect of enzyme amount and reaction time interaction on the yield of esterification

2.2.6驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證響應(yīng)面分析法優(yōu)化出脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工藝條件的可靠性，根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化條件驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)表（表4）進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。由表4可知，試驗(yàn)5的亞麻酸枇杷甾醇酯的酯化率最高，因此脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工藝條件為脂肪酶用量為7.8%，酸醇摩爾比為2.6∶1，反應(yīng)溫度為50.0℃，反應(yīng)時(shí)間為52.5 h。

圖9　酸醇摩爾比與反應(yīng)溫度交互作用對(duì)酯化率影響的響應(yīng)面Fig.9Response surface of effect of molar ratio of linolenate to phytosterol and reaction temperature interaction on the yield of esterification

圖10　酸醇摩爾比與反應(yīng)時(shí)間交互作用對(duì)酯化率影響的響應(yīng)面Fig.10Response surface of effect of molar ratio of linolenate to phytosterol and reaction time interaction on the yield of esterification

圖11　反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間交互作用對(duì)酯化率影響的響應(yīng)面Fig.11Response surface of effect of reaction temperature and reaction time interaction on the yield of esterification

表4　響應(yīng)面優(yōu)化條件驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 4Response surface optimization condition verification test design table

3結(jié)論

響應(yīng)面優(yōu)化脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工藝條件為：脂肪酶pseudomonas為催化劑，在正己烷溶劑體系中，脂肪酶用量為7.8%，酸醇摩爾比為2.6∶1，反應(yīng)溫度為50.0℃，反應(yīng)時(shí)間為52.5 h，此時(shí)亞麻酸枇杷甾醇酯的酯化率達(dá)到79.59%。

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Optimization of Lipase Catalyzed Synthesis of Phytosterol Linolenate Esters

WANG Li-jun
（ZiBo Vocational Institute，Zibo 255314，Shandong，China）

This study mainly discussed the synthesis technology of phytosterol linolenate esters with lipase.With the yield of esterification of phytosterol linolenate esters as indicator，phytosterol linolenate esters were synthesis by using various lipases in organic media，and the lipase pseudomonas was selected for the best biocatalysts. The optimum synthesis conditions of phytosterol linolenate esters with lipase were determined by the response surface methodology，such as enzyme amount for 7.8%，molar ratio of linolenate to phytosterol for 2.6∶1，reaction temperature for 50.0℃，reaction time for 52.5 h in the n-hexane solvent systems，and the esterification of phytosterol linolenate esters reaches 79.59%.

phytosterol linolenate esters；lipase-catalyzed；synthesis；response surface optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.019

2014-11-19

王麗君（1972—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：精細(xì)化學(xué)品及化學(xué)工程。