韓建勛吳亞君王斌葛毅強陳穎*

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 北京 100176；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院；3.中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心）

實時熒光PCR法快速檢測食用淀粉中的木薯成分

韓建勛1，2吳亞君1王斌1葛毅強2，3*陳穎1*

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 北京 100176；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院；3.中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心）

基于木薯、紅薯及馬鈴薯g3pdh基因序列的差異，設(shè)計了木薯引物與探針，建立了木薯成分的實時熒光PCR檢測方法，特異性強，靈敏度達0.1%（W/W）。通過檢驗29種不同淀粉來源的市售樣品發(fā)現(xiàn)：標簽中無木薯成分的5種紅薯淀粉、2種馬鈴薯淀粉及1種藕粉均檢出了木薯成分，標簽錯誤標識率達27.6%。

淀粉；實時熒光PCR；木薯；g3pdh基因；檢測

1 前言

薯類淀粉是我國的主要食用淀粉，包括紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉等，其中紅薯淀粉價格相對較高。由于不同種類淀粉顆粒的感官性狀和物化指標差別不大，消費者難以辨認，因此一些不法生產(chǎn)者便在紅薯淀粉中摻入低價的木薯淀粉出售，賺取非法利潤，損害消費者利益。近年來，國內(nèi)外學(xué)者針對淀粉種類摻假開展了廣泛研究。根據(jù)馬鈴薯淀粉與玉米淀粉在顆粒超微形貌上的明顯差別，運用掃描電鏡與穩(wěn)定碳同位素比法能夠準確鑒別馬鈴薯淀粉中摻假的玉米淀粉［1］。有研究報道采用紅外光譜技術(shù)可有效檢測藕粉中摻雜的馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉等［2-5］。另有學(xué)者利用淀粉肽指紋圖譜區(qū)分了紅薯淀粉、木薯淀粉及馬鈴薯淀粉［6］。雖然上述方法可通過淀粉顆粒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)等來區(qū)分鑒定淀粉種類，但在實際應(yīng)用過程中易受到儀器昂貴、取樣均勻性和代表性等問題的限制。實時熒光PCR技術(shù)通過分析物種DNA水平上的差異來鑒定物種真實屬性，結(jié)果準確、可靠，且不受環(huán)境因素等影響，儀器普及率高，目前在食品真實屬性鑒別方面有著越來越廣泛的應(yīng)用，例如鑒別肉制品中的鹿肉、豬肉成分［7，8］，果汁中的水果成分［9］，燕窩中摻雜的雞蛋清、瓊脂成分［10］等，部分已制定成檢測標準并推廣應(yīng)用。本研究擬基于木薯g3pdh基因，建立快速靈敏的木薯成分實時熒光PCR檢測方法，以期為規(guī)范食用淀粉市場和打擊假冒偽劣產(chǎn)品提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1試驗樣品

木薯（M.esculenta）、紅薯（I.batatas L.）、芋頭（C.esculenta L.）、山藥（D.opposita）、馬鈴薯（S. tuberosum L）、蓮藕（N.nucifera）、玉米（Z.mays）、小麥（T.aestivum L.）、大麥（H.vulgare L.）、黑麥（S. cereale L.）、大米（O.sativa）、蕎麥（F.esculentum）、高粱（Sorghum）、薏米（C.chinensis）、小米（S.italic L.）、綠豆（V.radiata L.）、赤小豆（V.umbellata）、豇豆（V.unguiculata）、扁豆（L.purpureus L.）、菜豆（P. vulgaris L.）、蠶豆（V.faba L.）、黃豆（G.max L.）等22種原料樣品以及29份市售淀粉樣品：均購自北京大型超市。

2.1.2試劑

NaCl、Tris-HCL、三氯甲烷、異丙醇：均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；CTAB：高純級，美國Amresco公司；Na2-EDTA：生物技術(shù)級，美國Amresco公司；TaqMan?Gene Expression Master Mix：美國AB公司；food proof?GMO Sample Preparation kit：德國BIOTECON Diagnostics公司。

2.1.3引物及探針序列

植物通用型引物及探針來自文獻［11］，木薯特異性引物及探針基于木薯甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，g3pdh）自行設(shè)計。所有引物探針均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1　引物及探針序列

2.1.4主要儀器設(shè)備

微量移液器（10 μL、100 μL、1000 μL）：Eppendorf，Germany；烘箱VenticeⅡ：MMM，Germany；離心機5804R：Eppendorf，Germany；核酸蛋白分析儀DU640：Beckman，USA；ABI 7500實時熒光PCR儀：ABI，USA。

2.2方法

2.2.1自制淀粉

選取約1000 g新鮮紅薯，洗凈切塊，用勻漿機打漿，漿液與紅薯渣一并倒入白紗布袋中，清水沖洗，用2000 mL燒杯接納濾液。邊倒?jié){液邊加清水，直至將渣中的漿液洗凈為止。將濾得的紅薯漿液于4℃冰箱中靜置，每天攪動2-3次。待沉淀后，將表面的清液與殘渣去除，取中間粉漿放入另一2 000 mL燒杯中，并加入適量清水使其懸浮，再次沉淀后去除上清液。待沉淀自然晾干即得粗制紅薯淀粉。木薯淀粉制備同上。

2.2.2DNA提取

原料樣品DNA提取參照文獻中的CTAB法［12］，市售淀粉樣品DNA提取采用food proof?GMO Sample Preparation kit試劑盒提取。

2.2.3木薯引物及探針設(shè)計

選擇g3pdh基因為目標基因，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中木薯（GenBank.FN551838.1）、紅薯（GenBank. EF119215.1）、馬鈴薯（GenBank.NM_001288415.1）的g3pdh基因序列，采用Clustal W軟件進行比對，根據(jù)差異性序列區(qū)域設(shè)計木薯特異性引物及探針。

2.2.4實時熒光PCR反應(yīng)

采用25 μL的反應(yīng)體系：TaqMan?Gene Expression Master Mix 12.5μL；上下游引物（10μmol/L）各0.5 μL；探針（10 μmol/L）0.5 μL；DNA模板5 μL，用無菌水補至總體系為25 μL。PCR擴增及結(jié)果分析在ABI 7500實時熒光PCR儀上進行。擴展程序為：95℃預(yù)變性10 min；95℃10 s，60℃60 s，共運行40個循環(huán)。

2.2.5方法特異性分析

采用木薯、紅薯、芋頭、山藥、馬鈴薯、蓮藕、玉米、小麥、大麥、黑麥、大米、蕎麥、高粱、薏米、小米、綠豆、赤小豆、豇豆、扁豆、菜豆、蠶豆、黃豆共22種樣品測試方法的特異性。

2.2.6方法靈敏度分析

將自制的木薯淀粉和紅薯淀粉混合，使木薯淀粉和紅薯淀粉的質(zhì)量比分別為50%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%，進行實時熒光PCR擴增，每個濃度設(shè)置5個平行，實驗重復(fù)2次，即每個濃度得到10個對應(yīng)的Ct值，以滿足不小于95%置信區(qū)間的測試要求，計算陽性擴增的次數(shù)及檢出概率；計算Ct值的標準偏差（SD）和相對標準偏差（RSD），驗證方法的重復(fù)性。

2.2.7市售樣品檢測

對購買的2種木薯淀粉、6種紅薯淀粉、7種馬鈴薯淀粉、2種小麥淀粉、1種綠豆淀粉、1種豌豆淀粉、1種藕粉及9種玉米淀粉共29份實際樣品進行測試，每個樣品取樣2份，提取DNA后擴增18S rRNA基因以確保淀粉DNA提取的有效，避免假陰性；擴增木薯g3pdh基因判斷樣品中是否含有木薯成分。每個樣品重復(fù)擴增3次。

3 結(jié)果與分析

3.1木薯引物及探針設(shè)計結(jié)果

采用Clustal W軟件比對NCBI數(shù)據(jù)庫中木薯（GenBank.FN551838.1）、紅薯（GenBank.EF119215.1）、馬鈴薯（GenBank.NM_001288415.1）的g3pdh基因序列，根據(jù)序列差異性區(qū)域設(shè)計了木薯特異性引物及探針，序列比對及引物、探針設(shè)計結(jié)果見圖1。

圖1　木薯、紅薯與馬鈴薯g3pdh基因序列比對結(jié)果

3.2方法特異性試驗結(jié)果

利用植物通用型引物探針與木薯引物探針，分別對木薯、紅薯、芋頭、山藥、馬鈴薯、蓮藕、玉米、小麥、大麥、黑麥、大米、蕎麥、高粱、薏米、小米、綠豆、赤小豆、豇豆、扁豆、菜豆、蠶豆、黃豆22種樣品進行實時熒光PCR擴增，驗證樣品DNA的有效性以及木薯引物探針的特異性。利用18S rRNA植物通用型引物及探針擴增所有樣品，均可見典型S型熒光擴增曲線（圖2），說明所有樣品都提取到有效的DNA，可用于后續(xù)的特異性檢測。利用木薯引物探針擴增所有樣品，僅有木薯樣品產(chǎn)生顯著的熒光擴增，Ct值為26.49±0.04；而其他21種樣品以及空白對照（無菌水）均無熒光擴增信號（圖3），說明所設(shè)計的引物探針具有較好的特異性，可特異性地擴增木薯成分。

圖2　植物通用型引物探針實時熒光PCR擴增結(jié)果

圖3　木薯引物探針實時熒光PCR特異性擴增結(jié)果

3.3方法靈敏度試驗結(jié)果

分別對含50%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%（W/W）木薯淀粉的紅薯淀粉樣品進行實時熒光PCR擴增。結(jié)果表明：50%、10%、5%、1%、0.1%紅薯淀粉樣品其Ct值在28.37-35.79之間，且重復(fù)性較好，10次擴增均能檢出；0.01%紅薯淀粉樣品10次重復(fù)擴增中有8次能夠檢出，檢出率為80%（表2）。由此確定該方法的檢測靈敏度為0.1%（W/W），即：能夠檢出摻假的木薯淀粉含量為0.1 g/100 g。

表2　木薯成分實時熒光PCR靈敏度檢測結(jié)果

3.4市售樣品檢測

為進一步驗證方法的實用性及準確性，對來自北京超市的2種木薯淀粉、6種紅薯淀粉、7種馬鈴薯淀粉、2種小麥淀粉、1種綠豆淀粉、1種豌豆淀粉、1種藕粉及9種玉米淀粉等29種食用淀粉樣品進行了木薯成分檢測。檢測發(fā)現(xiàn)，除2份木薯淀粉樣品檢測到木薯成分外，6份紅薯淀粉樣品中，有5份都檢出了木薯成分，摻假率達83.3%；7份馬鈴薯淀粉樣品中2份檢出了木薯成分，檢出率為28.6%；在購買的1份藕粉樣品中也檢測到了木薯成分。小麥淀粉、綠豆淀粉、豌豆和玉米淀粉中均未檢出木薯成分（表3）。上述檢測結(jié)果表明：由于外觀較為相近，紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉是較容易被摻入木薯淀粉的產(chǎn)品，在產(chǎn)品質(zhì)量控制中應(yīng)對該類產(chǎn)品予以重點關(guān)注。

表3　市售淀粉樣品中木薯成分檢測結(jié)果

（續(xù)表3）

4 結(jié)論

本研究以木薯為研究對象，設(shè)計了基于木薯g3pdh基因的引物探針，建立了木薯成分實時熒光PCR檢測方法。該方法可有效區(qū)分木薯與其他21種淀粉植物成分，對木薯成分的檢測靈敏度達0.1%（W/W）。通過對市售的29種淀粉樣品中木薯成分的檢測，進一步驗證了方法的有效性。該方法將為打擊淀粉市場制假售假、規(guī)范市場秩序、保障消費者權(quán)益提供了有力的技術(shù)支撐。

［1］王紹清，武士奎，穆同娜，等.掃描電鏡和穩(wěn)定碳同位素比質(zhì)譜法鑒別馬鈴薯淀粉中的摻假玉米淀粉［J］.食品科學(xué)，2010，31（22）：332-335.

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［11］SN/T3729.2-2013出口食品及飲料中常見水果品種的鑒定方法第2部分：杏成分檢測實時熒光PCR法［S］.

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A Real-Time PCR Assay for Detection of Cassava Component in Edible Starch

Han Jianxun1，2，Wu Yajun1，Wang Bin1，Ge YiQiang2，3*，Chen Ying1*
（1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing，100176；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University；3.China Rural Technology Development Center）

The cassava primers and probe were designed based on the sequence differences of g3phd gene among cassava，sweet potato and potato.And a real-time PCR method was established to detect cassava component.The sensitivity of the method could reach to 0.1%（W/W）.Twenty-nine kinds of commercially samples were selected and detected.The detection result showed that cassava component was detected in 8 samples including 5 sweet potato starch，2 potato starch and 1 lotus root starch.The mislabeled rate was 27.6%.

Starch；Real-Time PCR；Cassava；g3pdh Gene；Detection

Q789

E-mail：hanjianxun19830418@163.com；*通訊作者E-mail：68511009@163.com；chenyingcaiq@163.com

中國檢科院基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（2014JK029）；863計劃項目（2011AA100807）

2015-09-11