崔　莉，李大婧，劉春泉，*，劉瑩萍

（1.江蘇省農業(yè)科學院農產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京　210014；2.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州　225127）

黃秋葵汁乳酸菌混菌發(fā)酵條件優(yōu)化

崔莉1，李大婧1，劉春泉1，*，劉瑩萍2

（1.江蘇省農業(yè)科學院農產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京210014；2.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州225127）

為制備風味優(yōu)良的乳酸發(fā)酵黃秋葵汁，研究了腸膜明串珠菌和植物乳桿菌以不同組合在發(fā)酵黃秋葵汁中的生長、產(chǎn)酸、感官品質以及揮發(fā)性風味成分。結果表明：植物乳桿菌單菌發(fā)酵黃秋葵汁可以在24 h內將pH值降到4.5以下，活菌數(shù)可達107CFU/mL。腸膜明串珠菌單菌發(fā)酵黃秋葵汁無法順利產(chǎn)酸。腸膜明串珠菌和植物乳桿菌以其菌液體積比2∶1混合發(fā)酵黃秋葵汁，可迅速將pH值降到4.5以下，活菌數(shù)可達108CFU/mL，且感官品質優(yōu)于植物乳桿菌單菌發(fā)酵。氣相色譜-質譜聯(lián)用方法分析可知，混菌發(fā)酵生成的揮發(fā)性成分比植物乳桿菌單菌發(fā)酵種類更多、含量更高。黃秋葵汁乳酸發(fā)酵最佳工藝條件為：腸膜明串珠菌和植物乳桿菌菌液以2∶1比例混合、接種量5%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時間72 h。

黃秋葵；乳酸發(fā)酵；混菌發(fā)酵；揮發(fā)性風味成分

黃秋葵（Abelmo schus esculentus （Linnaeus） Moench）別名秋葵、黃葵、羊角菜、越南芝麻、洋辣椒、補腎草、美人指等，英文名Okra，為錦葵科秋葵屬一年生草本植物，在熱帶地區(qū)可越年生長。 黃秋葵在世界各地均有栽培，以美國、印度、埃及種植居多。中國種植較多的主要有福建、江西、北京、廣東等地。

黃秋葵嫩莢果營養(yǎng)豐富，蛋白質、維生素及礦物質含量都高于一般蔬菜和水果［1］，黃秋葵果實粉［2］、水提液［3-4］、多糖［5］、黃酮［6］、花多糖［7］和種子中的生物堿［8］可提高小鼠在應激狀態(tài)下的生存能力，對運動性疲勞恢復、抗疲勞能力和免疫力提高具有促進作用。黃秋葵果實粉具有降血脂作用［9］。黃秋葵粗多糖［10-11］和黃秋葵花提取物［12］具有顯著體外抗氧化活性。美國人稱之為“植物偉哥”，日本人稱其為“綠色人參”，還被許多國家定為運動員的首選蔬菜?？梢婞S秋葵作為一種具有較高營養(yǎng)價值的新型保健蔬菜，其生產(chǎn)和加工前景廣闊，具有極大的開發(fā)潛力。

已有黃秋葵的加工工藝研究報道主要有干燥工藝［13-15］、保鮮貯藏工藝［16］、凈菜加工工藝［17］、黃秋葵酸奶制備工藝［18］、黃秋葵軟罐頭制備工藝［19］以及黃秋葵多糖［20］、籽油和籽蛋白酶解肽［21-22］果膠及不溶性纖維提?。?3-24］等。雖然上述加工工藝研究報道較多，但真正在生產(chǎn)實際中應用的較少，市場上黃秋葵主要以鮮食為主，存在加工產(chǎn)品少，水平低、綜合利用程度差等缺陷，極大地制約了其產(chǎn)業(yè)發(fā)展，亟待大力開展黃秋葵加工技術研究。

本實驗通過比較腸膜明串珠菌和植物乳桿菌以不同組合在黃秋葵汁中的生長特性、生成的揮發(fā)性風味成分以及感官品質，研究適合黃秋葵汁乳酸發(fā)酵的適宜菌種及發(fā)酵條件。為開發(fā)兼具黃秋葵和乳酸發(fā)酵的營養(yǎng)保健價值的黃秋葵果莢乳酸發(fā)酵汁產(chǎn)品提供了基礎，該產(chǎn)品消除了乳酸發(fā)酵乳制品乳糖不耐和高膽固醇，乳品過敏原等缺陷，含有豐富的維生素、微量元素、膳食纖維，且具有抗氧化功能，符合現(xiàn)代消費需求，市場前景廣闊。

1　材料與方法

1.1材料與菌株

黃秋葵：五福或南洋，當年8月采收自江蘇省農業(yè)科學院實驗田。

腸膜明串珠菌SICC1.498和植物乳桿菌SICC1.376均購自四川省微生物資源平臺菌種保藏中心，編號分別為SICC1.498和SICC1.376，所用試劑均為分析純試劑。

1.2儀器與設備

HYG-A全溫搖瓶柜中國太倉實驗設備廠；LRH-150生化培養(yǎng)箱中國上海一恒實驗設備有限公司；SW-CJ-IFD潔凈工作臺中國蘇凈集團安泰公司；電熱手提式壓力蒸汽消毒器中國上海醫(yī)用核子儀器廠；布魯克SCION SQ單四極桿氣相色譜-質譜聯(lián)用儀美國布魯克公司。

1.3方法

1.3.1生產(chǎn)工藝流程

黃秋葵果莢→清洗→燙漂→打漿→酶解→制汁→調配→殺菌→發(fā)酵→殺菌→冷卻→檢驗→成品

1.3.2黃秋葵乳酸發(fā)酵汁制備

原料加工：稱取品種為五?；蚰涎蟮男迈r黃秋葵，挑選去雜。

燙漂：取自來水，煮沸，加入黃秋葵，保持沸水燙漂1.5 min后，迅速取出，經(jīng)冷自來水中冷卻后，瀝水后，速凍，凍藏。

打漿：取燙漂后黃秋葵，以1∶4（m/V）加水，打漿。

酶解：黃秋葵汁中加入0.25 g/L纖維素酶和0.3 g/L果膠酶，55 ℃攪拌2 h，然后加熱到沸騰維持1 h，以4 000 r/min，離心10 min，過濾。

調配：在黃秋葵汁中加入8 g/100 mL蔗糖和0.2 g/100 mL檸檬酸，加熱溶解。

殺菌：高壓滅菌鍋121 ℃，殺菌15 min。

發(fā)酵種子液制備：在無菌操作臺上，用接種環(huán)挑取4 ℃斜面保存的發(fā)酵菌種腸膜明串珠菌和植物乳桿菌，分別接種于MRS液體培養(yǎng)基試管中，35 ℃條件下靜置培養(yǎng)36 h，制備一級種子液（含菌量為107～109CFU/mL）。將一級種子液分別轉接于100 mL三角瓶MRS液體培養(yǎng)基中，35 ℃條件下靜置培養(yǎng)36 h，制備二級種子液。將二級種子液分別轉接于殺菌的黃秋葵汁中，35 ℃條件下靜置培養(yǎng)72 h，制備生產(chǎn)種子液。然后，將兩種生產(chǎn)種子液（腸膜明串珠菌、植物乳桿菌）分別以體積比1∶1、1∶2和2∶1混合，接種量5%，接種于殺菌黃秋葵汁中。

黃秋葵汁發(fā)酵工藝：將已接種的黃秋葵汁，在35 ℃條件下發(fā)酵72 h。

殺菌：100 ℃熱脫氣殺菌15 min。

1.3.3感官評價

選取色澤、滋味香氣和口感作為評定對象，以黃秋葵乳酸菌發(fā)酵汁感官質量評定標準（表1）進行感官評價。參加評定的人員由12 名食品專業(yè)的科技人員組成。按照標準分別對黃秋葵乳酸菌發(fā)酵汁的各項指標進行等級評定，避免交談，并記錄評分結果。

表1　黃秋葵乳酸菌發(fā)酵汁感官質量評定標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented okra juice

1.3.4理化及微生物指標測定

揮發(fā)性風味成分的測定［25］：取5 mL左右樣品置于15 mL頂空瓶中，將老化后的75 μm Car/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，50 ℃吸附40 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。接口溫度250 ℃，離子源溫度200 ℃，燈絲電流0.08 mA，電子能量70 eV，檢測器電壓1 000 V。氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 .m），程序升溫：40 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至90 ℃，然后再以10 ℃/min升至230 ℃，以230 ℃保持7 min。

定性定量分析：掃描結果與MAINLIB、NISTDEMO、REPLIB和WILLEY 4 個譜庫對照進行成分鑒定，采用峰面積歸一化定量計算出各組分的相對含量。

總酸度測定：采用酸堿滴定法。

乳酸菌菌落總數(shù)測定：參照GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》，用MRS培養(yǎng)基代替其中的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。

2　結果與分析

2.1腸膜明串珠菌單菌發(fā)酵黃秋葵汁的理化和微生物指標

表2　由腸膜明串珠菌發(fā)酵黃秋葵汁的理化和微生物指標Table 2 Physicochemical and microbial indices of fermented okra juice by Leuconostc mesenteroides

由表2可知，在黃秋葵果莢汁中只接種腸膜明串珠菌，經(jīng)過72 h發(fā)酵后，仍無法將體系的pH值降到4.5以下，酸度僅為0.24%，表明腸膜明串珠菌單菌不適合發(fā)酵黃秋葵汁。

2.2植物乳桿菌單菌發(fā)酵黃秋葵汁的理化和微生物指標

表3　由植物乳桿菌發(fā)酵黃秋葵汁的理化和微生物指標Table 3　Physicochemical and microbial indices of fermented okra juice byby Lactobacillus plantarum rum

由表3可知，植物乳桿菌在24 h之內就能將體系的pH值降到4.5以下，表明此單一菌種可以在黃秋葵汁中順利產(chǎn)酸，生長狀況良好。

2.3混菌發(fā)酵黃秋葵汁的理化和微生物指標

表4　由腸膜明串珠菌和植物乳桿菌（22∶1，1　V/V）混合發(fā)酵黃秋葵汁的理化和微生物指標Table 4　Physicochemical and microbial indices of fermented okra juice by 2：1 （21 V/V） mixture of e of Leuconostc mesenteroides des and　and Lactobacillus plantarum arum

經(jīng)感官評定，發(fā)現(xiàn)腸膜明串珠菌和植物乳桿菌以體積比1∶1和1∶2混合后感官評價值低（數(shù)據(jù)未列出），所以選擇腸膜明串珠菌和植物乳桿菌以體積比2∶1混合進行后續(xù)實驗。由表4可知，以植物乳桿菌和腸膜明串珠菌混菌發(fā)酵黃秋葵汁，在24 h之內就能將體系的pH值降到4.5以下，表明二者混合后可以在黃秋葵汁中順利產(chǎn)酸，生長狀況良好。

2.4不同菌種發(fā)酵黃秋葵汁感官評價

經(jīng)感官評定上述兩種菌種單獨發(fā)酵制備的黃秋葵果莢汁，發(fā)現(xiàn)腸膜明串珠菌單菌發(fā)酵組有清淡的發(fā)酵泡菜香味，微酸，消費者可以接受，感官得分為76.15±3.42，達到“良”標準。植物乳桿菌單菌發(fā)酵組酸味刺激，具有強烈的酸菜味，消費者無法接受，感官得分為65.11±4.43，達到“差”標準。二者混合后制備的發(fā)酵黃秋葵汁經(jīng)感官評價，得分為82.14±1.91，達到“好”的標準。

2.5不同菌種發(fā)酵黃秋葵汁的揮發(fā)性香氣成分

表5　不同菌種發(fā)酵黃秋葵汁生成相同香氣物質分析TTaabbllee　55 　VVoollaattiillee　ccoommppoonneennttss　iinn　ffeerrmmeenntteedd　ookkrraa　jjuuiiccee　bbyy　ddiiffffeerreenntt　llaaccttiicc acid bacteerriiaa

為了驗證感官評價的結果，檢測了不同菌種發(fā)酵黃秋葵汁的香氣物質成分，將不同菌種生成相同風味成分的種類和含量結果見表5，混菌發(fā)酵黃秋葵汁生成的揮發(fā)性香氣成分種類和含量均優(yōu)于單一菌種發(fā)酵的黃秋葵汁，結合2.4節(jié)的感官評定結果可知混菌發(fā)酵黃秋葵汁的風味比單菌發(fā)酵更飽滿豐富。

3　討 論

在自然界中，微生物是多菌種共生的。在共生過程中，菌種間通過信號分子互相影響其生長特性。在上述的共生作用中，多數(shù)對人類有益，少數(shù)對人類不利。近年來，有關乳酸菌和酵母菌的共生作用研究較多，二者的共生能夠促進細菌素的生成［26］和生物膜的形成［27］。閆彬［28］發(fā)現(xiàn)，乳酸菌和酵母菌在雙菌培養(yǎng)基中有利于產(chǎn)出更多的風味物質，例如乙醛、乳酸、丁二酮、甲酸、乙酸、丙酸等。乳酸菌之間的共生作用則鮮見報道，胡春霞等［29］用卷心菜進行發(fā)酵實驗發(fā)現(xiàn)，與自然發(fā)酵相比，單菌和混菌發(fā)酵所制泡菜在色澤和風味等方面均有所提高，發(fā)酵時間也大大縮短。周彬等［30］研究了大白菜乳酸菌乳鏈球菌和植物乳桿菌混合發(fā)酵中的生長、產(chǎn)酸以及環(huán)境因子的影響，并對混菌發(fā)酵的風味物質作了分析。結果表明，混菌發(fā)酵產(chǎn)物風味物質的組成與自然發(fā)酵相似，不同于單菌發(fā)酵；混菌發(fā)酵風味物質的組成并不是兩菌單獨發(fā)酵的簡單加和，混合發(fā)酵會明顯改善發(fā)酵產(chǎn)物的風味。本實驗也從兩種乳酸菌混合發(fā)酵后的發(fā)酵性能、風味成分的種類和含量以及感官評價三方面指標佐證了上述研究結論。下一步的研究將集中于混菌發(fā)酵后風味成分的代謝途徑和信號傳遞的變化規(guī)律，進一步闡明混菌發(fā)酵優(yōu)于單菌發(fā)酵的機理。

4　結 論

腸膜明串珠菌單一菌種在黃秋葵汁中生長狀況不佳，植物乳桿菌單一菌種在黃秋葵汁中生長狀況良好，二者以體積比2∶1混合后在黃秋葵汁中生長狀況良好。二者混合后發(fā)酵黃秋葵汁生成的揮發(fā)性香氣成分較單一菌種發(fā)酵種類更多、含量更高，由感官評定結果可知混菌發(fā)酵黃秋葵汁的風味顯著優(yōu)于單菌發(fā)酵。黃秋葵汁乳酸發(fā)酵最佳工藝條件為：腸膜明串珠菌和植物乳桿菌菌液以2∶1比例混合、接種量5%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時間72 h。

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Optimization of Fermentation Conditions for Okra Juice by Two Mixed Species of Lactic Acid Bacteria

CUI Li1， LI Dajing1， LIU Chunquan1，*， LIU Yingping2
（1. Institute of Farm Product Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing210014， China；2. College of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou225127， China）

To select lactic acid bacteria stains for okra fermentation， single and mixed inoculums of two species of lactic acid bacteria （Leuconostc mesenteroides and Lactobacillus plantarum） were investigated by measuring pH， total acid，viable cell counts， volatile components and sensory evaluation of fermented okra juice. Lactobacillus plantarum when inoculated singly grew rapidly in okra juice and reached nearly 107CFU/mL and pH 4.5 after 24 h fe rmentation， whereas Leuconostc mesenteroides alone was not useful for acid production during fermentation of okra juice. Fermentation with a mixture of Leuconostc mesenteroides and Lactobacillus plantarum （2：1， V/V） fast reduced the p H to less than 4.5 （high acid） and resulted in a large number of living lactic acid bacteria （108CFU/mL）. GC-MS results showed that fermented okra juice was more conducive to producing flavor compounds through mixed-culture fermentation compared with pure-culture fermentation. Sensory evaluation results also showed that mixed-culture fermentation of okra juice was more desirable than single-strain fermentation. The best inoculum for okra juice was the 2：1 mixture （V/V） Leuconostc mesenteroides and Lactobacillus plantarum. The optimal fermentation parameters were determined as 5%， 35 ℃ and 72 h for inoculum amount，incubation temperature and fermentation duration， respectively .

okra； lactic acid fermentation； mixed bacteria fermentation； volatile components

TS201.3

A

1002-6630（2015）23-0205-04

10.7506/spkx1002-6630-201523038

2015-03-20

江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX（11）2067）

崔莉（1978—），女，助理研究員，博士，主要從事食品微生物與果蔬發(fā)酵技術研究。E-mail：sunnycuili@gmail.com

劉春泉（1959—），男，研究員，碩士，主要從事農產(chǎn)品精深加工研究。E-mail：liuchunquan2009@163.com