馬　濤，姚明月，劉延琳，2，*

（1.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌　712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌　712100）

釀酒酵母APA1的定點突變以及與增強型綠色熒光蛋白EGFP基因的共表達

馬濤1，姚明月1，劉延琳1，2，*

（1.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌712100）

應用基因突變技術向釀酒酵母APA1基因中引入同義突變，為進一步研究APA1表達量與釀酒酵母硫化氫產(chǎn)量的關系提供實驗基礎。從釀酒酵母S288c中利用聚合酶鏈式反應擴增APA1基因，與EGFP基因融合構(gòu)建表達載體。以該載體為模板，通過一步法點突變技術向APA1基因中分別引入APA1-1/2/3/4 4 個突變。測序結(jié)果表明突變位點與預期結(jié)果一致。成功獲得了APA1的4 個同義突變。一步法點突變技術是一種高效的定點突變方法。分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母YS59，熒光顯微鏡下可見綠色激發(fā)熒光，表明APA1-1/2/3/4與EGFP基因共表達。

載體構(gòu)建；釀酒酵母；同義突變

APA1基因編碼ADP硫酸化酶，催化進入酵母細胞的SO42-生成腺苷-5'-磷硫酸鹽（adenosine 5'-phosphosulfate，APS），最終經(jīng)過其他酶催化生成H2S［1］。H2S在葡萄酒中的存在被認為是一種感官上的缺陷。H2S的產(chǎn)生與硫代謝相關。硫代謝參與正常酵母細胞代謝活動，通過將無機硫轉(zhuǎn)化成有機硫滿足酵母細胞對含硫氨基酸的需求，并完成后續(xù)正常生命代謝活動。這一正常代謝伴隨著中間產(chǎn)物S2-的產(chǎn)生，即H2S的形成。H2S給葡萄酒帶來臭雞蛋、大蒜、洋蔥等不良氣味，且味覺閾值低，影響消費者的感官品嘗［2-3］。

傳統(tǒng)去除葡萄酒中H2S的方法主要是銅沉淀和惰性氣體剝離的方法，但是經(jīng)銅沉淀處理的葡萄酒需后期分離且銅離子濃度受到法定限制，惰性氣體剝離沒有特異性，影響葡萄酒正常香氣，給這些技術的應用帶來了限制［4］。因此研究H2S分子機制，認識其產(chǎn)生機理就有極大的實踐意義［5-6］。

基因定點突變技術是在基因預定的位點，進行精確地替換、插入或缺失一定長度的核苷酸片段，去研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關系。而同義突變不影響蛋白質(zhì)的序列組成，被認為不影響蛋白質(zhì)的功能。但是近年來許多文章報道同義突變影響蛋白表達量［7-11］。Bentele等［12］以大腸桿菌為材料，在起始密碼子后18 個堿基序列內(nèi)引入同義突變，并將該基因與黃色熒光蛋白連接，構(gòu)建載體表達后發(fā)現(xiàn)不同同義突變的表達量相差達60 倍之多。為了研究蛋白翻譯效率，Qian Wenfeng等［9］將黃色熒光蛋白基因插入酵母染色體上，然后分別用表達載體轉(zhuǎn)化，這些載體上攜帶發(fā)生了同義突變的紅色熒光蛋白基因，發(fā)現(xiàn)由于引入的同義突變不同，造成了黃色熒光蛋白表達量的不同。本研究通過一步法點突變技術［13-14］，向APA1基因中引入同義突變，并將其與增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）融合，通過綠色熒光蛋白的不同強度得到表達量不同的APA1基因，為進一步研究該基因表達量與H2S產(chǎn)量的關系提供參考。

1　材料與方法

1.1菌種

大腸桿菌（Escherichaa coli）DH5α生工生物工程（上海）股份有限責任公司；釀酒酵母YS59（MATa、ura3、trp1、leu2、his4）、釀酒酵母標準菌株S288c、質(zhì)粒pY16（圖譜見圖1）西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院微生物實驗室保藏；質(zhì)粒pGEFP-N1、pMD19日本TaKaRa公司。

圖1 pY16質(zhì)粒圖譜Fig.1　Plasmid profile of pY16

1.2試劑與儀器

HSTM Taq、限制性內(nèi)切酶（XbaⅠ、ClaⅠ、EcoRⅠ、DpnⅠ）、T4 DNA連接酶、SD-Ura培養(yǎng)基日本TaKaRa公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；S. c. EasyComp Transformation Kit美國Invitrogen公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

PCR擴增儀美國Bio-Rad公司；熒光顯微鏡Leica公司；電泳儀北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)美國Thermo公司。

1.3方法

1.3.1APA1基因克隆

1.3.1.1酵母菌的培養(yǎng)以及DNA提取

用YPD固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)標準菌株S288c，挑取單克隆，YPD液體培養(yǎng)2 d后，室溫、12 000×g離心2 min收集菌體，提取DNA［15-16］。

1.3.1.2引物設計

根據(jù)美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中S288c菌株的全基因組數(shù)據(jù)，用Primer 5.0設計引物擴增APA1基因，并引入酶切位點XbaⅠ和EcoRⅠ。上游引物F1：5'-GCTCTA GAATGAGTATCCCCGCTGAC-3'，下游引物R1：5'-CG GAATTCATAGTTGTATTCGTTTGG-3'。

1.3.1.3APA1基因擴增

用提取的S288c的基因組DNA為模板，擴增APA1基因。擴增條件：預變性94 ℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min。瓊脂糖凝膠電泳后，割膠回收純化目的條帶。

1.3.1.4克隆載體的連接、轉(zhuǎn)化、鑒定

將回收產(chǎn)物加A尾后與pMD19載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種到含有Amp的抗性平板上篩選。12 h后挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，挑取陽性克隆于含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基37 ℃、160 r/min培養(yǎng)。12 h后離心收集菌體，提取質(zhì)粒并送測序。命名為T-pMD19-APA1。

1.3.2EGFP基因擴增

1.3.2.1引物設計和EGFP基因擴增

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的信息，用Primer5.0設計引物擴增EGFP基因，并引入酶切位點EcoRⅠ和ClaⅠ。上游引物F2：5'-GCGAATTCGGTGGTGGTATGGTGAGCAAGGGC-3'；下游引物R2：5'-CCATCGATTTACTTGTACAGCTCGTC-3'。以質(zhì)粒pGEFP-N1為模板，擴增EGFP基因。擴增條件同1.3.1.3節(jié)。

1.3.2.2克隆載體的連接、轉(zhuǎn)化、鑒定

方法同1.3.1.4節(jié)，載體命名為T-pMD19-EGFP。

1.3.3表達載體pY16TEF1-EGFP-APA1的構(gòu)建

用XbaⅠ和EcoRⅠ、EcoRⅠ和ClaⅠ以及XbaⅠ和ClaⅠ分別酶切載體T-pMD19-APA1、T-pMD19-EGFP以及pY16，瓊脂糖凝膠電泳回收目的酶切片段，T4連接酶連接過夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種到含有Amp的抗性平板上篩選。12 h后挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，挑取陽性克隆于含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基37 ℃、160 r/min培養(yǎng)。12 h后離心收集菌體，提取質(zhì)粒酶切鑒定［17-18］，命名為pY16TEF1-EGFP-APA1。

1.3.4同義突變

以pY16TEF1-EGFP-APA1為出發(fā)載體，通過一步法，設計不同引物，引入突變位點，擴增載體，得到帶缺口的定點突變產(chǎn)物APA1-1/2/3/4，用DpnⅠ處理產(chǎn)物，然后純化后，轉(zhuǎn)化DH5α測序［19-20］。同義突變位點以及引物信息如表1所示。

表1　同義突變位點信息Table 1 Information about synonymous mutation sites

1.3.5pY16TEF1-EGFP-APA1轉(zhuǎn)化酵母細胞

提取pY16TEF1-EGFP-APA1-1/2/3/4，用S. c. EasyComp Transformation Kit完整細胞轉(zhuǎn)化法［21］，轉(zhuǎn)化釀酒酵母YS59，通過SD-Ura培養(yǎng)基，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。詳細方法參見S. c. EasyComp Transformation Kit。

1.3.6APA1基因表達鑒定

用YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)YS59轉(zhuǎn)化子，離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）懸浮菌體，熒光顯微鏡下觀察［22］。

2　結(jié)果與分析

2.1APA1基因和EGFP基因的克隆

以提取的釀酒酵母S288c基因組為模板，用引物F1和R1擴增得到預期目的片段，大小約為1 000 bp左右。以質(zhì)粒pGEFP-N1為模板，用引物F2和R2擴增得到預期基因片段，大小約為750 bp左右。擴增產(chǎn)物大小均符合預期，如圖2所示。

圖2　2 APA1APA1和EGFPEGFP基因的PCR擴增PCRFig.2　PCR amplification of APA1 and EGFP

將上述基因擴增片段分別與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR驗證后，提取質(zhì)粒，經(jīng)XbaⅠ和EcoRⅠ酶切后，得到預期載體片段和APA1基因片段。用EcoRⅠ和ClaⅠ酶切后，得到預期EGFP基因片段，如圖3所示。將測序結(jié)果與GenBank（登錄號：NM_001178695）序列進行比對，相似度100%，表明APA1基因未發(fā)生堿基突變。

圖3　克隆載體T-pMD19酶切鑒定Fig.3　Restriction enzyme digestion of recombinant cloning vector T-pMD19

2.2表達載體pY16TEF1-EGFP-APA1的構(gòu)建

用XbaⅠ和EcoRⅠ、EcoRⅠ和ClaⅠ以及XbaⅠ和ClaⅠ分別酶切載體T-pMD19-APA1、T-pMD19-EGFP以及pY16，得到酶切產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR驗證后，提取陽性克隆質(zhì)粒，用XbaⅠ和ClaⅠ酶切驗證，如圖4所示。大片段大小約為5 500 bp左右，小片段約為1 700 bp左右，與預期相符。

圖4　表達載體pY16TEFF11--EEGGFFPP-AAPPAA11的酶切鑒定Fig.4　Restriction enzyme digestion of expression vector pY16TEF1-EGFP-APA1

2.3同義突變結(jié)果

以pY16TEF1-EGFP-APA1為出發(fā)載體，通過一步法，引入同義突變位點，擴增載體，得到帶缺口的定點突變產(chǎn)物，用DpnⅠ處理產(chǎn)物，如圖5所示。

圖5　質(zhì)粒pY16TEFF11--EEGGFFPP-AAPPAA11的PPCCRR擴增Fig.5　PCR amplification of expression vector pY16TEF1-EGFP-APA1

酶切產(chǎn)物純化后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR驗證，提取陽性克隆質(zhì)粒送測序。測序結(jié)果表明成功引入同義突變，序列比對結(jié)果如圖6所示。

圖6　陽性克隆質(zhì)粒測序結(jié)果比對Fig.6　Comparison of DNA sequencing results

2.4APA1基因表達鑒定

用獲得的同義突變載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母YS59感受態(tài)，挑取陽性克隆，菌落PCR驗證后，YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集對數(shù)期細胞，熒光顯微鏡檢測。如圖7所示，鏡檢表明載體表達EGFP基因，因為該基因同目標基因APA1共表達，證明APA1基因表達。

圖7　分別位于熒光（A）和普通光（B）下的酵母細胞Fig.7　Morphological observation of YS59 under fluorescence （A） and common light （B） microscope

3　討 論

本研究基于一步法定點突變技術，該方法與QuickChangeTM以及重疊延伸法相比具有經(jīng)濟高效的特點。由于該方法的引物部分互補，使得一輪PCR后，擴增的片段可以作為下一輪反應的模板［23-24］。同時，引物部分互補，降低了引物形成二聚體的概率，因此更加高效。實驗中，每次隨機挑選4 個轉(zhuǎn)化子測序，均成功引入突變。結(jié)合實際經(jīng)驗，一步法點突變技術中，模板濃度應盡量降低，過高的模板濃度會使得DpnⅠ不能徹底降解原始序列而增加假陽性。引物中突變位點應盡量遠離引物兩端，該位點可以位于互補區(qū)，也可以位于旁側(cè)，一次可以引入兩個突變位點?？梢圆恍枰徺IQuickChangeTM試劑盒，用常規(guī)試劑就可以高效地實現(xiàn)定點突變。因此，合適的模板濃度以及徹底的DpnⅠ酶消化和合適的引物設計是該實驗成功的關鍵。

將EGFP基因與目的基因共表達，通過熒光顯微鏡觀察可以確定目的基因的表達以及表達強度，為獲得不同表達量的基因奠定了基礎。

4　結(jié) 論

測序結(jié)果與預期結(jié)果一致，成功獲得了APA1的4 個同義突變APA1-1/2/3/4。并且這些同義突變轉(zhuǎn)化酵母后，能與增強型綠色熒光蛋白共表達，為進一步不同表達量的APA1奠定了實驗基礎。一步法點突變技術是一種高效的定點突變方法。與QuickChangeTM相比，具有高效、經(jīng)濟的特點，而且可以一次引入兩個位點。

［1］THOMAS D， SURDIN-KERJAN Y. Metabolism of sulfur amino acids in Saccharomyces cerevisiae［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews， 1997， 61（4）： 503-532.

［2］馬捷， 劉延琳. 葡萄酒中重要揮發(fā)性硫化物的代謝及基因調(diào)控［J］.微生物學報， 2011， 51（1）： 14-20.

［3］劉美玲， 劉延琳. 釀酒酵母單倍體的分離及其產(chǎn)硫化氫特性［J］.食品科學， 2013， 34（21）： 136-139. doi：10.7506/spkx1002-6630-201321028.

［4］LINDERHOLM A， DIETZEL K， HIRST M， et al. Identification of MET10-932 and characterization as an allele reducing hydrogen sulfide formation in wine strains of Saccharomyces cerevisiae［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2010， 76（23）： 7699-7707.

［5］LINDERHOLM A L， FINDLETON C L， KUMAR G， et al. Identification of genes affecting hydrogen sulfide formation in Saccharomyces cerevisiae［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2008， 74（5）： 1418-1427.

［6］BARTRA E， CASADO M， CARRO D， et al. Differential expression of thiamine biosynthetic genes in yeast strains with high and low production of hydrogen sulfide during wine fermentation［J］. Journal of Applied Microbiology， 2010， 109（1）： 272-281.

［7］PLOTKIN J B， KUDLA G. Synonymous but not the same： the causes and consequences of codon bias［J］. Nature Reviews Genetics， 2011，12（1）： 32-42.

［8］KUDLA G， MURRAY A W， TOLLERVEY D， et al. Coding-sequence dete rminants of gene expression in Escherichia coli［J］. Science， 2009，324： 255-258.

［9］QIAN Wenfeng， YANG Jianrong， PEARSON N M， et al. Balanced codon usage optimizes eukaryotic translational efficiency［J］. PLoS Genetics， 2012， 8（3）： e1002603. doi： 10.1371/jo urnal.pgen.1002603.

［10］ DING Y， SHAH P， PLOTKIN J B. Weak 5'-mRNA secondary structures in short eukaryotic genes［J］. Genome Biologyand Evolution， 2012， 4（10）： 1046-1053.

［11］ TULLER T， VEKSLER-LUBLINSKY I， GAZIT N， et al. Composite effects of gene determinants on the translation speed and density of ribosomes［J］. Genome Biology， 2011， 12（11）： R110. doi：10.1186/gb-2011-12-11-r110.

［12］ BENTELE K， SAFFERT P， RAUSCHER R， et al. Efficient translation initiation dictates codon usage at gene start［J］. Molecular Systems Biology， 2013， 9： 675. doi： 10.1038/msb.2013.32.

［13］ LIU Huanting， NAISMIT H J H. An efficient one-step site-directed deletion，insertion， single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol［J］. BMC Biotechnology， 2008， 8： 91. doi：10.1186/1472-6750-8-91.

［14］ 張浩， 毛秉智. 定點突變技術的研究進展［J］. 免疫學雜志， 2009，16（4）： 108-110.

［15］ 周小玲， 沈微， 饒志明， 等. 一種快速提取真菌染色體DNA的方法［J］.微生物學通報， 2004， 31（4）： 89-92.

［16］ 吳發(fā)紅， 黃東益， 黃小龍， 等. 幾種真菌DNA提取方法的比較［J］. 中國農(nóng)學通報， 2009， 25（8）： 62-64.

［17］ 金筱耘， 趙愛春， 李軍， 等. Monellin-EGFP融合蛋白在畢赤酵母中的表達［J］. 食品科學， 2012， 33（13）： 171-175.

［18］ 季愛加， 寧喜斌. 原核表達載體pET28a-EGFP的構(gòu)建與表達［J］. 微生物學雜志， 2011， 31（4）： 69-73.

［19］李利鋒， 倪曄， 孫志浩. 利用定點突變法研究精氨酸脫亞胺酶活性的影響機制［J］. 生物工程學報， 2012， 28（4）： 508-519.

［20］ TSENG W C， LIN J W， WEI T Y， et al. A novel megaprimed and ligase-free， PCR-based， site-directed mutagenesis method［J］. Analytical Biochemistry， 2008， 375（2）： 376-378.

［21］ DANIEL GIETZ R， WOODS R A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method［J］. Methods in Enzymology， 2002， 350（1）： 87-96.

［22］ 王曉輝. 增強型綠色熒光蛋白在DH5α大腸桿菌中的表達［J］. 食品科學， 2010， 31（21）： 200-203.

［23］ DENG Q， LUO W， DONNENBERG M S. Rapid site-directed domain sca nning mutagenesis of enteropathogenic Escherichia coli espD［J］. Biological Procedures Online， 2007， 9（1）： 18-26.

［24］戴燦， 苗聰秀， 盧光琇. 基于重疊延伸PCR法的定點突變技術［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展， 2010， 10（3）： 411-412.

Site-Directed Mutagenesis of Saccharomyces cerevisiae APA1 and Co-expression with EGFP

MA Tao1， YAO Mingyue1， LIU Yanlin1，2，*
（1. College of Enology， Northwest A&F University， Yangling712100， China；2. Shaanxi Engineering Research Center for Wine and Viticulture， Yangling712100， China）

In order to further understand the relationship between the expression of APA1 and hydrogen sulfide production in Saccharomyces cerevisiae， synonymous mutations were introduced into APA1. The sequence of APA1 gene was cloned from S288c by PCR， connected with EGFP gene， and inserted into pY16 vector. The vector was used for synonymous mutations，and mutations of APA1-1/2/3/4 were obtained. According to the sequencing results， the mutations were correct. Synonymous mutations of APA1-1/2/3/4 were successfully acquired and could be used for further studies. Therefore， one-step sitedirected mutagenesis is an effective method. The fluorescence intensity of Saccharomyces cerevisiae YS59 transformed with pY16TEF1-EGFP-APA1-1/2/3/4 with fluorescence microscope confirmed that APA1 and EGFP were co-expressed.

vector construction； Saccharomyces cerevisiae； synonymous mutation

Q785

A

1002-6630（2015）23-0200-05

10.7506/spkx1002-6630-201523037

2015-01-31

國家自然科學基金面上項目（31571812）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目（重點項目）（Z109021201）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（葡萄）產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-30-jg-3）

馬濤（1989—），男，碩士研究生，研究方向為葡萄酒微生物。E-mail：matao08@163.com

劉延琳（1966—），女，教授，博士，研究方向為葡萄酒及釀酒微生物。E-mail：yanlinliu@nwsuaf.edu.cn