東　琴，魏松紅*，李平生，王海寧

（沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，遼寧 沈陽　110866）

抗莠去津抗體基因構(gòu)建及蛋白結(jié)構(gòu)模擬

東琴，魏松紅*，李平生，王海寧

（沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，遼寧 沈陽110866）

構(gòu)建抗莠去津單鏈抗體基因，采用DNAStar軟件對單鏈抗體基因進行氨基酸序列推導，用生物信息學在線網(wǎng)站預測莠去津單鏈抗體基本特性及二、三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，抗莠去津單鏈抗體基因全長744 bp，對應(yīng)248 個氨基酸，單鏈抗體相對分子質(zhì)量約為26 061.9，等電點預測值7.81，為堿性蛋白質(zhì)；二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋17 處，延伸鏈85 處，β-轉(zhuǎn)角19 處，無規(guī)卷曲127 處；三級結(jié)構(gòu)建模顯示，重鏈和輕鏈的6個環(huán)區(qū)共同組成了抗體的抗原結(jié)合區(qū)，符合單鏈抗體的結(jié)構(gòu)特點，具有抗原結(jié)合位點的空間構(gòu)象。該研究為抗莠去津單鏈抗體的進一步表達、純化和活性研究奠定了基礎(chǔ)。

莠去津；單鏈抗體；結(jié)構(gòu)預測

莠去津又名阿特拉津，是一種三氮苯類選擇性除草劑，自上世紀50年代末投入生產(chǎn)后在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用［1］。國內(nèi)外的研究表明莠去津?qū)λ鷦又参?、兩棲類生物、哺乳動物、人類細胞都有不同程度的損害作用［1-4］。莠去津在環(huán)境中的殘留不斷被檢測到，研究莠去津殘留的檢測方法顯得尤為重要。

酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作為近年來快速發(fā)展的一種檢測技術(shù)已經(jīng)開始應(yīng)用到農(nóng)藥殘留的檢測方面，具有操作簡便快速、前處理簡單、檢測周期短、成本低、檢測樣本容量大等特點［5-6］。目前已有多種農(nóng)藥的殘留檢測試劑盒研制成功［7-9］?？贵w作為免疫分析技術(shù)的核心試劑，化學農(nóng)藥抗體的制備一直是免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域應(yīng)用的瓶頸因素：抗體制備過程中的半抗原不易合成、抗體制備周期長、動物選擇要求較高，而且動物個體間的差異導致批次間穩(wěn)定性差，不易于大量制備［10］。高效率、低成本制備特異性強的抗體成為努力探索的目標之一。重組抗體尤其是噬菌體展示技術(shù)的運用，使快速獲得具有高親和性及特異性的抗體成為可能［11-12］。單鏈抗體（single-chain variable fragment，scFv）技術(shù)將抗體基因進行加工、改造和重新裝配，然后克隆到合適的表達載體中，保持了親本抗體的抗原親和活性和特異性［13-14］。因此，構(gòu)建目標抗體基因，對基因序列進行分析，并推導預測抗體的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)對于重組抗體的進一步表達和在免疫檢測中的應(yīng)用具有重要意義。

本研究以三氮苯類選擇性除草劑莠去津為研究對象，通過莠去津免疫抗原免疫Balb/C小鼠，構(gòu)建抗莠去津scFv基因［15］，并對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、二級和三級結(jié)構(gòu)進行預測［16］，為該基因進一步表達莠去津scFv及抗體分子的修飾改造奠定基礎(chǔ)，為實現(xiàn)ELISA法快速檢測莠去津提供一種獲得抗莠去津特異性抗體的新途徑。

1　材料與方法

1.1動物、材料與試劑

雌性Balb/c小鼠（6～8 周齡）遼寧長生生物技術(shù)有限公司；莠去津免疫抗原沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院農(nóng)藥學實驗室自主制備。

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑美國Sigma公司；Trizol試劑美國Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠純化試劑盒、引物、Linker生工生物工程（上海）股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、限制性內(nèi)切酶NotI、sfiI和T4DNA連接酶寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒pCANTAB-5E、大腸桿菌TG1杭州遠方生物科技有限公司；輔助噬菌體M13KO7、酶標二抗HRP/Anti-M13美國NEB公司。

1.2儀器與設(shè)備

96孔酶標板美國Corning公司；Versa Max連續(xù)波長酶標儀美國Molecular Devices公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Biofuge Stratos高性能臺式冷凍離心機德國賀利氏有限公司；PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；NanoDrop ND-1000微量分光光度計美國Thermo公司；RS-1渦旋混合器北京昊諾斯科技有限公司；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀北京六一儀器廠。

1.3方法

1.3.1引物及Linker設(shè)計合成

表1　引物序列Table 1　Primer sequenceess

表1為鼠源抗體重鏈（heavy chain，VH）及輕鏈（light chain，VL）可變區(qū)的擴增引物序列［17］，以編碼柔性肽（Gly4Ser）3的基因序列為Linker。

1.3.2動物免疫及總RNA的提取

莠去津免疫抗原［18］與弗氏完全佐劑等量混合對小鼠進行首次免疫，隨后換弗氏不完全佐劑，隔兩周加強免疫一次，共3 次，在取小鼠脾臟前3 d加強免疫一次。采用間接競爭ELISA法測定抗體效價，確定免疫效果；取免疫效果好的小鼠的脾臟，用Trizol法提取總RNA，用微量分光光度計檢測RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。

1.3.3cDNA第一鏈的合成

采用RT-PCR試劑盒，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。取0.5 μL RNA，加0.5 μL OligodT接頭引物，0.25 μL RNA酶抑制劑，1.0 μL AMV反轉(zhuǎn)錄酶，1.0 μL 10 mmol/L dNTP，1.0 μL 10×RT緩沖液，2.0 μL MgCl2，4.25 μL RNase Free ddH2O至10 μL，反應(yīng)條件：第一階段反應(yīng)溫度55 ℃，反應(yīng)時間25 min；第二階段反應(yīng)溫度95 ℃，反應(yīng)時間5 min。反應(yīng)產(chǎn)物置于冰上。

1.3.4VH和VL基因的擴增

以cDNA第一鏈為模板，分別以表1中VH和VL引物PCR擴增VH和VL基因。

VH基因片段的擴增。取cDNA第一鏈2.0 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL， dNTP（2.5 mmol/L）4.0 μL，VH1back引物（10 μmol/L）1 μL，VH1-2for引物（10 μmol/L）1 μL，加ddH2O至50 μL，渦旋混勻，短暫離心后進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為第一階段94 ℃預變性5 min；第二階段，94 ℃變性30 s；65 ℃條件下退火30 s；72 ℃條件下延伸30 s，共進行30 個循環(huán)；第三階段，72 ℃條件下修復延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行凝膠回收純化。

VL基因片段的擴增。以Vκ2back（10 μmol/L）1 μL，MJκfor（10 μmol/L）1 μL為引物，PCR反應(yīng)體系同上。PCR擴增反應(yīng)條件：第一階段：94 ℃條件下預變性5 min；第二階段：94 ℃條件下變性30 s；60 ℃條件下退火30 s；72 ℃條件下延伸30 s，共進行30 個循環(huán)；第三階段：72 ℃條件下修復延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行凝膠回收純化。

1.3.5scFv基因的拼接和擴增

將回收純化的VH、VL和Linker片段按比例混合，采用重疊延伸PCR方法拼接成scFv基因，第一次PCR反應(yīng)條件為：第一階段：94 ℃預變性5 min；第二階段：94 ℃變性1 min；63 ℃退火1 min；共進行15 個循環(huán)；第三階段：72 ℃條件下修復延伸10 min。隨后以上下游帶有酶切位點的引物（VH1backSfi I和Jκ1 Not I、Jκ2 Not I、Jκ4 Not I、Jκ5 Not I）進行二次PCR擴增，反應(yīng)條件：第一階段：94 ℃條件下預變性5 min；第二階段：94 ℃條件下變性30 s；57 ℃條件下退火45 s；72 ℃條件下延伸45 s，共進行33 個循環(huán)；第三階段：72 ℃條件下修復延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收目的片段。

1.3.6scFv基因庫的構(gòu)建及鑒定

用SfiI、Not I雙酶切單鏈抗體基因片段，酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同兩種酶切的pCANTAB5E載體連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，涂布SOBAG平板，挑選克隆，提取質(zhì)粒，進行PCR擴增鑒定，并將克隆進行測序。

1.3.7抗莠去津scFv基因結(jié)構(gòu)分析

1.3.7.1基因測序及氨基酸序列推導

挑取經(jīng)鑒定的重組克隆進行質(zhì)粒抽提并送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。根據(jù)起始密碼子“ATG”的位置，采用軟件DNAStar進行氨基酸序列推導。同時，根據(jù)Kabat法則，對抗體可變區(qū)VH、VL的骨架區(qū)（framework region，F(xiàn)R）及互補決定區(qū)（complementarity-determining region，CDR）進行劃分。

1.3.7.2編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

根據(jù)推導所得到的抗莠去津scFv氨基酸序列，采用瑞士生物信息學研究所提供的 ExPASyProteomics tools在線工具中的子程序ProtParam（http：//web.expasy.org/ protparam/）對抗體蛋白的氨基酸組成、相對分子質(zhì)量、理論等電點（isoelectric point，PI）值、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)等物理化學參數(shù)進行理論計算［19］。

1.3.7.3編碼蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)預測

根據(jù)推導所得到的抗莠去津單鏈抗體氨基酸序列，采用ExPASyProteomics tools在線工具中的子程序SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？page=npsa_sopma.html）對抗體蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測［20］，分析抗體蛋白的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無規(guī)卷曲等；將抗體蛋白提交在線工具ExPASyProteomics tools中的子程序 Swiss Model（http：//swissmodel.expasy. org/）進行三維結(jié)構(gòu)模擬［21-22］，預測莠去津scFv蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

2　結(jié)果與分析

2.1抗體可變區(qū)基因的PCR擴增

本實驗利用提取到的小鼠脾臟RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后以此cDNA第一鏈為模板，利用根據(jù)抗體VH可變區(qū)和VL可變區(qū)基因框架區(qū)的保守性而設(shè)計的鼠源通用VH引物和VL引物，經(jīng)PCR擴增，分別獲得VH、VL片段（圖1），大小分別約為350 bp和320 bp。經(jīng)PCR擴增獲得的VH和VL產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，進行重疊延伸PCR，通過Linker連接得到scFv基因片段，結(jié)果如圖2所示，scFv基因片段約為750 bp左右，且條帶清晰，與預期相符。

圖1 VH基因和VL基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR products of VH and VL

圖2 scFv基因的PCR擴增結(jié)果Fig.2 Ampli.ed fragment of scFv gene

2.2抗莠去津scFv基因結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析

2.2.1scFv基因序列測定

抗莠去津scFv基因序列全長為744 bp（圖3），其中VH片段長度為369 bp，連接肽長度為45 bp，VL片段長度為330 bp。兩端劃線部分分別為Sfi Ⅰ、NotⅠ雙酶切位點，中間劃線部分為Linker序列，其基因構(gòu)成完全符合scFv基因的組成。

圖3　3　scFvscFv的基因序列Fig.3　Gene sequence of scFv

2.2.2抗莠去津scFv基因編碼蛋白氨基酸序列推導

對抗莠去津scFv基因編碼蛋白進行氨基酸序列推導，VH與VL的氨基酸序列以及FR、CDR的劃分如圖4所示。VH含123 個氨基酸，VL含110 個氨基酸。scFv基因編碼各種氨基酸的含量如表2所示。其中含量最高的是甘氨酸和絲氨酸，分別占14.10%；其次為蘇氨酸、丙氨酸和亮氨酸，分為10.10%、7.30%和5.20%；含量最少的有天冬氨酸、半胱氨酸和組氨酸，均僅占1.60%。用在線工具IGMT/V-Quest分別對抗體基因的VH和VL進行同源性比對分析，結(jié)果表明，VH與鼠源抗體AC160473 IGHV1-74的同源率達86.06%；VL與鼠源抗體AJ231229 IGKV-4-91同源性最高，同源率達98.58%。

圖4　VH、VL的氨基酸序列Fig.4　Amino acid sequences of VH and VL

表2　抗莠去津scFv蛋白氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of scFv against atrazine

2.2.3抗莠去津scFv蛋白的性質(zhì)分析

在線分析工具ProtParam對抗莠去津scFv蛋白理化性質(zhì)的預測結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為26 061.9，分子式為C1144H1755N309O371S9，理論pI值為7.81，酸性氨基酸殘基（天冬氨酸+谷氨酸）18 個，堿性氨基酸殘基（精氨酸+亮氨酸）19 個，該蛋白質(zhì)為堿性蛋白質(zhì)；不穩(wěn)定指數(shù)為38.66，該抗體蛋白屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)［23］；脂肪指數(shù)為58.27，總平均親水性值為-0.340；在體外哺乳類網(wǎng)狀細胞的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)半衰期大于20 h，在埃希菌屬大腸桿菌體內(nèi)的半衰期大于10 h。

2.2.4抗莠去津scFv蛋白的結(jié)構(gòu)分析

在推導莠去津scFv蛋白氨基酸序列分析其同源性、FR區(qū)和CDR區(qū)及理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，對抗體蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)進行預測和分析。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測不僅是聯(lián)系其一級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的橋梁和紐帶，而且是從其一級結(jié)構(gòu)預測其三級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵步驟，有助于確定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系［24］。SOPMA軟件對該單鏈抗體的二級結(jié)構(gòu)預測（圖5）顯示，該抗體的二級結(jié)構(gòu)含α-螺旋17 處，占總二級結(jié)構(gòu)的6.85%；延伸鏈85 處，占總二級結(jié)構(gòu)的34.27%；β-轉(zhuǎn)角19 處，占總二級結(jié)構(gòu)的7.66%；無規(guī)卷曲127 處，占總二級結(jié)構(gòu)的51.21%，由此可推測，該抗體蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲和延伸鏈為主要結(jié)構(gòu)元件。用Swiss Model在線軟件預測抗莠去津scFv的三維結(jié)構(gòu)，如圖6所示，抗體的VH和VL通過Linker折疊在一起，可變區(qū)的6 個環(huán)區(qū)（CDR區(qū)）共同組成抗體的抗原結(jié)合區(qū)，該三維模擬圖符合典型scFv的結(jié)構(gòu)。

圖5　抗莠去津scFv蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析Fig.5　Secondary structure analysis of anti-atrazine scFv protein

圖6　抗莠去津scFv蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.6　Simulated 3D structure of scFv against atrazine

3　結(jié) 論

本研究從抗莠去津小鼠中成功構(gòu)建了抗莠去津scFv基因，并應(yīng)用生物信息學方法對抗莠去津scFv基因編碼的蛋白質(zhì)進行分析。結(jié)果顯示，抗莠去津scFv基因全長744 bp，其中VH為369 bp，VL為330 bp，連接肽為45 bp；抗莠去津scFv蛋白含248 個氨基酸，相對分子質(zhì)量為26 061.9，分子式為C1144H1755N309O371S9，理論pI值為7.81，為堿性蛋白質(zhì)；其二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲和延伸鏈為主要結(jié)構(gòu)元件。本研究成功構(gòu)建了抗莠去津scFv基因，并將其克隆入pCANTAB5E質(zhì)粒載體，為抗莠去津scFv基因表達、蛋白純化和活性研究等奠定了實驗基礎(chǔ)。

［1］萬年升， 顧繼東， 段舜山. 阿特拉津生態(tài)毒性與生物降解的研究［J］.環(huán)境科學學報， 2006， 26（4）： 552-560.

［2］GFRERER M， WENZL T， QUAN X， et al. Occurrence of triazines in surface and drinking water of Liaoning Province in Eastern China［J］. Journal of Biochemical Biophysical Methods， 2002， 53（1/3）： 217-228.

［3］BRUSICK D J. An assessment of the genetic toxicity of atrazine：relevance to human health and environmental effects［J］. Mutation Research， 1994， 317（2）： 133-144.

［4］PRASAD T A， REDDY D C. Atrazine toxicity on hydromineral balance of fish， Tilapia mossambicus［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety， 1994， 28（3）： 313-316.

［5］周培， 陸貽通. 農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)研究進展［J］. 環(huán)境污染與防治， 2002， 24（4）： 248-251.

［6］王兆守， 劉麗花， 邵宗澤， 等. 農(nóng)藥殘留檢測新方法研究進展［J］. 化工進展， 2008， 27（9）： 1370-1374.

［7］魏松紅， 東琴， 逄若霖， 等. 檢測莠去津殘留的間接競爭ELISA試劑盒的研制［J］. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報， 2014， 45（5）： 543-547.

［8］YANG Jinyi， WANG Hong， JIANG Yueming， et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method for carbofuran residues［J］. Molecules， 2008（13）： 871-881.

［9］魏松紅， 逄若霖， 王翀， 等. 甲拌磷殘留檢測間接競爭ELISA試劑盒的研制［J］. 食品科學， 2011， 32（4）： 284-287.

［10］ 何擴， 張秀媛， 杜欣軍， 等. 氧氟沙星單鏈抗體庫的構(gòu)建， 篩選及蛋白結(jié)構(gòu)模擬［J］. 現(xiàn)代食品科技， 2014， 30（3）： 108-113.

［11］ 潘陽， 王露楠. 噬菌體抗體庫技術(shù)的構(gòu)建及應(yīng)用研究進展［J］. 標記免疫分析與臨床， 2011， 18（3）： 207-211.

［12］ 尹惠瓊. 單鏈抗體的研究進展綜述［J］. 動物醫(yī)學進展， 2003， 24（2）：24-26.

［13］ HOLLIGER P， HUDSON P J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains［J］. Nature Biotechnology， 2005， 23（9）：1126-1136.

［14］ ALCOCER M J， DOYEN C， LEE H A， et al. Functional Scfv antibody sequences against the organophosphorus pesticide chlorpyrifos［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2000， 48（2）： 335-337.

［15］ KATO M， HANYU Y. Construction of an scFv library by enzymatic assembly of VLand VHgenes［J］. Journal of Immunological Methods，2013， 396（1/2）： 15-22.

［16］ 王弘， 劉細霞， 潘科， 等. 抗克倫特羅單鏈抗體基因構(gòu)建及蛋白結(jié)構(gòu)模擬［J］. 食品科學， 2009， 30（13）： 227-231.

［17］ 沈倍奮， 陳志南， 劉民培. 重組抗體［M］. 北京： 科學出版社， 2005：18-97.

［18］ 魏松紅， 逄若霖， 李興海， 等. 莠去津人工抗原的合成與鑒定［J］. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報， 2011， 42（1）： 102-105.

［19］ GASTEIGER E， HOOGLAND C， GATTIKER A， et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server［M］. New York：Humana Press， 2005： 571-607.

［20］ GEOURJON C， DELEAGE G. SOPMA： significant improvement in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments［J］. Computer Applications in the Bioinformatics，1995， 11（6）： 681-684.

［21］ ARNOLD K， BORDOLI L， KOPP J， et al. The SWISS-MODEL workspace： a web-based environment for protein structure homology modeling［J］. Bioinformatics， 2006， 22（2）： 195-201.

［22］ ZHOU Chun， SHEN Guanxin， ZHU Huifen， et al. Construction and analysis of three-dimensional graphic model of single-chain Fv derived from an anti-human placental acidic isoferritin monoclonal antibody by computer［J］. Journal of Tongji Medical University， 2000， 20（1）：23-25.

［23］ 郭宇立， 倪逸聲. 從一級結(jié)構(gòu)預測蛋白質(zhì)穩(wěn)定性： Guruprasad， Reedy和Pandit方法［J］. 生物化學與生物物理進展， 1993， 20（2）： 95-99.

［24］ 王志學. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測的現(xiàn)狀與展望［J］. 生命的化學， 1998，18（6）： 19-22.

Gene Construction and Protein Structure Prediction of Single-Chain Variable Fragment Antibody against Atrazine

DONG Qin， WEI Songhong*， LI Pingsheng， WANG Haining
（Plant Protection College， Shenyang Agricultural University， Shenyang110866， China）

In order to obtain the gene encoding single-chain variable fragment （scFv） antibody against atrazine， the amino acid sequence of scFv was deduced by DNAStar software and its physical and chemical properties， and secondary and tertiary structures of its encoding protein were analyzed according to bioinformatics online websites. The results showed that the full-length scFv gene had 744 bp and encoded 248 amino acids. The relative molecular weight of scFv was 26061.9， and the antibody had isoelectric point （pI） of 7.81 and belonged to alkaline and stable protein. The predicted secondary structure comprised 17 α-helices， 85 extended strands， 19 β-turns and 127 random coils. The mimic tertiary structure model of scFv indicted that all six complementarity-determining regions （CDRs） of light chain variable （VL） and heavy chain variable （VH）region contributed to the antigen-binding sites. This research can lay the foundation for further studies on the expression，purification and bioactivity of genetically engineered antibodies.

atrazine； single-chain variable fragment （scFv）； structure prediction

TS207.3

A

1002-6630（2015）23-0195-05

10.7506/spkx1002-6630-201523036

2014-12-25

遼寧省自然科學基金項目（201202195）

東琴（1990—），女，碩士研究生，主要從事農(nóng)藥毒理學研究。E-mail：qdadongqin@126.com

魏松紅（1974—），女，教授，博士，主要從事農(nóng)藥學研究。E-mail：songhongw125@163.com