徐蘭英，趙　輝，張　婷，吳　倫，龍　濤，*，李士明，*

（1.黃岡師范學(xué)院化工學(xué)院，催化材料制備及應(yīng)用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡　438000；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)　重點實驗室，天津　300134）

橘皮素的提取分離、改性及對人體肝星狀細胞LX-2的抑制作用

徐蘭英1，趙輝2，張婷1，吳倫1，龍濤1，*，李士明1，*

（1.黃岡師范學(xué)院化工學(xué)院，催化材料制備及應(yīng)用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡438000；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津300134）

通過分離純化及改性得到橘皮素和5-去甲氧基橘皮素，并研究其對人體肝星狀細胞株LX-2的抑制作用。通過無水乙醇提取、氯仿萃取從陳皮中得到多甲基黃酮混合物，再以不同濃度的乙酸乙酯和石油醚的混合液為洗脫劑，采用硅膠柱層析分離純化多甲基黃酮混合物，得到橘皮素純品。將橘皮素置于鹽酸乙醇溶液中回流，對所得產(chǎn)物進行純化即可得5-去甲氧基橘皮素，采用質(zhì)譜和核磁共振譜進行結(jié)構(gòu)確證。利用人體肝星狀細胞株LX-2細胞作為工具細胞，研究其生物活性。結(jié)果表明，5-去甲氧基橘皮素在12.5 μmol/L條件下對人肝星狀細胞株LX- 2的抑制率即可達到50%，而橘皮素需要在近150 μmol/L條件下才能達到50%的抑制率，即改性后的橘皮素對人體肝細胞的抑制有效率增加了10 倍以上。

橘皮素；5-去甲氧基橘皮素；多甲氧基黃酮；肝星狀細胞LX-2

我國是肝病大國，近年來的疾病譜變化表明，隨著生活水平的提高，除了肝炎病毒外，酒精和非健康飲食所致的肝纖維化日趨增加，嚴重威脅到人們的健康［1］。肝纖維化是包括酒精、肝炎病毒、高脂飲食、自體免疫等多種慢性肝臟炎癥性損傷的共同結(jié)局，近年來的研究證明，這些慢性炎癥刺激之所以會殊途同歸，導(dǎo)致肝纖維化，是因為它們具有共同的生物學(xué)基礎(chǔ)：激活NF-κB信號，導(dǎo)致肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化和增殖［2-3］。因此，要解決肝纖維化，必須控制HSCs增殖與活化［4-5］。

陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮，從中醫(yī)理論上來看，陳皮具有 肝升肺降功效，使機體氣機條達，血氣沖和而運行流暢。例如經(jīng)典的“陳皮二紅飲”和“丹參陳皮 膏”等都是治療氣滯血瘀型脂肪肝的良方。目前研究表明陳皮中主要活性物質(zhì)有揮發(fā)油中的萜 烯類化合物［6-7］、多羥基黃酮化合物［8-11］、多甲氧基黃酮以及羥基多甲氧基黃酮［12-19］，其中橘皮素、川陳皮素和3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮等多甲氧基黃酮是橘皮的特有成分［20-25］。

本實驗以陳皮為原料，首先通過無水乙醇提取、氯仿萃取得到多甲基黃酮混合物，再采用硅膠柱層析法，以乙酸乙酯-石油醚為淋洗液，分離純化得到橘皮素純品，并對其進行改性得到5-去甲氧基橘皮素。探討了橘皮素和5-去甲氧基橘皮素對人肝星狀細胞株LX-2的抑制作用，為陳皮膳食防治肝纖維化提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、菌株與試劑

陳皮購于黃州百聯(lián)大藥房。

人體肝星狀細胞株LX-2由北京友誼醫(yī)院白志剛教授贈送。

無水乙醇、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、濃鹽酸（分析純）、乙腈（色譜純）國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

CCA-20低溫冷卻水循環(huán)泵、SHZ-DⅢ 循環(huán)水真空泵鞏義市予 華儀器有限責任公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；LC-20型高效液相色譜（high performance liquid chromatograpy，HPLC）儀日本島津公司；5975C型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatograpymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀美國Agilent公司；Mercury 300型核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance，NMR）儀美國瓦里安公司。

1.3方法

1.3.1色譜分離條件

HPLC條件：Spelco RP-Amide液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相：乙腈-水，梯度：0～15 min，40%～55%乙腈；15～2 0 min，55%～70%乙腈；20～25 min，70%～80%乙腈；25～30 min，80%～40%乙腈；流速：1.0 mL/min； 柱溫：35 ℃；檢測波長：326 nm；進樣量：20 μL。

GC-MS條件：HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，柱流速1 mL/min，進樣口溫度280 ℃，分流比50∶1；起始溫度60 ℃，以50 ℃/min速率升溫至260 ℃，保持40 min；進樣體積1 μL，質(zhì)譜離子掃描范圍為m/z 50～550。

1.3.2核磁共振波譜條件

核磁共振氫譜頻率為300 MHz，以四甲基硅烷為內(nèi)標，采用氘代二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）作為溶劑，室溫下對橘皮素和5-去甲氧基橘皮素進行檢測。

1.3.3橘皮素的提取分離

提?。喝∫欢繜o水乙醇與陳皮粉末，用乙醇提取陳皮中的物質(zhì)，再將乙醇溶液過濾，將得到的溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸為稠狀物。

萃?。簩⒊頎钗镉眠m量的蒸餾水溶解，再加入等體積萃取劑氯仿，猛烈振蕩數(shù)分鐘，靜置24 h，取下層液，蒸干，得多甲基黃酮混合物。

裝柱：取0.4 g黃酮類化合物提取物溶于少量二氯甲烷。稱取一定量200～300 目的硅膠于燒杯中，加入適量石油醚，攪拌，以濕法裝柱，裝入4×30 層析柱中，柱高15 cm，再加入適量海沙，硅膠和海沙表面均要保持水平，待到石油醚液面到達海沙表面時，緩慢滴加黃酮粗提取物溶液。

洗脫：待該溶液完全流入石油醚后，首先用2 倍柱體積乙酸乙酯-石油醚（35∶65，V/V）溶液進行洗脫，當洗脫液面接近海砂表面時，改用乙酸乙酯-石油醚（40∶60，V/V）溶液進行洗脫，每12 mL收集，標號，依次為1、2、3、4、5……直至接完3 個柱體積洗脫液。

檢測：分別將樣品瓶中的溶液旋蒸，將得到的固體物質(zhì)用無水甲醇定容至10 mL，用HPLC進行檢測。

1.3.45-去甲氧基橘皮素的制備

取20 mg橘皮素于100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL濃鹽酸-乙醇（20∶80，V/V）溶液，加熱回流24 h后進行旋蒸，得到金黃色固體。

將上述固體用50 mL乙酸乙酯-水（1∶1，V/V）溶液溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，靜置，溶液分層。取上層溶液，加入20 mL水，振蕩分液漏斗，使溶液充分混合，靜置，取上層溶液。

將上述溶液旋蒸得到固體物，用無水乙醇溶解并定容至100 mL。

1.3.5橘皮素對人體肝星狀細胞LX-2的抑制

人體肝星狀細胞LX-2的培養(yǎng)條件為DMEM培養(yǎng)基，10%～15%的胎牛血清，青鏈霉素雙抗和1 00 nmol/L的胰島素。將分離得到的橘皮素及改性得到的5-去甲基橘皮素單體溶于DMEM完全培養(yǎng)基，濃度遞增模式（對照、0.5、1、5、10、 25、50 μmol/L）作用于96 孔板和6 孔板培養(yǎng)的LX-2細胞。

1.3.6噻唑藍（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）法檢測細胞抑制率

對于96 孔板培養(yǎng)的細胞，以MTT法檢測LX-2細胞增殖。具體方法為：1）每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT反應(yīng)，可先離心、棄去培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）小心沖洗2～3 遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。2）去掉每孔的液體（盡量手法一致，減少結(jié)晶的損失），加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；在酶標儀490 nm波長處測量各孔的光密度值，細胞抑制率計算公式如下。

2　結(jié)果與分析

2.1硅膠柱色譜分離多甲氧基黃酮

實驗發(fā)現(xiàn)第6、7號樣品均可以得到保留時間為13.3 min的物質(zhì)，并且?guī)缀踔挥袉我坏姆澹妹娣e歸一化法計算發(fā)現(xiàn)含量均大于99%。圖1為第7號樣品的HPLC圖，可以看出第7號樣品溶液中幾乎只有一種物質(zhì)峰。取該樣品進行GC-MS檢測，結(jié)果見圖2，其分子離子峰為372.0，和橘皮素一致，可以證實分離得到的物質(zhì)為橘皮素。1H-NMR 數(shù)據(jù)：1H-NMR（DMSO-d6）：δ 8.008（d，J = 9 Hz， 2H， H-2'， H-6'）、7.145（d， J = 9 Hz， 2H， H-3'，H-5'）、6.780（s， 1H， H-3）、4.025 （s， 3H， OCH3）、3.965（s， 3H， OCH3）、3.859（s， 3H， OCH3）、3.840（s，3H， OCH3）、3.780（s， 3H， OCH3）。

圖1　第7號樣品HPLC圖Fig.1　HPLC of sample 7

圖2　第7號樣品GC-MMSS圖Fig.2　GC-MS profile of sample 7

2.25-去甲基橘皮素的制備

圖3為橘皮素回流反應(yīng)24 h后的HPLC圖，從圖中可以看出，保留時間為13.3 min的橘皮素已基本消失，保留時間為20.5 min處出現(xiàn)新的色譜峰，采用面積歸一化法得其純度達99.5%。取該樣品同時進行GC-MS和1H-NMR檢測，GC-MS結(jié)果如圖4所示，其分子離子峰為358.1，和5-去甲基橘皮素一致，證實制備得到的物質(zhì)為5-去甲基橘皮素。1H-NMR數(shù)據(jù)：1H-NMR（DMSO-d6）：δ 13.028（s， 1H， 5OH）、8.350（d， J = 9 Hz， 2H， H-2'， H-6'）、7.451（d， J = 9 Hz， 2H， H3'， H5'）、7.287（s， 1H， H-3）、4.310（s， 3H， OCH3）、4.205（s，3H， OCH3）、4.153（s，3H， OCH3）、4.105（s， 3H， OCH3）。

圖3　5-去甲氧基橘皮素HPLC圖Fig.3　HPLC of 5-demethyltangeretin

圖4　5-去甲氧基橘皮素GC-MMSS圖Fig.4　GC-MS profile of 5-demethyltangeretin

2.3橘皮素及5-去甲氧基橘皮素對人體肝星狀細胞LX-2的抑制

圖5　橘皮素及5-去甲氧基橘皮素對人體肝星狀細胞LX-2的抑制率Fig.5　Inhibitory effect of tangeretin a nd 5-demethyltangeretin on human hepatic stellate cell LX-2

由圖5可知，橘皮素和5去甲基橘皮素均可以劑量梯度遞增性抑制LX-2細胞增殖，但是5-去甲基橘皮素在12.5 μmol/L條件下即可接近達到50%的抑制率，而橘皮素需要在近150 μmol/L條件下才能達到50%的抑制率。改性后的橘皮素對人體肝細胞的抑制有效率增加了10 倍以上。圖6是橘皮素和5-去甲基橘皮素在25 μmol/L條件下的細胞生長情況圖，顯微鏡下可見5-去甲基橘皮素顯著抑制了LX2細胞生長。

圖6　橘皮素（a）及5-去甲氧基橘皮素（b）在2255 μmmooll/L的濃度下對人體肝星狀細胞LX-2生長的影響Fig.6　Growth inhibition of tangeretin （a） and 5-demethyltangeretin （b）on human hepatic stellate cell LX-2

3　結(jié) 論

以藥食兩用中藥陳皮為原料，通過無水乙醇粗提，氯仿萃取純化得到多甲基黃酮混合物，用硅膠柱層析，分別以乙酸乙酯-石油醚（35∶65，V/V）溶液及乙酸乙酯-石油醚（40∶60，V/V）溶液進行梯度洗脫，得到純度大于99%的橘皮素純品。將橘皮素在濃鹽酸-乙醇（20∶80，V/V）溶液中回流反應(yīng)，得到純度大于99%的5-去甲氧基橘皮素。改性得到的5-去甲基橘皮素比橘皮素對人體肝星狀細胞株LX-2的抑制作用更強，12.5 μmol/L的5-去甲氧基橘皮素抑制率即可達到50%，而橘皮素卻需要150 μmol/L。

［1］FARRELL G C， WONG V W， CHITTURI S. NAFLD in Asiaas common and important as in the West［J］. Natural Reviews. Gastroenterology and Hepatology， 2013， 10（5）： 307-318.

［2］MANN D A， SMART D E. Transcriptional regulation of hepatic stellate cell activation［J］. Gut， 2002， 50（6）： 891-896.

［3］PRADERE J P， KLUWE J， de MINICIS S， et al. Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice［J］. Hepatology，2013， 58（4）： 1461-1473.

［4］YIN Chunyue， EVASON K J， ASAHINA K， et al. Hepatic stellate cells in liver development， regeneration， and cancer［J］. The Journal of Clinical Investigation， 2013， 123（5）： 1902-1910.

［5］TACKE F， WEISKIRCHEN R. Update on hepatic stellate cells：pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques［J］. Expert Review. Gastroenterology and Hepatology， 2012， 6（1）： 67-80.

［6］嚴寒靜， 房志堅， 黃寧， 等. 中藥陳皮揮發(fā)油的成分分析［J］. 廣東藥學(xué)， 2001，11（1）： 17-18.

［7］張志海， 王彩云， 楊天鳴， 等. 陳皮的化學(xué)成分及藥理作用研究進展［J］.西北藥學(xué)雜志， 2005， 20（1）： 47-48.

［8］信維平， 孫建華， 祁宏. 陳皮中陳皮甙的提取和應(yīng)用的研究［J］. 食品研究與開發(fā)， 2006， 27（1）： 23-24.

［9］PETERSON J J， DWYERJ T， BEECHERG R， et al. Flavanones in oranges， tangerines （mandarins）， tangors， and tan gelos： a compilation and review of the data from the analytical literature［J］. Journal of Food Composition and Analysis， 2006， 19： S66-S73.

［10］ ASSINI J M， MULVIHILL E E， HUFF M W. Citrus flavonoids and lipid metabolism［J］. Current Opinion in Lipidology， 2013， 24（1）： 34-40.

［11］ LEVAJ B， DRAGOVIC_UZELAC V， KOVACEVIC D B， et al. Determination of Flavonoids in pulp and peel of mandarin fruits［J］. Agriculturae Conspectus Scientificus， 2009， 74（3）： 221-225.

［12］ LI Shiming， LO C Y， HO C T. Hydroxylated polymethoxyflavones and methylated flavonoids in sweet orange （Citrus sinensis） peel［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 200 6， 54（12）： 4176-4185.

［13］ LI Shiming， YU Haiqing， HO C T. Nobiletin： efficient and large quantity isolation from orange peel extract［J］. Biomedical Chromatography， 2006， 20（1）： 133-138.

［14］ WANG Zhenyu， LI Shiming， FERGUSON S， et al. Validated reversed phase LC method for quantitative analysis of polymethoxyflavones in citrus peel extracts［J］. Journal of Separation Science， 2008， 31（1）： 30-37.

［15］ SUN Yinshi， WANG Jianhua， GU Shubo， et al. Simultaneous determination of flavonoids in different parts of Citrus reticulata Chachi fruit by high performance liquid chromatography-photodiode array detection［J］. Molecules. 2010， 15： 5378-5388.

［16］ LI Shiming， WANG Yu， WANG Zhengyu， et al. Quantitative analysis of hydroxylated polymethoxyflavones by high-performance liquid chromatography［J］. Biomedical Chromatography， 2010， 24（8）： 838-845.

［17］ 王華， 任廷遠， 安玉紅. 超聲波輔助乙醇提取柑橘皮渣發(fā)酵液總黃酮工藝研究［J］. 食品科學(xué)， 2009， 30（24）： 206-212.

［18］ 麻明友， 劉建本， 吳顯明， 等. 超聲微波雙輔助提取柑橘皮總黃酮的研究［J］. 食品科學(xué)， 2010， 31（20）： 266-269.

［19］ 黃明發(fā)， 蘇學(xué)素， 焦必寧， 等. 柑橘多甲氧基黃酮的檢測及分離純化技術(shù)研究進展［J］. 食品科學(xué)， 2009， 30（1）： 275-281.

［20］ 羅世坤， 王家歡， 徐蘭英， 等. 陳皮中川陳皮素的提取分離及改性［J］. 食品科學(xué)， 2014， 35（24）： 20-23. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201424004.

［21］ 邱培菊. 5-羥基多甲氧基黃酮抗結(jié)腸癌活性及其分子機制研究［D］.青島： 中國海洋大學(xué)， 2010.

［22］ LI Shiming， WANG Hong， GUO Liming， et al. Chemistry and b ioactivity of nobiletin and its metabolites［J］. Journal of Functional Foods， 2014， 6（1）： 2-10.

［23］ CHOI Y， KIM Y， HAM H， et al. Nobiletin suppresses adipogenesis by regulating the expression of adipogenic transcription factors and the activation of AMP-activated protein kinase （AMPK）［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2011， 59（24）： 12843-12849.

［24］ MIYATA Y， OSHITARI T， OKUYAMA Y， et al. Polymethoxy flavones as agents that prevent formation of cataract： nobiletin congeners show potent growth inhibitory effects in human lens epithelial cells［J］. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters， 2012，23（1）： 183-187.

［25］ ONDA K， HORIKE N， SUZUKII T， et al. Polymethoxy flavonoids tangeretin and nobiletin increase glucose uptake in murine adipocytes［J］.Phytotherapy Research， 2013， 27（2）： 312-316.

Isolation and 5-Demethylation of Tangertin from Chen-Pi and Their Inhibitory Effect on Hepatic Stellate Cell LX-2

XU Lanying1， ZHAO Hui2， ZHANG Ting1， WU Lun1， LONG Tao1，*， LI Shiming1，*
（1. Hubei Key Laboratory for Processing and Application of Catalytic Materials， College of Chemical Technology， Huanggang Normal University， Huanggang438000， China； 2. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， College of Biotechnology and Food Science， Tianjin University of Commerce， Tianjin300134， China）

An efficient and large-scale isolation method for tangeretin from Chen-Pi （aged tangerine peels） has been developed successfully. The transformation of tangeretin to 5-demethyltangeretin was performed in acidified alcohol solution with high conversion efficiency. The structures of both isolated tangeretin and 5-demethyltangeretin were confirmed by MS and1H NMR. Both compounds exhibited strong inhibitory activity against LX-2 human hepatic stellate cells， with an IC50of 150 μmol/L for tangeretin and 12.5 μmol/L for 5-demethyltangeretin， indicating the increased potency via the conversion from tangeretin to 5-demethyltangeretin.

tanger etin； 5-demethyltangeretin； polymethoxyflavones； hepatic stellate cell LX-2

O6.332

A

1002-6630（2015）23-0043-04

10.7506/spkx1002-6630-201523009

2015-06-30

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（21205046）；湖北省科技廳對外合作項目（2014BHE036）；經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室開放基金項目（2013001603）

徐蘭英（1978—），女，副教授，博士，研究方向為分離科學(xué)。E-mail：xuly@hgnu.edu.cn

龍濤（1979—），男，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：longtao@hgnu.edu.cn李士明（1963—），男，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：Shiming3702@gmail.com