李三和　陳志軍　劉凱等

摘要：以7個(gè)秈稻不育系的花藥為材料，探討了秈稻不育系花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)的條件。結(jié)果表明，材料品種對(duì)誘導(dǎo)效率的影響最為明顯；誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素濃度處理對(duì)秈稻花藥的愈傷誘導(dǎo)率的影響有顯著差異，KT濃度以1 mg/L為宜，碳源以蔗糖50 g/L相對(duì)較好，但替換成50 g/L的麥芽糖后誘導(dǎo)效率相對(duì)穩(wěn)定；取材后以8 ℃低溫預(yù)處理12 d達(dá)到最好效果。

關(guān)鍵詞：花藥培養(yǎng)；誘導(dǎo)效率；秈稻不育系

中圖分類號(hào)：S511.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）19-4868-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.056

Abstract： The effects of variety， phytohormone KT， carbon source and days of pretreatment on anther culture were studied with seven Indica rice male sterile lines. The results showed that the variety had the most obvious influence on induction efficiency and the phytohormone KT had difierent effect on the callus induction rate. The proper concentration of KT in medium for callus induction was 1.0 mg/L. Sucrose was the best carbon source with whose concentration was 50 g/L， but maltose with the same dose in medium had a stable efficiency. The best day of cold pretreatment was 12 days in 8 ℃ for most male sterile lines for anther culture.

Key words： anther culture； induction efficiency； Indica rice male sterile line

花藥培養(yǎng)是目前生物技術(shù)育種中一項(xiàng)較為成熟、實(shí)用而有效的技術(shù)，大量應(yīng)用于粳稻育種和水稻的提純復(fù)壯[1-4]，并育成了中花系列、龍粳系列的粳稻品種?；ㄋ幣囵B(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體，表現(xiàn)出雙親性狀的各種重組類型，通過自然加倍或人工處理加倍，可以在當(dāng)代獲得穩(wěn)定的純合二倍體。花藥培養(yǎng)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，可以快速純合有益基因，提高選擇效率，縮短育種周期[5，6]。但在實(shí)際操作過程中，由于受培養(yǎng)基組分、材料的差異性以及培養(yǎng)環(huán)境的影響，往往獲得的再生植株群體較小，使選擇受到較大的限制。因此，提高花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)效率，增大花培后代群體，是水稻花藥培育種成敗的關(guān)鍵。粳稻的花藥培養(yǎng)已經(jīng)相對(duì)比較成熟，但基本局限于常規(guī)粳稻的培養(yǎng)。秈稻的花培效率一直低下，秈稻不育系更低。關(guān)于如何提高花藥培養(yǎng)的效率，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者在基本培養(yǎng)基成分、激素種類和配比、低溫預(yù)處理等對(duì)培養(yǎng)效率的影響方面進(jìn)行了大量的研究[7-12]，但專門針對(duì)多種育種中間材料，尤其是秈稻不育系材料的花藥培養(yǎng)研究報(bào)道并不多見。本研究通過對(duì)不同的秈稻不育系材料、同一材料的培養(yǎng)基中不同激素濃度、不同碳源、同一碳源不同用量等條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，探討了秈稻不育系花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)階段的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 所用水稻材料均為中稻秈型不育系，具體品種如表1所示。

1.1.2 培養(yǎng)基 以N6為誘導(dǎo)培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基如表2所示，pH均為5.8。

1.2 方法

1.2.1 幼穗取材及低溫預(yù)處理 幼穗取材一般于晴天上午10點(diǎn)前或下午5點(diǎn)后進(jìn)行。選取劍葉與下一葉的葉枕距約5～10 cm的帶苞葉稻穗，此時(shí)幼穗的穎殼寬度已接近成熟時(shí)的大小，穎殼呈現(xiàn)淡綠色，雄蕊伸長(zhǎng)達(dá)到穎殼的1/3～1/2，花藥發(fā)育處于單核中晚期。將帶苞葉稻穗用濕潤(rùn)紗布包裹，裝入保鮮袋后置于冰箱中8 ℃進(jìn)行低溫預(yù)處理8～12 d。

1.2.2 花藥接種 無菌臺(tái)上剝除稻穗苞葉，選取合適的小穗剪下，用3%的次氯酸鈉溶液浸泡25 min，用無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干水后，用剪穎抖藥法將花藥接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)三角瓶約接種100個(gè)花藥。

1.2.3 不同因素對(duì)誘導(dǎo)效率的影響 7種不同基因型的材料分別設(shè)置不同KT用量、不同碳源及濃度、不同預(yù)處理時(shí)間等處理，分析培養(yǎng)基成分、預(yù)處理時(shí)間及基因型對(duì)誘導(dǎo)效率的影響。誘導(dǎo)階段均采取31 ℃黑暗培養(yǎng)。試驗(yàn)均在誘導(dǎo)培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分對(duì)誘導(dǎo)效率的影響

本試驗(yàn)中所用誘導(dǎo)培養(yǎng)基均以N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加不同濃度的KT或碳源。從表3可以看出，不同培養(yǎng)基成分對(duì)每個(gè)材料的誘導(dǎo)效率都有明顯的差別。以低溫預(yù)處理12 d為例，I3培養(yǎng)基與I2培養(yǎng)基相比，KT用量由1.5 mg/L減至1.0 mg/L，除1924外的6個(gè)材料中誘導(dǎo)效率均有所升高，有的材料升高幅度還很大，說明高濃度的KT不利于花藥培養(yǎng)愈傷組織的誘導(dǎo)。

與I1培養(yǎng)基相比，I3培養(yǎng)基增加了蔗糖的用量，由30 g/L增加到50 g/L，但從誘導(dǎo)效率上來看，7個(gè)材料除1924未用I1誘導(dǎo)外，其余6個(gè)材料有5個(gè)是I3培養(yǎng)基明顯優(yōu)于I1培養(yǎng)基，提高蔗糖的用量能增加秈稻不育系的花培誘導(dǎo)效率，用量為3%～6%。endprint

與I3培養(yǎng)基相比，I7培養(yǎng)基將碳源由蔗糖變?yōu)辂溠刻?，用量相同。?個(gè)材料的誘導(dǎo)效果來看，1440和1924效率有所提高，其余都有所降低。從表3還可看出，培養(yǎng)基使用相同含量的蔗糖時(shí)，不同的材料之間誘導(dǎo)效率會(huì)有較大的差異，但用麥芽糖作為碳源時(shí)，出愈率相對(duì)比較平穩(wěn)。

4種培養(yǎng)基中，I1、I2、I3培養(yǎng)基對(duì)不同的材料的誘導(dǎo)效率都有較大的差異，I7則表現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的出愈率，基本處于12%～24%之間。對(duì)于未知誘導(dǎo)效率的秈稻不育系材料來說，想要獲得比較穩(wěn)定的誘導(dǎo)效果，I7培養(yǎng)基是比較理想的選擇。

2.2 預(yù)處理時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)效率的影響

預(yù)處理時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)效率的影響如表4所示。以I3培養(yǎng)基為例，秈稻不育系材料預(yù)處理時(shí)間低于8 d，花培誘導(dǎo)效率都非常低，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，誘導(dǎo)效率明顯提高。本試驗(yàn)中預(yù)處理時(shí)間最長(zhǎng)達(dá)12 d，這些材料誘導(dǎo)率達(dá)到了最高值，超過12 d后，誘導(dǎo)效率反而下降。

2.3 基因型對(duì)誘導(dǎo)效率的影響

7個(gè)不同材料除1924未使用I1培養(yǎng)基外，其余都使用了I1、I2、I3、I7 4種培養(yǎng)基配方。從表3可以看出，對(duì)于使用同一種培養(yǎng)基而言，不同試驗(yàn)材料誘導(dǎo)效率有很大的差別。在1925、1926和1929 3個(gè)材料的試驗(yàn)中，4種誘導(dǎo)培養(yǎng)基都有相對(duì)較高的平均誘導(dǎo)效率，在10%以上，1926使用I3培養(yǎng)基可以達(dá)到33.93%；對(duì)1927來說，4種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率明顯偏低很多，均低于5%。每個(gè)材料不同預(yù)處理時(shí)間和不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基情況下的平均出愈率見表5。從表5也可以看出，不同材料的平均誘導(dǎo)率也存在較大差異，材料基因型對(duì)花培誘導(dǎo)效率的影響是最主要的。

3 小結(jié)與討論

秈稻花藥培養(yǎng)一直是被認(rèn)為是各種水稻類型中培養(yǎng)力最低的[13，14]，秈稻不育系的花藥培養(yǎng)則由于不育系材料受氣候的影響在某些地域會(huì)出現(xiàn)花藥發(fā)育不正常的情況更加難以成功。本研究試圖在普通秈稻材料的基礎(chǔ)上探討適合秈稻不育系花藥培養(yǎng)的合適條件，結(jié)果表明，對(duì)于不育系材料而言，增加KT用量至1.5 mg/L會(huì)降低花培誘導(dǎo)效率，這與向發(fā)云的研究結(jié)果一致[12]。有研究表明，花培誘導(dǎo)過程僅使用生長(zhǎng)素類激素2，4-D和NAA，而不使用KT[9]，能得到較好的誘導(dǎo)效果，但張艷敏等[15]的對(duì)3個(gè)粳稻的試驗(yàn)表明，花藥愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素組合中含有1 mg/L的KT。

在花藥培養(yǎng)中，蔗糖一直是最常用的碳源，同時(shí)在培養(yǎng)基中起著調(diào)節(jié)滲透壓的作用。水稻培養(yǎng)基中蔗糖濃度為一般為3%～6%，也有文獻(xiàn)報(bào)道誘導(dǎo)階段使用麥芽糖作為碳源有較好的效果[3，16]，這些與本研究的結(jié)果有差異。本研究認(rèn)為大部分秈稻不育系材料用蔗糖誘導(dǎo)效果較為理想，但使用麥芽糖作為培養(yǎng)基的碳源，對(duì)秈稻不育系有相對(duì)穩(wěn)定的誘導(dǎo)效率。研究結(jié)果表明對(duì)于秈稻常規(guī)材料，麥芽糖的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蔗糖（本文未列）。

低溫預(yù)處理對(duì)水稻花培有較大的影響，從羅瓊等[17]對(duì)偏秈材料的低溫預(yù)處理看來，9 ℃處理7～10 d有利于提高花藥愈傷組織誘導(dǎo)頻率，本研究采用8 ℃處理12 d則能達(dá)到普遍較好的誘導(dǎo)效果。

材料（即不同基因型）對(duì)愈傷誘導(dǎo)效率的影響是最重要的。本研究中1924的平均誘導(dǎo)效率不到1925的1/6，各個(gè)其他材料之間差異也很大，這是幾乎所有花培研究者公認(rèn)結(jié)果。因此，為了提高培養(yǎng)效率，建議通過基因型篩選，積累培養(yǎng)力較高的花培資源，用培養(yǎng)力較高的粳稻品種作為橋梁親本，配制優(yōu)異的組合來獲得較大量的花培苗[18]，或者通過測(cè)定分析親本及外植體的花藥培養(yǎng)力，把高培養(yǎng)力基因?qū)氲絻?yōu)良親本或雜種中，改善花藥適應(yīng)離體培養(yǎng)的遺傳背景來提高花培育種效果[19]。事實(shí)上，這些方法雖然切實(shí)可行，但由于實(shí)際育種過程中，秈稻培養(yǎng)力高的品種數(shù)量不多，秈粳交也因存在不親和性等原因，應(yīng)用起來也存在一定的困難。

參考文獻(xiàn)

[1] 葛美芬，白和盛，王保和，等.秈型雜交稻三系花培提純的技術(shù)途徑及其在生產(chǎn)上的應(yīng)用[J].雜交水稻，1989（S1）：65-68.

[2] 張家宏，張永新.應(yīng)用花培技術(shù)提純不同質(zhì)源不育系取得成效[J].雜交水稻，1995（2）：27.

[3] 張承妹，陸家安，袁 勤，等.粳稻BT型三系花藥培養(yǎng)提純復(fù)壯[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，18（3）：7-12.

[4] 馬鎮(zhèn)榮，凌定厚，王昌虎.花藥培養(yǎng)對(duì)秈稻兩用核不育系培矮64 S進(jìn)行提純與改良[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2000，8（4）：308-314.

[5] 朱旭東，曾大力，斯華敏，等.標(biāo)記兩用核不育水稻M2S的花藥培養(yǎng)及遺傳分析[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2002，16（2）：24-128.

[6] 曾千春，吳 茜，馮德江，等.轉(zhuǎn)修飾cryAc基因秈稻明恢81經(jīng)花藥培養(yǎng)獲得抗蟲DH系[J].生物工程學(xué)報(bào)，2002（4）： 442-445.

[7] 孫宗修，斯華敏，程式華.麥芽糖提高水稻花培效率的研究[J].中國(guó)水稻科學(xué)，1993，7（4）：227-231.

[8] RAINA S K，IRFAN S T.High frequency embryogenesis and plantlet regeneration from isolated microspores of rice[J]. Plant Cell Reports，1998，17：957-962.

[9] GABRIELA TREJO-TAPIA， URIEL M A，GUADALUPE S M. The effects of cold –pretreatment， auxins and carbon source on anther culture of rice[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，2002，71：41-46.

[10] 馮雙華，趙 森，郭家源，等.不同培養(yǎng)基和激素對(duì)超級(jí)雜交稻花藥培養(yǎng)力的影響[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，28（4）：523-525，565.

[11] 王伍梅，臺(tái)德衛(wèi)，張效忠，等.水稻高效花藥培養(yǎng)技術(shù)體系的構(gòu)建[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（16）：65-68.

[12] 向發(fā)云，宋志紅，吳金平，等.秈稻材料特性和激素配比對(duì)花藥培養(yǎng)效率的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，47（12）：1380-1384.

[13] 沈錦驊，李梅芳，陳銀全，等.花藥培養(yǎng)在水稻品種改良上的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1982（2）：15-19.

[14] 趙成章.水稻試管苗正?；{(diào)控技術(shù)的研究[M].北京：北京工業(yè)大學(xué)出版杜，1990.

[15] 張艷敏，高潤(rùn)紅，郭桂梅，等.不同優(yōu)質(zhì)粳稻花藥對(duì)低溫和激素處理的培養(yǎng)響應(yīng)[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27（2）：121-124.

[16] 馮雙華，侯海軍，廖江林，等.不同因素對(duì)水稻溫敏核不育系香125S花藥培養(yǎng)的影響[J].農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究，2007，28（3）：358-360.

[17] 羅 瓊，曾千春，周開達(dá)，等.水稻花藥培養(yǎng)及其在育種中的應(yīng)用[J].雜交水稻，2000，15（3）：1-2.

[18] 葛勝娟.水稻花藥培養(yǎng)及其在遺傳育種上的應(yīng)用[J].種子，2013，32（8）：45-50

[19] 遲 銘，方兆偉，李 健，等.花藥培養(yǎng)在水稻育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：111-113.endprint