韓文杰，蔡榮華，童玉海

（晨光生物科技集團(tuán)莎車有限公司，新疆喀什844400）

辣椒油樹脂中羅丹明B檢測(cè)方法對(duì)比研究

韓文杰，蔡榮華*，童玉海

（晨光生物科技集團(tuán)莎車有限公司，新疆喀什844400）

對(duì)辣椒油樹脂中羅丹明B的兩種常見檢測(cè)方法高效液相色譜-熒光檢測(cè)法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行了對(duì)比研究，就兩種檢測(cè)方法的線性、精密度、回收率、穩(wěn)定性、適用性等方面進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明：兩種檢測(cè)方法精密度和準(zhǔn)確度都很高，均能準(zhǔn)確定量。但是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法檢測(cè)方法簡單快捷，適合快速測(cè)定樣品中羅丹明B的含量，但是檢測(cè)費(fèi)用較高，對(duì)儀器和人員的要求水平也比較高，很難在中小企業(yè)普及；而高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法費(fèi)用一般，檢測(cè)方法穩(wěn)定，針對(duì)性強(qiáng)，檢測(cè)信號(hào)干擾較少，結(jié)果相對(duì)更準(zhǔn)確，為中小企業(yè)和食品監(jiān)督檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)提供一種簡單易行的方法。所以高效液相色譜-熒光檢測(cè)法檢測(cè)成本較低，更適用于企業(yè)生產(chǎn)中的規(guī)?；瘷z測(cè)；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法適用于特殊情況下的快速定性定量檢測(cè)。

辣椒油樹脂；羅丹明B；檢測(cè)方法；對(duì)比研究

辣椒油樹脂（capsicum oleoresin）是從辣椒中提取、濃縮而得到的一種油狀液體，是辣椒素和辣椒紅色素提取過程中的重要中間產(chǎn)物。辣椒油樹脂除了含有辣椒的辛辣成分（Capsaicinoids）外，還含有辣椒醇、蛋白、果膠、多糖、辣椒色素等不少于100余種其他的化學(xué)物質(zhì)［1］。辣椒油樹脂主要用在調(diào)味品、醫(yī)療、生化農(nóng)藥、軍事等方面，其價(jià)值日漸被人們所重視。

羅丹明B（Rhodamine B），又名玫瑰紅B、堿性玫瑰精、蕊香紅B，俗稱花粉紅。是一種人工合成堿性熒光染料，由堿羥基二乙基苯胺與鄰苯二甲酐縮合制的，分子式C28H31CLN2O3；分子量479.017 5；常溫下為綠色結(jié)晶或紅紫色粉末，幾乎無異味；水溶液為藍(lán)紅色，稀釋后有強(qiáng)烈熒光，主要用于造紙、制漆、紡織等的工業(yè)染色。由于羅丹明B具有價(jià)格低廉、色澤紅艷、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，常被不法商家用作替代食品添加劑的著色劑，給人們的飲食安全帶來極大隱患［2］。故采用合理的方法，檢測(cè)天然辣椒油樹脂中羅丹明B的方法，尤為重要。

現(xiàn)辣椒油樹脂中羅丹明B的檢測(cè)方法較多，主要有高效液相色譜-熒光檢測(cè)法［3-9］、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法等［10-13］。關(guān)于此類檢測(cè)方法已多有報(bào)道，但對(duì)其進(jìn)行對(duì)比研究的文獻(xiàn)較少，對(duì)適于不同實(shí)驗(yàn)條件下的相關(guān)闡述也不多。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局對(duì)食品中羅丹明B的檢測(cè)［14］提供了高效液相色譜（配熒光檢測(cè)器）法、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法兩種檢測(cè)方法，本論文就兩種檢測(cè)方法的線性、精密度、回收率、穩(wěn)定性、適用性等方面進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，目的是為建立辣椒油樹脂中羅丹明B的多種檢測(cè)方法體系，尋找最合適的辣椒油樹脂中羅丹明B的檢測(cè)方法。

1材料與方法

1.1試劑與材料

實(shí)驗(yàn)用原料：辣椒油樹脂，晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司提供。

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品：潤生科研試劑；甲醇（色譜級(jí)）、乙酸乙酯（分析純）、環(huán)己烷（安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑有限公司，分析純）。

1.2儀器設(shè)備

凝膠滲透色譜儀（GPC）：WATERS公司；高效液相色譜儀（HPLC）配熒光檢測(cè)器：安捷倫科技公司；分析天平（精確到0.000 1 g）：日本島津公司；三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Waters公司；超純水儀：上海和泰儀器有限公司；XW-80A漩渦混合器：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；HS3120超聲波清洗儀：天津恒奧科技發(fā)展有限公司；H-2050R超高速冷凍離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)有限公司。

1.3色譜條件

1.3.1高效液相色譜-熒光檢測(cè)法色譜條件

色譜柱：ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m）；熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長：550 nm；發(fā)射波長：580 nm；流動(dòng)相：乙腈∶水=50∶50，每1 L流動(dòng)相加入0.77 g乙酸銨；流速：1.0 mL/min；柱溫箱溫度：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的色譜條件

1）儀器條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子掃描（ESI+）；檢測(cè)模式：MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：1.0 kV；萃取錐孔電壓：3.0 V；RF透鏡電壓：0.0 V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：420℃；脫溶劑氣流量：700 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h。

2）檢測(cè)條件：色譜柱：C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2%甲酸，流速：0.2 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4標(biāo)樣的制備

將購買100 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品1 mL完全溶解到100 mL容量瓶中，加入色譜純甲醇定容，搖勻使之完全溶解，制作成濃度為1 mg/kg儲(chǔ)備液。

每次檢測(cè)時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋至5 μg/kg，進(jìn)樣后根據(jù)標(biāo)樣峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

1.5樣品的制備

將2批辣椒油樹脂加標(biāo)樣品（A和B，辣椒素含量約50%，羅丹明B加標(biāo)量分別為70 μg/kg和22 μg/kg）分別用植物油稀釋至辣椒素含量1.0%、3.0%和5.0%水平，共6個(gè)樣品。

1）高效液相色譜-熒光檢測(cè)法的前處理：精確稱取1.00 g樣品于10 mL容量瓶中，加入GPC流動(dòng)相（環(huán)己烷∶乙酸乙酯=1∶1）定容，超聲溶解，混合均勻。用一次性注射器吸取，過0.45 μm濾膜到小玻璃管中，不少于6 mL。將裝有樣品的小管放在GPC樣品架上，過GPC，收集于100 mL小燒瓶中。將小燒瓶在旋蒸上，于50℃濃縮近干。在小燒瓶內(nèi)加入1 mL色譜甲醇定容，超聲溶解，待測(cè)。

2）高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法的前處理：準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品于50 mL具塞離心管中，一式兩份，各加10mL甲醇。旋渦均質(zhì)2min，然后超聲提取10min；之后在5℃下以10 000 r/min離心5 min，取上層清液約1 mL，過0.22 μm的有機(jī)濾膜裝入2 mL的進(jìn)樣小瓶中，待檢測(cè)。

1.6計(jì)算公式

用數(shù)據(jù)處理軟件中的外標(biāo)法，或繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按公式計(jì)算試樣中羅丹明B的含量。

式中：X為試樣中羅丹明B的含量，（μg/kg）；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣液中羅丹明B的濃度，（μg/mL）；c0為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的空白實(shí)驗(yàn)中羅丹明B的濃度，（μg/mL）；v為樣液最終定容體積，mL；m為最終樣液所代表的試樣質(zhì)量，g。

2結(jié)果與討論

2.1色譜圖

2.2線性關(guān)系

圖1　標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用高效液相色譜-熒光檢測(cè)（上）和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)（下）圖譜Fig.1HPLC-Fluorescence detecting（up）HPLC-tandem mass spectrometry（down）

按照1.3的色譜條件，將1.4所配的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用兩種檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積對(duì)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得到兩種檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。高效液相色譜-熒光檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=51 362.7X+103.3，r=0.999 9，在0.1 μg/kg～300 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y= 67 911.4X+1 052.2，r=0.999 2，在0.1 μg/kg～10 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果表明高效液相色譜-熒光檢測(cè)較高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜有相對(duì)寬的線性范圍。

2.3精密度實(shí)驗(yàn)

取同一辣椒油樹脂樣品，分別用兩種檢測(cè)方法各平行檢測(cè)5次，分別計(jì)算羅丹明B的含量，如表1所示，兩種檢測(cè)方法的RSD均小于10%，因此兩種檢測(cè)方法都滿足檢測(cè)需求。

表1　精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 1The precision experimental results（n=5）

2.4加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

將理論值為3.0、5.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/kg羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)液分別加入到樣品中，按照1.3和1.5的檢測(cè)方法檢測(cè)，分別計(jì)算兩種檢測(cè)方法的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。

兩種檢測(cè)方法的加標(biāo)回收率都在99.89%～114.81%之間，表明兩種檢測(cè)檢測(cè)辣椒油樹脂中羅丹明B的準(zhǔn)確度都比較高，均可準(zhǔn)確定量檢測(cè)辣椒油樹脂中羅丹明B的含量。

表2　加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)表Table 2Standard addition recovery data table

2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批辣椒油樹脂樣品，每天按照1.5方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，分別使用兩種方法檢測(cè)樣品中羅丹明B含量，連續(xù)測(cè)定10 d，分別計(jì)算前3日、5日和10日內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果的日間RSD，結(jié)果見表3。

表3　穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3The stable experimental results

在前5日內(nèi)，兩種檢測(cè)方法在3日內(nèi)的日間精密度都＜5%，但高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法在5內(nèi)日和10日內(nèi)日間精密度明顯變大，高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法基本保持不變。表明兩種方法雖然都能滿足檢測(cè)要求，但明顯的高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法相對(duì)更穩(wěn)定，分析原因高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法的前處理使用凝膠色譜儀進(jìn)行雜質(zhì)的去除，對(duì)檢測(cè)信號(hào)干擾比較小，檢測(cè)的數(shù)值比較準(zhǔn)確，而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法前處理沒有除雜，直接將樣品稀釋進(jìn)行檢測(cè)，雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾比較大，造成檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。

2.6樣品檢測(cè)對(duì)比

取5批不同的辣椒油樹脂樣品，按照1.5的處理過程，同時(shí)采取兩種方法檢測(cè)，結(jié)果顯示樣品中羅丹明B的含量基本一致。從整體檢測(cè)時(shí)間來看，高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法前處理因要使用GPC凈化，需要1 h，濃縮需要0.5 h，且樣品在液相色譜-熒光檢測(cè)出峰時(shí)間為5 min左右，檢測(cè)過程較長，而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)前處理時(shí)間需要20 min左右，在質(zhì)譜上出峰時(shí)間1.5 min左右，簡單快捷。從檢測(cè)準(zhǔn)確性來比較，高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，不需要做平行樣，而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法每次需要做平行樣，監(jiān)控檢測(cè)的穩(wěn)定性。從檢測(cè)成本對(duì)比，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法對(duì)儀器和檢測(cè)人員的要求都比較高，特別是質(zhì)譜檢測(cè)儀成本較高，中小企業(yè)難以普及，而液相色譜儀廣大中小企業(yè)都有，便于食品質(zhì)量的控制，做好食品安全的保護(hù)工作。

3結(jié)論

1）通過對(duì)兩種檢測(cè)方法的對(duì)比研究，高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法對(duì)于辣椒油樹脂中羅丹明B的含量檢測(cè)準(zhǔn)確度和精密度相當(dāng)，均能準(zhǔn)確定量。

2）高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法比高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法穩(wěn)定，針對(duì)性強(qiáng)，檢測(cè)信號(hào)干擾較少，結(jié)果相對(duì)更準(zhǔn)確。

3）高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法檢測(cè)方法簡單快捷，適合快速測(cè)定樣品中羅丹明B的含量，但是檢測(cè)費(fèi)用較高，對(duì)儀器和人員的要求水平也比較高，很難在中小企業(yè)普及，而高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法費(fèi)用一般，檢測(cè)準(zhǔn)確，為中小企業(yè)和食品監(jiān)督檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)提供一種簡單易行的方法。

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The Comparative Study of Rhodamine B Detection Method in Capsicum Oleoresin

HAN Wen-jie，CAI Rong-hua*，TONG Yu-hai
（Chenguang Biotech Group Shache Co，Ltd，Kashi 844400，Xinjiang，China）

In this paper，two common method namely high performance liquid chromatography（HPLC）with fluorescence method and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry of rhodamine B in Capsicum Oleoresin has carried on the comparative study，Comparing on linear，precision，recovery，stability，serviceability etc in the compared test of two detection methods.The results show：two detecting methods have a same high degree of precision and accuracy and can accurately quantify.However，HPLC-tandem mass spectrometry method is simple and quick that for the rapid determination of rhodamine B sample，but this method need the high cost of testing and equipment and personnel requirements is relatively high，so it is difficult to spread in the SME；The cost of HPLC-fluorescence detection method is in general and the method is stable，targeted and has the less signal interference，so relativly it has more accurate results，to provide a simple way for small and medium enterprises and food supervision and inspection agencies.So HPLC-fluorescence detection need lower testing costs，and is more suitable for the large-scale testing of the production；HPLC-tandem mass spectrometry is for rapid qualitative and quantitative determination in the special circumstances.

capsicum oleoresin；rhodamine B；detection method；comparative study

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.027

2014-03-03

韓文杰（1968—），男（漢），工程師，本科，研究方向：天然產(chǎn)物提取分離技術(shù)的研究。

蔡榮華（1985—），女（漢），助理工程師，本科，研究方向：天然植物提取研究與開發(fā)。